Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na biển (Annona glabra L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.)

Chuyên ngành: Hoá học hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm

2. TS. Hoàng Lê Tuấn Anh

HÀ NỘI - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng

dẫn khoa học của PGS.TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn Anh. Các số

liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công

trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được

nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn

bè và gia đình.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS.

TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn Anh - những người Thầy đã tận tâm

hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi

trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán

bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, TS. Bùi Hữu Tài, TS. Phạm Hải Yến và ThS. Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia

Chungnam, Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính gây độc tế bào và

hoạt tính kháng viêm.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và đồng nghiệp của tôi tại Bộ môn Hóa học - Khoa Đại học Đại cương, tới Phòng Tổ chức Cán bộ và Ban Giám hiệu Trường đại học Mỏ - Địa chất đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. viii

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... x

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. xii

DANH MỤC PHỤ LỤC ........................................................................................... xv

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA) ................................................................ 3

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona) ..................................................... 3

1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona ............................. 3

1.1.2.1. Các hợp chất diterpenoid ent-kaurane ................................................ 4

1.1.2.2. Các hợp chất acetogenin ..................................................................... 7

1.1.2.3. Các hợp chất alkaloid ........................................................................ 19

1.1.2.4. Các hợp chất amide ........................................................................... 23

1.1.2.5. Các hợp chất peptide vòng ................................................................ 24

1.1.2.6. Các hợp chất khác ............................................................................. 25

1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Annona .............................. 27

1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ................................................................... 27

1.1.3.2. Hoạt tính kháng viêm ........................................................................ 30

1.1.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................... 30

1.1.3.4. Hoạt tính kháng virus và ký sinh trùng ............................................. 31

1.1.3.5. Hoạt tính chống oxy hóa ................................................................... 32

1.1.3.6. Hoạt tính khác ................................................................................... 32

1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI NA BIỂN .................................................................... 34

1.2.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 34

iii

1.2.2. Công dụng .................................................................................................. 35

1.2.3. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) trên thế giới ................. 35

1.2.4. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) ở Việt Nam ................. 36

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 38

2.1. MẪU THỰC VẬT ............................................................................................. 38

2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT ............................................. 39

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ............................................................................. 39

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế .......................................................................... 39

2.2.3. Sắc ký cột (CC).......................................................................................... 39

2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC ................................... 39

2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ............................................................................... 39

2.3.2. Độ quay cực ([α]D) .................................................................................... 40

2.3.3. Phổ khối lượng (MS) ................................................................................. 40

2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) ............................................................... 40

2.3.5. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) ............................................................................ 40

2.3.6. Phương pháp xác định đường .................................................................... 40

2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC ................................. 41

2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ........................................ 41

2.4.1.1. Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào .................................. 41

2.4.1.2. Phân tích hình thái của các tế bào chết theo chương trình sử dụng

chất nhuộm Hoechst 33342 ............................................................................ 43

2.4.1.3. Western Blot ..................................................................................... 43

2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm ............................................ 44

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ....................................................... 45

3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI NA BIỂN ........................................ 45

3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ................. 48

3.2.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) ............ 48

3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới) ................................................................................ 48

3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới) ................................................................................ 49

3.2.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới) ................................................................................ 49

3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV ...................................................................... 49

3.2.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane ............................................. 50

3.2.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane ............................................. 50

3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al .............................. 50

3.2.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid ....................... 50

3.2.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E .................................................................. 50

3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B ................................................................. 51

3.2.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid ................................. 51

3.2.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-D-

glucopyranoside (mới) ......................................................................................... 51

3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-

glucopyranoside ................................................................................................... 51

3.2.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I ......................................................... 52

3.2.16. Hợp chất 16: Blumenol A ........................................................................ 52

3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1 ......................................................................... 52

3.2.18. Hợp chất 18: Icariside D2 ........................................................................ 52

3.2.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside ............................... 52

3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside .............. 53

3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid................................................ 53

3.2.22. Hợp chất 22: Squamocin M ..................................................................... 53

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 54

4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ..................................................... 54

4.1.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) ............ 54

4.1.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới) ................................................................................ 60

4.1.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới) ................................................................................ 65

4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới) ................................................................................ 70

4.1.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV ...................................................................... 76

4.1.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane ............................................. 78

4.1.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane ............................................. 80

4.1.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al ............................. 82

4.1.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid ....................... 84

4.1.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E .................................................................. 85

4.1.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B ................................................................. 87

4.1.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid ................................. 89

4.1.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-D-

glucopyranoside (mới) ......................................................................................... 91

4.1.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-

glucopyranoside ................................................................................................... 97

4.1.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I ......................................................... 99

4.1.16. Hợp chất 16: Blumenol A ......................................................................101

4.1.17. Hợp chất 17: Icariside B1 .......................................................................102

4.1.18. Hợp chất 18: Icariside D2 ......................................................................103

4.1.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside .............................105

4.1.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside............106

4.1.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid..............................................107

4.1.22. Hợp chất 22: Squamocin M ...................................................................108

4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ....................................................112

4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn ........................112

4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất ...........................112

4.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất ................................115

KẾT LUẬN .............................................................................................................118

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................120

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................121

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................122

PHỤ LỤC .................................................................................................................... I

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR

Kí hiệu 13C-NMR

A A-498 A-549 CD COSY DEPT Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Annona Ung thư biểu mô thận người Ung thư phổi người Phổ lưỡng sắc tròn Phổ COSY Phổ DEPT

DMSO DNA DPPH ESI-MS

FBS Glc HEL-299 HeLa Hep G2 HL-60 HMBC

HPLC (CH3)2SO Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Huyết thanh bò Glucozơ Tế bào mô phổi thường Tế bào ung thư cổ tử cung Ung thư biểu mô gan Ung thư máu Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiếng Anh Cacbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Annona Human kidney carcinoma Human lung carcinoma Circular dichroism 1H-1H- Correlation Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethylsulfoxide Deoxyribo Nucleic Axit 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl Electron Spray Ionization Mass Spectra Fetal bovine serum Glucose Homo Sapiens Lung Normal HeLa cell Hepatocellular carcinoma Human promyelocytic leukemia Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity High Performance Liquid Chromatography HR-ESI-MS High Resolution Electronspray

HSQC

Ionization Mass Spectrum Heteronuclear Single-Quantum Coherence Human colon adenocarcinoma Inhibitory concentration at 50% HT-29 IC50

Interleukin Inducible nitric oxide synthase IL iNOS

Human epidemoid carcinoma lipid peroxide Lipopolysaccharide Human lung carcinoma Human breast carcinoma Human Gastric Cancer KB LPO LPS LU-1 MCF-7 MKN-45 Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Ung thư ruột kết người Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Một enzyme tạo ra nitric oxide từ amino L-arginine acid Ung thư biểu mô người Ung thư phổi người Ung thư vú người Ung thư dạ dày

viii

MTT

NOESY Phổ NOESY

Ung thư biểu mô tuyến tụy người

PACA-2 PC-3 RPMI 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy Human Pancreatic Carcinoma Human Prostate Adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt người Roswell Park Memorial Institute Môi trường nuôi cấy tế bào

RPMI Ung tư da

SK-MEL2 Melanoma SMMC-7721 Human Hepatocellular Carcinoma Ung thư biểu mô gan TLC TMS TNF-α VERO Thin layer chromatography Tetramethylsilane Tumor necrosis factor alpha Monkey epitheloid renal Sắc ký lớp mỏng (CH3)4Si Yếu tố hoại tử khối u Tế bào thường thận khỉ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các hợp chất ent-kaurane từ chi Annona ................................................................ 4

Bảng 1.2. Các hợp chất acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ......... 8

Bảng 1.3. Các hợp chất acetogenin chứa 1 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ................. 9

Bảng 1.4. Các hợp chất acetogenin chứa 2 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ............... 15

Bảng 1.5. Các hợp chất alkaloid từ chi Annona ..................................................................... 19

Bảng 1.6. Các hợp chất amide từ chi Annona ........................................................................ 23

Bảng 1.7. Các hợp chất peptide vòng từ chi Annona ............................................................ 24

Bảng 1.8. Các hợp chất khác từ chi Annona .......................................................................... 26

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo ................................... 55

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo ................................... 62

Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 ........................................................................... 66

Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo ................................... 71

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và hợp chất tham khảo ................................... 77

Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 6 và hợp chất tham khảo ................................... 79

Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và hợp chất tham khảo ................................... 81

Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và hợp chất tham khảo ................................... 83

Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và hợp chất tham khảo ................................... 84

Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và hợp chất tham khảo ............................... 86

Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và hợp chất tham khảo ............................... 88

Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và hợp chất tham khảo ............................... 90

Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ............................... 92

Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 14 và hợp chất tham khảo ............................... 98

Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 15 và hợp chất tham khảo ............................. 100

Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 16 và hợp chất tham khảo ............................. 101

Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất 17 và hợp chất tham khảo ............................. 103

Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất 18 và hợp chất tham khảo ............................. 104

Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất 19 và hợp chất tham khảo ............................. 105

Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo ............................. 106

Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất 21 và hợp chất tham khảo ............................. 108

Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất 22 và hợp chất tham khảo ............................. 109

Bảng 4.23. Thống kê hợp chất phân lập được từ loài na biển ............................................. 111

Bảng 4.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết và các phân đoạn từ lá và

quả loài na biển (A. glabra) ................................................................................................... 112

Bảng 4.25. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất 1-22 ..................................................... 114

Bảng 4.26. Tác dụng ức chế NO trong đại thực bào ........................................................... 117

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Annona ............................................................ 3

Hình 1.2. Loài na biển (Annona glabra Linn.) ...................................................................... 34

Hình 2.1. Mẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của loài na biển (A. glabra) .......................... 38

Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A. glabra) ............................................. 47

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane .................................. 48

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước ..................................................... 48

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 1 và hợp chất tham khảo ..................................................... 54

Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY quan trọng của hợp chất 1 ............................... 56

Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1 ............................................................................ 56

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 .................................................................................. 57

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 ................................................................................. 57

Hình 4.6. Phổ DEPT của hợp chất 1 ....................................................................................... 58

Hình 4.7. Phổ HSQC của hợp chất 1 ...................................................................................... 58

Hình 4.8. Phổ HMBC của hợp chất 1 ..................................................................................... 59

Hình 4.9. Phổ COSY của hợp chất 1 ...................................................................................... 59

Hình 4.10. Phổ NOESY của hợp chất 1 ................................................................................. 60

Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo ................................... 60

Hình 4.12. Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 2 ............................................... 62

Hình 4.13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2 .......................................................................... 63

Hình 4.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 ................................................................................ 63

Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 .............................................................................. 64

Hình 4.16. Phổ HSQC của hợp chất 2 .................................................................................... 64

Hình 4.17. Phổ HMBC của hợp chất 2................................................................................... 65

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 3 ............. 65

xii

Hình 4.19. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 3 .......................................................................... 67

Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 ................................................................................ 68

Hình 4.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 .............................................................................. 68

Hình 4.22. Phổ HSQC của hợp chất 3 .................................................................................... 69

Hình 4.23. Phổ HMBC của hợp chất 3................................................................................... 69

Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo ................................... 70

Hình 4.25. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY quan trọng của hợp chất 4 ............. 72

Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 4 .......................................................................... 72

Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 ................................................................................ 73

Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4 .............................................................................. 73

Hình 4.29. Phổ DEPT của hợp chất 4..................................................................................... 74

Hình 4.30. Phổ HSQC của hợp chất 4 .................................................................................... 74

Hình 4.31. Phổ HMBC của hợp chất 4................................................................................... 75

Hình 4.32. Phổ COSY của hợp chất 4 .................................................................................... 75

Hình 4.33. Phổ NOESY của hợp chất 4 ................................................................................. 76

Hình 4.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 5 ...................... 76

Hình 4.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 .......................................................................... 78

Hình 4.36. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 7 ...................... 80

Hình 4.37. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 8 ...................... 82

Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 .......................................................................... 84

Hình 4.39. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 10 .................... 85

Hình 4.40. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 11 .................... 87

Hình 4.41. Cấu trúc hóa học của 12 và hợp chất tham khảo ................................................. 89

Hình 4.42. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 12 ..................................................... 90

Hình 4.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ................................. 91

Hình 4.43. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất 13 ................................. 93

xiii

Hình 4.44. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 13 ........................................................................ 94

Hình 4.45. Phổ 1H-NMR của hợp chất 13 ............................................................................. 94

Hình 4.46. Phổ 13C-NMR của hợp chất 13 ............................................................................ 95

Hình 4.47. Phổ DEPT của hợp chất 13 .................................................................................. 95

Hình 4.48. Phổ HSQC của hợp chất 13 .................................................................................. 96

Hình 4.49. Phổ HMBC của hợp chất 13 ................................................................................ 96

Hình 4.50. Phổ NOESY của hợp chất 13 ............................................................................... 97

Hình 4.51. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 14 .................... 97

Hình 4.52. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 15 .................... 99

Hình 4.53. Cấu trúc hóa học chất 16 ..................................................................................... 101

Hình 4.54. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 17 .................. 102

Hình 4.55. Cấu trúc hóa học và các tương tác chính của hợp chất 18 ................................ 103

Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất 19 ...................................................................... 105

Hình 4.57. Cấu trúc hóa học của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo ............................... 106

Hình 4.58. Cấu trúc hóa học của hợp chất 21 ...................................................................... 107

Hình 4.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất 22 ...................................................................... 108

Hình 4.60. Các hợp chất phân lập được từ loài na biển ....................................................... 110

Hình 4.61. Mức độ chết theo cơ chế apoptosis của tế bào HL-60 dưới sự tác động của hợp

chất 18 và 22 tại thời điểm 24 h và 48 h ở nồng độ IC50 ..................................................... 115

Hình 4.62. Ảnh hưởng của hợp chất 18 và 22 đến các biểu hiện ở cấp độ protein trên dòng

tế bào HL-60 ở nồng độ IC50 tại 24 h và 48 h ...................................................................... 115

xiv

DANH MỤC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 1 (AGQ30) .......................................................................... II

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 2 (AGQ32) .................................................................... XXII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 3 (AGQ31) ................................................................ XXXVI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 4 (AGQ29) .......................................................................... L

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 5 (AGQ26) .................................................................. LXXII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 6 (AGQ6) ............................................................... LXXVIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 7 (AGQ2) ................................................................. LXXXII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 8 (AGQ8) ............................................................... LXXXIX

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 9 (AGQ11) ................................................................... XCVI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 10 (AGQ7) ......................................................................... CI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 11 (AGQ4) ................................................................... CVIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 12 (AGQ9) .................................................................... CXV

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 13 (AGQ19) ................................................................. CXXI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 14 (AG3) ...................................................................... CXLI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 15 (AG1) .................................................................. CXLVII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 16 (AG15) .................................................................... CLIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 17 (AG2) ..................................................................... CLVII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 18 (AGQ20) ...............................................................CLXIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 19 (AGQ18) .............................................................. CLXIX

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 20 (AGQ25) ............................................................ CLXXIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 21 (AGQ17) .......................................................... CLXXVII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 22 (AGQ1) ............................................................. CLXXXI

PHỤ LỤC 23: Sắc ký đồ của các dẫn xuất TMS của D-glucose, L-glucose và các

hợp chất ........................................................................................................ CLXXXV

PHỤ LỤC 24: Phổ CD của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ................. CLXXXV

PHỤ LỤC 25: Phiếu giám định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu ...........CLXXXVI

MỞ ĐẦU

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về

những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương đông

mà các nước phương tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Theo thống kê,

ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư số thuốc kê trong các đơn

đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt

tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh. Xu

hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự

quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu

và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp.

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ

thực vật đa dạng và phong phú. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài

thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Việc

sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con

người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng.

Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn

có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều

loại bệnh khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối

hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được

khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng.

Cây na biển (Annona glabra) là loại cây ăn quả và thường được dùng trồng

để chắn sóng ở các vùng ngập mặn. Cây thường được dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ

và làm thuốc sát trùng. Vỏ cây giã ra cũng có công dụng tương tự. Dịch lá cây dùng

để trừ chấy. Hạt nghiền nát có tính làm săn da, sát trùng. Thịt quả lại có vị ngọt mát,

giải nhiệt. Các nghiên cứu về thành phần hóa học đã công bố trên thế giới cho thấy

loài này chứa nhiều lớp chất quý có cấu trúc độc đáo, đặc biệt là lớp chất

diterpenoid ent-kaurane và acetogenin. Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học

cho thấy một số hợp chất đã được phân lập từ loài này thể hiện hoạt tính sinh học

rất đáng quan tâm như: hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng

viêm, giảm đau.... Tuy nhiên, hiện có ít công trình khoa học trong nước công bố cả

về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây thuốc quý này.

Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của cây na biển (Annona glabra L), chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Na biển (Annona glabra L.)"

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu

của loài na biển (A. glabra). Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng

viêm của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm một số chất có hoạt tính , làm cơ

sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo

nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho

những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và

góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này.

Nội dung luận án bao gồm:

1. Phân lập các hợp chất từ quả loài na biển (A. glabra) bằng các phương pháp

sắc ký;

2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp

vật lý và hóa học;

3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được;

4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA)

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona)

Annona là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), gồm các cây bụi, cây gỗ

nhỏ hay lớn, sống hàng năm hay lâu năm. Lá cây dai như da, đôi khi có lông, hoa có

3 đài, xếp van, cuống thường ngắn, hoa lưỡng tính, ở ngoài nách lá đối diện với lá

hoặc trên cành già với một hoa hoặc một cụm có ít hoa. Hoa có 6 cánh, nhị nhiều,

noãn nhiều, lúc đầu rời nhau, khi thành quả thì dính nhau tạo thành một khối nạc.

Bề mặt quả bao phủ bởi các núm, chỗ phình ra có gai hoặc trơn, nhiều hạt. Hạt đen

hoặc nâu, vỏ hạt nhẵn bóng [7].

Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân chi Annona có khoảng 125 loài tìm thấy ở

Trung và Nam Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Úc [1].

Ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ về chi Annona. Theo tác giả

Nguyễn Tiến Bân thống kê và mô tả có 4 loài thuộc chi Annona ở Việt Nam đó là:

A.muricata, A. squamosa, A. reticulata, và A. glabra, trong đó 3 loài chỉ gặp ở dạng

cây trồng [1]. Bốn loài này cũng được mô tả và có thể sử dụng làm thuốc ở nước ta

[4, 47].

Annona muricata L. Annona squamosa L. Annona reticulata L. Annona glabra L.

Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Annona

1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona

Theo thống kê, trong số 125 loài thuộc chi Annona có khoảng 21 loài đã

được nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm: A. atemoya, A. bullata, A.

cherimolia, A. cornifolia, A. coriacea, A. crassiflora, A. densicoma, A. foetida, A.

glabra, A. glauca, A. montana, A. muricata, A. nutans, A. pickelii, A. purpurea, A.

salzmanii, A. sericea, A. senegalensis, A. reticulata, A. rugulosa và A. squamosa.

Thống kê từ các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước và trên thế

giới cho thấy thành phần hóa học chính của chi Annona là các hợp chất diterpenoid

khung kaurane, acetogenin, alkaloid, peptit vòng ….

1.1.2.1. Các hợp chất diterpenoid ent-kaurane

Lớp chất diterpenoid ent-kaurane là một trong những lớp chất chính của chi

Annona. Cho đến hiện tại, có khoảng 59 hợp chất diterpenoid ent-kaurane (1-59)

được công bố từ chi Annona (xem Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Các hợp chất ent-kaurane từ chi Annona

ent-kauran-16α-ol 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane 16α,17-dihydroxy-ent-kaurane ent-kauran-17α-oic acid ent-kauran-17β-oic acid annoglabasin F 19-nor-ent-kauran-17β-oic acid TLTK [15] [15] [15] [25, 72] [25, 72] [36] [25, 144] KH Tên chất 1 2 3 4 5 6 7

Loài A. cherimola A. cherimola A. cherimola A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra A. squamosa A. squamosa 19-nor-ent-kauran-17α-oic acid A. squamosa annosquamosin B A. squamosa annosquamosin D A. squamosa annosquamosin C A. squamosa annosquamosin E 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid A. squamosa 8 9 10 11 12 13

[138] [138, 144] [144] [144] [144] [15, 72, 136, 138, 144]

A. glabra A. cherimola A. squamosa 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid A. squamosa 14 [15, 25, 72, 136, 138]

A. glabra A. cherimola A. squamosa A. glabra A. squamosa A. senegalensis

16 17

18 16β-hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oic acid ent-16,17-diacetoxykauran-19-oic acid 17-hydroxy-16βH-ent-kauran-19-oic acid A. squamosa A. cherimola 17-hydroxy-16αH-ent-kauran-19-oic acid A. squamosa A. cherimola [25, 72, 144] [53] [15, 138, 144] [15, 138, 144]

[138] [15] 19 20

17-acetoxy-16βH-ent-kauran-19-oic acid A. squamosa A. cherimola (16R)-17-dimethoxy-ent-kauran-19-oic acid 16αH-ent-kauran-17,19-dioic acid [72, 144] 21

16βH-ent-kauran-17,19-dioic acid annoglabasin C 16α-methoxy-ent-kauran-19-oic acid 16α -hydroxy-ent-kauran-19-oic acid ent-kaur-16-en-19-oic acid 22 23 24 25 26

ent-19-carbomethoxykauran-17-oic acid [144] [36] [36] [72] [15, 25, 53, 72, 99, 107, 138, 144] [53, 99] 27

[36] [15] A. squamosa A. glabra A. squamosa A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra A. senegalensis A. squamosa A. cherimola A. senegalensis A. glabra A. glabra A. cherimola 28 29

16αH-ent-kauran-17,19-dimethyl ester 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid methyl ester 16βH-19-al-ent-kauran-17-oic acid 16αH-19-al-ent-kauran-17-oic acid [138] [72, 144] 30 31

annoglabasin A 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al 32 33

16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al annosquamosin A [25] [72, 138, 144] [144] [25, 138] 34 35

16βH-17-hydroxy-ent-kauran-19-al 36

[72, 138, 144] [72] [72] [25] A. squamosa A. squamosa A. glabra A. glabra A. squamosa A. glabra A. squamosa A. squamosa A. glabra A. squamosa A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra 16αH-17-hydroxy-ent-kauran-19-al 37 16αH-17-acetoxy-ent-kauran-19-al 38 39 methyl-16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-

oate annoglabasin D 16αH-19-al-ent-kauran-17-oic acid 16β-ent-kaurane-16,17,19-triol 16α,17,19- trihydroxy -ent-kaurane (16R)-ent-kauran-17,19-diol (16S)-ent-kauran-17,19-diol annoglabasin E ent-kaur-16-en-19-ol annoglabasin G annoglabasin B ent-3β-hydroxykaur-16-ene A. glabra A. glabra A. squamosa A. squamosa A. cherimola A. cherimola A. glabra A. squamosa A. glabra A. glabra A. senegalensis [36] [25] [138] [136] [15] [15] [36, 72] [25, 138] [72] [25, 72, 99] [53] 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

A. glabra A. glabra A. glabra A. squamosa A. glabra A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. glabra [25] [72] [72, 99] [144] [31] [144] [144] [136] [99] 51 52 53 54 55 56 57 58 59 ent-kaur-15-en-17,19-diol ent-kaur-15-en-19-oic acid ent-kaur-15-en-17-ol-19-oic acid annomosin A annoglabayin annosquamosin F annosquamosin G 16α,17,18-trihydroxy-ent-kaurane ent-15β,16β-epoxy-17-hydroxy-kauran- 19-oic acid

KH R1 R3

R3 OH CH2OH OH COOH H

H COOH CH2OH CH2OH H CH2OAc CH2OH OH CH2OAc

CH2OH

CH2OAc CH(OCH3)2 H COOH

R2 CH3 OH CH2OH H COOH COOCH3 OAc COOH H OH OAc CH2OH

H CH2OH OH CH2OH H H H H

COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 CHO CHO CHO CHO CHO CHO CHO CHO CHO CHO CHO CHO CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OAc CH2OAc

R2 =CH2 COOH H COOCH3 H CH2OH OH H COOH COOH H OAc COOCH3 OH CH2OH CH2OH OH OH CH2OAc H CH2OH CH2OH H H CH2OAc COOCH3 H COOCH3 OAc COOH OH CH2OH H CH2OH COOH =CH2 CHO COOH

CH3 1 CH3 2 CH3 3 CH3 4 CH3 5 OH 6 OH 7 OH 8 OH 9 10 OH 11 OH 12 OCHO OH 13 COOH OH 14 COOH CH2OH 15 COOH OH 16 COOH CH2OAc OAc 17 COOH H 18 COOH CH2OH H 19 COOH H 20 COOH H 21 COOH COOH 22 COOH H 23 COOH COOCH3 OAc OCH3 24 COOH CH3 OH 25 COOH CH3

KH R1 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

50 R1 R2 51 CH2OH CH2OH 52 COOH CH3 53 COOH CH2OH

R2 R3 56 OH CH2OAc 57 OH CH2OH

HOO

CHO

COOH

CHO

54

59

55

58

1.1.2.2. Các hợp chất acetogenin

Ngoài các hợp chất diterpenoid khung ent-kaurane, các hợp chất acetogenin

cũng được phát hiện là thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Annona.

Acetogenin là một lớp chất tự nhiên quan trọng thể hiện nhiều hoạt tính sinh học

như ức chế sự phát triển của tế bào ung thư diệt côn trùng, kháng ký sinh trùng sốt

rét, trị giun sán, kháng virus. Những hợp chất này có đặc trưng là chuỗi alkyl dài

(32 hoặc 34 nguyên tử cacbon), kết thúc bằng một vòng γ-lactone và có các nhóm

như tetrahydrofuran, epoxide, hydroxyl, vv .. Có khoảng 183 hợp chất acetogenin

được phân lập từ 17 loài thuộc chi Annona (A. atemoya, A. bullata, A. cherimolia,

A. cornifolia, A. coriacea, A. crassiflora, A. densicoma, A. glabra, A. glauca, A.

montana, A. muricata, A. nutans, A. purpurea, A. salzmanii, A. senegalensis, A.

reticulata và A. squamosa).

1.1.2.2.1. Các acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran

Thống kê cho thấy đã có 29 hợp chất acetogenin (60-88) không chứa vòng

tetrahydrofuran được phân lập từ 6 loài A. atemoya, A. coriacea, A. montana, A.

muricata, A. nutans và A. reticulata (xem Bảng 1.2).

Bảng 1.2. Các hợp chất acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran từ chi Annona

donhexocin (+) monhexocin (-) monhexocin reticulatamol reticulatamone artemoin A artemoin B artemoin C artemoin D cohibin A cohibin B cohibin C TLTK [145] [145] [88] [88] [122] [19] [24] [24] [24] [24] [56] [56] [57] KH Tên chất 60 murihexol 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

cohibin D [57] 73

coriadienin chatenaytrienin I [61] [61] [60] [60] [60] [59] [100] [60] 74 muridienin I 75 muridienin II 76 muridienin III 77 muridienin IV 78 muricadienin 79 montecristin 80 81

chatenaytrienin II [60] 82

chatenaytrienin III [60] 83

threo

Loài A. muricata A. muricata A. montana A. montana A. reticulata A. reticulata A. atemoya A. atemoya A. atemoya A. atemoya A. muricata A. muricata A. muricata A. nutans A. muricata A. nutans A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. coriacea A. nutans A. muricata A. nutans A. muricata A. nutans A. muricata A. nutans A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata [60] [67, 116] [116] [67] [58] chatenaytrienin IV epoxymurin A (epomuricenin A) epomuricenin B epoxymurin B sabadelin 84 85 86 87 88

60 M =erythro 61 M =threo

62 (+) 63 (-)

R R

64 R=OH 65 R=O

70 n=11, m=10 72 n=13, m=10 71 n=9, m=12 73 n=11, m=12

66 n=16, m=8 68 n=12, m=12 67 n=14, m=10 69 n=10, m=14

threo

S 1 O

79

13S

14S

80 74 n=9, m=12 77 n=9, m=10 75 n=11, m=12 78 n=11, m=10 76 n=9, m=14

S 1 O

34 1 O

81 n=9, m=8 83 n=9, m=10 82 n=7, m=10 84 n=11, m=8

85 n=11, m=10 86 n=9, m=12

cis

34 1 O

87

88

1.1.2.2.2. Các acetogenin chứa 1 vòng tetrahydrofuran

Theo các công trình công bố, có khoảng 93 hợp chất acetogenin chứa 1 vòng

tetrahydrofuran (89-181) được phân lập từ 12 loài thuộc chi Annona bao gồm: A.

atemoya, A. cherimolia, A. coriacea, A. densicoma, A. glauca, A. glabra, A.

montana, A. muricata, A. salzmanii, A. senegalensis, A. reticulata và A. squamosa.

Bảng 1.3. Các hợp chất acetogenin chứa 1 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona

cis-annonacin cis-annonacin-10-one cis-goniothalamicin arianacin javoricin annosenegalin annonacin A TLTK [115] [115] [115] [115] [115] [117] [117, 126, 145] KH Tên chất 89 90 91 92 93 94 95

annonacin 96 [6, 49, 54, 56, 117, 126, 145]

Loài A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. cherimolia A. cherimolia A. glauca A. muricata A. senegalensis A. muricata A. atemoya A. glauca

annonacinone annomontacin corossolin

[54, 140] [72] [54] [54] [87] [126] [125] [125] [117] [27] [27] [78] [54] [54] [54, 100] 97 98 99 100 corossolone 101 cis-annomontacin 102 goniothalamicin 103 glaucabellin 104 glaucaflorin 105 annogalene 106 muricin F 107 muricin G 108 annocherimolin 109 glabranin 110 muricatetrocin B 111 gigantetronenin

trans-annomuricin-D-one

(2,4-cis/trans)-mosinone A

A glabra A glabra A glabra A glabra A glabra A. muricata A. glauca A. glauca A. glauca A. senegalensis A. muricata A. muricata A. cherimolia A glabra A glabra A. coriacea A glabra A glabra A. muricata A. glauca A. cherimolia A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. montana A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. montana A. montana A. montana A. salzmanii A glabra A glabra A glabra A glabra A glabra A. cherimolia A. coriacea A. coriacea A. muricata [54] [87] [125] [117] [146] [146] [146] [146] [146] [127] [69] [69] [69] [69] [101] [101] [101] [113] [95] [92] [92] [94] [94] [78] [46] [46] [96] 112 gigantetrocin A 113 muricin I 114 muricatetrocin B 115 gigantetrocin 116 annopentocin A 117 annopentocin B 118 annopentocin C 119 cis-annomuricin-D-one 120 121 montanacin F 122 123 mosin B 124 mosin C 125 annoreticuin-9-one 126 anmontanin A 127 anmontanin B 128 anmontanin C 129 parisin 130 annoglaxin 131 glacin A 132 glacin B 133 annoglacin A 134 annoglacin B 135 annomolin 136 coriaheptocin A 137 coriaheptocin B 138 annohexocin

(2,4-cis/trans)-squamoxinone isoannonacin isoannonacinone

A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. glauca A. glauca A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. muricata A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. densicoma A. densicoma A. montana A. montana A. montana A. montana A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. montana A. montana A. muricata A. muricata [80] [80] [79] [79] [55] [55] [55] [55] [55] [55] [55] [126] [126] [27] [27] [27] [27] [27] [87] [68] [68] [68] [140] [140] [88] [88] [88] [88] [85] [85] [85] [85] [85] [85] [85] [85] [40] [40] [40] [86] [86] [147] [147] 139 muricapentocin 140 annomuricin E 141 muricoreacin 142 murihexocin C 143 solamin 144 cis-solamin 145 cis-panatellin 146 cis-uvariamicin IV 147 cis-uvariamicin I 148 cis-reticulatacin 149 cis-reticulatacin-10-one 150 glaucafilin 151 gigantetrocin A 152 muricin A 153 muricin B 154 muricin C 155 muricin D 156 muricin E 157 muricin H 158 4-deoxyannoreticuin 159 cis-4-deoxyannoreticuin 160 161 162 163 montalicin G 164 montalicin H 165 monlicin A 166 monlicin B 167 squafosacin B 168 squafosacin C 169 squafosacin F 170 squafosacin G 171 cis-annotemoyin I 172 squadiolin A 173 squadiolin B 174 squadiolin C 175 annosquamin A 176 annosquamin B 177 annosquamin C 178 montacin 179 cis-montacin 180 murihexocin A 181 murihexocin B

20S

15R

A B

S 1 O

1 O

94 n=12 95 n=10

1 O

OH A B C 89 S S R 90 S S - 91 S S R 92 R R S 93 R R R

p m n R 10 3 5 OH 10 3 5 =O 12 1 5 OH 10 1 7 OH 10 1 7 OH R

20R

15R

1 O

trans

R n 96 OH 3 97 O 3 98 OH 5 threo

erythro

36S 1 O

99 R=OH 100 R=O OH

36S

22R

17S

1 O

103 trans

threo

OH 101

22R

17S

36S 1 O

104 OH 102

20R

15R

21S

1 O

105 OH 106

36S

18R

13R

1 O

20S

15R

1 O

OH 108

107

36S

19R

OH S

S O

trans

113 threo

threo

109 n=7, m=9 111 n=5, m=11 110 n=7, m=7 112 n=5, m=9

1 O

16S

34S 1 O

10R

OH 114

17S

14R

1 O

18S OH

OH 115

cis/ trans

R3 O R1 R2 R3 R4 116 H OH H OH 117 OH H OH H 118 H(OH) OH(H) OH(H) H(OH) erythro

15R

20R

15R

20S

29S

4 O5

4 O9

121 OH 119 cis 120 trans

cis/ trans

15R

20S

15R

20R

4 O3

trans

123

122

20R

15R

O 125

34S

O 124

trans

threo

34S

22R

17S

106

127

trans

threo

O 126

trans

threo

129 O 128

34/36S

34S

32/34

17R

12R

22S

20R

15R

122

trans

threo

OH 130 anti

O OH 131 n=8, 22R 133 n=10, 22S 132 n=8, 22S 134 n=10, 22R

36S

O 32

18S

14 R

1 O

17 S

135 OH OH 136 M =erythro 137 M =threo

trans

threo

trans

threo

erythro

OH 4

140 138 M =erythro, R=OH 139 M =threo, R=H

trans

threo

erythro

pseudo-erythro OH OH

20 19

141

20 19

142 M =erythro, N=threo hay M =threo, N=erythro

m n R M m n R M 143 3 10 H trans 147 3 12 H cis 144 3 10 H cis 148 5 10 H cis 145 1 12 H cis 149 5 10 O cis 146 1 14 H cis

trans

threo

4 10

152 4R 153 4S

OH O n m M 150 7 10 erythro 151 5 12 threo

34S

19R R

15 S

threo

157 M

threo

O OH n p 154 12 1 155 10 1 156 7 4 OH

22R

17R

11S

4R O6

158 M =trans 159 M =cis

OH 160

trans

threo

34S

20R

15R

OH 163 19R 164 19S

161 R1=OH 162 R1=O

34S

18R

18S

14 S

14 R

165

166

34S

36S

17R

22R

15R

20R

OH 167

168

36S

15R

24S

19R

16R

trans

threo

172 threo

36S

OH n m A 169 11 10 S 170 15 8 S 171 13 8 R

34S

173

trans

threo

36S

174 n m M 175 5 16 erythro 176 7 14 erythro 177 5 16 threo

34S

20S

25R

25S

178

179

threo

34S

16S

12 R

181

180

1.1.2.2.3. Các acetogenin chứa 2 vòng tetrahydrofuran

Theo các công trình công bố, đã có khoảng 61 hợp chất acetogenin chứa 2

vòng tetrahydrofuran (182-242) được phân lập từ 11 loài của chi Annona là: A.

atemoya, A. bullata, A. cherimola, A. cornifolia, A. crassiflora, A. glabra, A.

glauca, A. purpurea, A. salzmanii, A. spinescens và A. squamosa (xem Bảng 1.4).

Bảng 1.4. Các hợp chất acetogenin chứa 2 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona

TLTK [30] [30, 51] KH Tên chất 182 purpuracenin 183 annoglaucin

Loài A. purpurea A. glauca A. purpurea A. glabra A. bullata A. bullata A. bullata (2,4-cis)-28-hydroxybullatacinone A. bullata (2,4-trans)-28-hydroxybullatacinone A. bullata (2,4-cis/trans)-squamolinone (2,4-cis/trans)-9-oxo-asimicinone

[95] [63] [63] [63] [63] [63] [70] [70] [70] [118] [119] [91] [91] [109] [54] [54] [49, 54] 184 27-hydroxybullatacin 185 32-hydroxybullatacin 186 31-hydroxybullatacin 187 30-hydroxybullatacin 188 189 190 191 192 bullacin B 193 cornifolin 194 araticulin 195 glabracin A 196 glabracin B 197 salzmanin laherradurin 198 itrabin 199 200 molvizarin

[49, 54] 201 parviflorin

202 annonisin 203 salzmanolin 204 spinencin 205 carolin A 206 carolin B 207 carolin C 208 squamocin [49] [113] [111] [112] [112] [112] [18, 24, 33, 112, 126]

A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. cornifolia A. crassiflora A. glabra A. glabra A. salzmanii A glabra A glabra A. atemoya A glabra A. atemoya A glabra A. atemoya A. salzmanii A. spinescens A. spinescens A. spinescens A. spinescens A. glauca A. spinescens A. atemoya A. cherimola A. squamosa

[18, 125] 209 squamocin B

[22] [22] [39] [41] [41] [41] [41] [24] [24] [18, 24] 210 squamocin O1 211 squamocin O2 212 annosquacin I 213 annosquacin A 214 annosquacin B 215 annosquacin C 216 annosquacin D 217 12,15-cis-squamostatin D 218 12,15-cis-squamostatin A 219 squamostatin A

[126] [24, 91, 111] 220 gigantecin 221 bullatanocin

36S

24S

15R

1 O

27S

24S

15R

10R

A. glauca A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. atemoya A. atemoya A. atemoya A. squamosa A. glauca A. spinescens A. glabra A. atemoya A. cherimola A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. cornifolia A. glabra A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa A. squamosa [33] [142] [142] [39] [39] [41] [41] [90] [99] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] 222 aromin A 223 squamostanin C 224 squamostanin D 225 annosquatin I 226 annosquatin II 227 annosquatin A 228 annosquatin B 229 9-hydroxy-folianin 230 asimicin 231 squamocin C 232 squamocin D 233 squamocin E 234 squamocin F 235 squamocin G 236 squamocin H 237 squamocin I 238 squamocin J 239 squamocin K 240 squamocin L 241 squamocin M 242 squamocin N

184 OH 182 19S, 20S 183 19R, 20R

cis/ trans

36S

31S

15R

28S

15R

1 O

31S

24S

188 cis 189 trans

24R

15R

R R

OH OH R1 R2 R3 185 OH H H 186 H OH H 187 H H OH

OH 191

15R

24S

R R

17R

26S

1 O

190

36S

24R

15R

193

1 O

36S

192

10S

1 O

32S

15R

1 O

31S

24S

195 M = erythro 196 M =threo

194

28S

15R

24S

1 O

12R 2

197 198 n = 9 199 n = 7 OH

13R

S/R

22R

13R

trans

cis

OH 202 threo

threo

200 22S 201 22R trans

threo

threo erythro

erythro

1 O

204

203

trans

threo

trans

cis

threo

erythro

1 O

205 R1=OH, R2=H 206 R1=H, R2=OH

207 M =cis, n=9 208 M =cis, n=11 209 M =trans, n=9

36S

28R

15R

36S

24S

1 O

10R

19S

1 O

212 210 12R 211 12S

trans

threo

erythro

1 O

O n m R n m R 213 7 8 H 215 7 10 OH 214 7 10 H 216 9 8 H

OH R M 217 H cis 218 OH cis 219 OH trans

trans

36S

trans

threo

19R

24R

16S

1 O

221 OH 220

34S

19R

16S

36R 1 O

12 S

15R

1 O

20S

erythro

222 OH 223 24S 224 24R

36S

29R

21S

24S

1 O

21R

13S

16S

1 O

4 12

OH 227 R=H 228 R=OH

OH 225 R1=OH, R2=H 226 R1=H, R2=OH OH

21R

12S

1 O

O 230

229

1 O

233 231 n=4, m=3 232 n=3, m=4

1 O

234 235 24S 236 24R

1 O

237 238 22S 239 22R

1 O

242 240 22S 241 22R

1.1.2.3. Các hợp chất alkaloid

Theo các công trình công bố, đã có khoảng 67 hợp chất alkaloid (243-309)

được phân lập từ 12 loài của chi Annona là: A. atemoya, A. cherimola, A. foetida, A.

glabra, A. montana, A. pickelii, A. purpurea, A. rugulosa, A. salzmanii, A. sericea,

A. spinescens và A. squamosa.

Bảng 1.5. Các hợp chất alkaloid từ chi Annona

KH Tên chất lirinidine 243 244 N-methylasimilobine romucosine H 245 246 N-methylcorydine (S)-reticuline 247 TLTK [28] [28] [37] [123] [23, 45, 123, 124]

(S)-N-methylcoclaurine [23, 124] 248

(+)-O-methylarmepavine (+)-anomuricine

Nguồn gốc A. purpurea A. purpurea A. cherimola A. glabra A. sericea A. rugulosa A. glabra A. salzmannii A. sericea A. rugulosa A. squamosa A. squamosa A. cherimola A. cherimola A. foetida A. foetida A. spinescens A. spinescens A. spinescens A. cherimola A. cherimola A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra [121, 141] [121, 141] [37] [37] [44] [44] [110] [110] [110] [98] [98] [123] [123] [123] [123] [123] [123] 249 250 251 annocherine A 252 annocherine B 253 N-hydroxyannomontine 254 annomontine 255 pessoine 256 spinosine 257 xylopinine 258 corytenchine isocoreximine 259 260 pseudocolumbamine 261 pseudopalmatine 262 dehydrocorydalmine 263 dehydrocorytenchine 264 palmatine 265 S-(-)-7,8-didehydro-10-O- demethylxylopininium salt A. glabra [123] 266 S-(-)-7,8-didehydrocorydalm-

A. glabra [123] 267 inium salt (7S,14S)-(-)-N-methyl-10-O- demethylxylopinine salt

A. purpurea A. purpurea [28] [26] 268 N-methyllaurotetanine 269 promucosine

A. squamosa [75]

270 5-((6,7-dimethoxy-2-methyl-1,2,3,4- tetrahydroisoquinolin-1-yl)methyl)-2- methoxybenzene-1,3-diol 271 7-hydroxy-dehydrothalicsimidine 272 7-formyl-dehydrothalicsimidine thalicsimidine 273 274 norpurpureine romucosine F 275 romucosine G 276 277 S-(+)-3-hydroxynornantenine 278 R-(-)-actinodaphnine 279 asimilobine [28] [28] [28] [28] [26] [26] [123] [123] [45, 50, 123, 124]

[124] [23, 50, 124] 280 norisocorydine 281 nornuciferine

[23, 124] 282 nornantenine

[23, 123] 283 3-hydroxynornuciferine

[45, 124] 284 anonaine

[45, 124] 285 xylopine

litseferine

lysicamine [124] [44] [23, 50, 123] 286 287 O-methylmoschatoline 288

[23, 123] 289 oxonantenine

liriodenine 290 [44, 45, 50, 72, 123, 124]

[45] [121, 124, 141] 291 oxolaureline lanuginosine 292

isoboldine [23, 124] 293 A. purpurea A. purpurea A. purpurea A. purpurea A. purpurea A. purpurea A. glabra A. glabra A. glabra A. salzmannii A. rugulosa A. pickelii A. rugulosa A. sericea A. pickelii A. rugulosa A. sericea A. rugulosa A. sericea A. glabra A. salzmannii A. rugulosa A. salzmannii A. rugulosa A. rugulosa A. foetida A. sericea A. glabra A. pickelii A. sericea A. glabra A. foetida A. glabra A. salzmannii A. pickelii A. rugulosa A. salzmannii A. squamosa A. rugulosa A. sericea A. rugulosa

(+) corytuberine isocorydine

[43] [121, 141] [37] [123] [124] [141] [75] A. montana A. squamosa A. cherimola A. glabra A. rugulosa A. squamosa A. squamosa 294 295 296 artabonatine B 297 R-(-)-norushinsunine 298 magnococline 299 N-methylcorydaldine 300

(1R,3S)-6,7-dimethoxy-2-methyl- 1,2,3,4-tetrahydroisoq uinoline-1,3-diol A. glabra

MeO

NMe2

MeO

COOMe

MeO

TFA

MeO

[123] [74, 141] [123] [139] [37] [121, 141] [103] [34] [45] A. glabra A. atemoya A. cherimola A. squamosa A. squamosa A. cherimoIa A. salzmannii 301 pycnarrhine 302 6,7-dimethoxy-2- methylisoquinolinium A. squamosa 303 5-O-methylmarcanine D 304 atemoine 305 cherianoine 306 N-methyl-6,7-dimethoxyisoquinolone 307 samoquasine A 308 cherimoline 309 cleistopholine

245

246

243

244

MeO

H2N

251 R=OH 252 R=OMe

253 R=OH 254 R=H

R1 R2 249 H Me 250 OH H

R2 R1 R2 247 OH OMe 248 H OH

MeO

TFA

MeO

OMe

260 R=OH 261 R=OMe

255 R=OH 256 R=OMe

R1 R2 R3 262 OMe OH H 263 H OMe OH 264 OMe OMe H

R2 R1 R2 257 OMe OMe 258 OMe OH 259 OH OH

MeO

TFA

COOMe

MeO

OMe

OH 268

269

267 265 R1=H, R2=OMe 266 R1=OMe, R2=H

OMe

MeO

H3CO

MeO

COOMe

MeO

CH3

H3CO HO

MeO

H3CO

OMe

273 R=Me 274 R=H

OMe 271 R=OH 272 R=CHO

OH 270 OH

275 R=Cl 276 R=OMe

MeO

NH2 H

TFA

MeO

280

279 OH 278

O 277 R1

MeO

R2 R1 R2 R3 281 H H H 282 H OCH2O 283 OH H H

R4 R1 R2 290 H H 291 H OMe 292 OMe H

R1 R2 R3 287 OMe H H 288 H H H 289 H OCH2O

R2 R1 R2 R3 284 H H H 285 H OMe H 286 H OMe OH OMe

MeO

H3CO

R1 R3

MeO

OCH3

298

297

296

MeO

H3CO

MeO

CH3

H3CO

R2 R1 R2 R3 293 OH OH H 294 OH H OH 295 OMe H OH

299

300 301 R=OH 302 R=OMe

OMe

MeO

N H

OMe

304

303 305 R1=OMe; R2=OH 306 R1=H; R2=OMe

307

308 O 309

1.1.2.4. Các hợp chất amide

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trong chi Annona cho thấy, có khoảng

7 hợp chất amide (310-316) được phân lập từ chi Annona. Công thức các amide

được thống kê trong Bảng 1.6.

Bảng 1.6. Các hợp chất amide từ chi Annona

TLTK [32] [32] [32] [32] [32] [32] [35] Loài KH Tên chất A. cherimola 310 N-cis-caffeoyltyramine A. cherimola 311 dihydro-feruloyltyramine 312 N-trans-feruloylmethoxytyramine A. cherimola A. cherimola 313 N-cis-feruloylmethoxytyramine A. cherimola 314 N-p-coumaroyltyramine A. cherimola 315 N-cis-feruloyltyramine A. cherimola 316 cherinonaine H

R2

R1

H3CO

OCH3

310

311

MeO

H3CO

OMe

312

CH2 O

313

CH2

OMe

MeO

316

314

315

1.1.2.5. Các hợp chất peptide vòng

Theo thống kê các công trình đã công bố, đã có khoảng 35 hợp chất peptide

vòng (317-351) được phân lập từ chi Annona. Tên gọi và cấu tạo các peptide vòng

được thống kê trong Bảng 1.7.

Bảng 1.7. Các hợp chất peptide vòng từ chi Annona

Tên khoa học

Loài A. squamosa TLTK [82] KH Tên chất 317 annosquamosin A cyclo (prolyl-S-oxomethyl-

[83, 128] 318 glabrin A

A. glabra A. reticulata A. glabra [83] 319 glabrin B

A. muricata [81] 320 annomuricatin B

A. glabra [84] 321 glabrin C

A. glabra [84] 322 glabrin D

thry1-a1ary1-iso1eucy1- va1y1-g1ycy1-tyry1) cyclo (Pro-Gly-Leu-Val- Ile-Tyr) cyclo (prolyl-S-oxomethyl- valyl-alanyl-valyl-tyrosyl- glycyl-thryl) cyclo (prolyl-aspa-raginyl- alanyl-tryptophyl-leucyl- glycyl-thryl cyclo-(prolyl-glycyl- tyrosyl-valyl-leucyl-alanyl- leucyl-valyl) cyclo (prolyl-prolyl-valyl- tyrosyl-glycyl-prolyl- glutamyl)

A. squamosa 323 cyclosquamosin A cyclo (Gly-Ser-Phe-Gly- Pro-Val-Pro) A. squamosa [102, 143] [102] 324 cyclosquamosin B cyclo (Gly-Leu-Met-Gln- Pro-Pro-Ile-Thr) A. squamosa [102] 325 cyclosquamosin C cyclo (Gly-Leu-Mso-Gln- Pro-Pro-Ile-Thr) A. squamosa 326 cyclosquamosin D cyclo (Ser-Tyr-Tyr-Pro- Gly-Gly-Val-Leu) A. squamosa 327 cyclosquamosin E cyclo (Gly-Gly-Val-Leu- Ser-Tyr-Tyr-Tyr-Pro) A. squamosa [102, 143] [102, 143] [102] 328 cyclosquamosin F cyclo (Gly-Ala-I'ro-Ala- Leu-Thr-Thr-Tyr) A. squamosa [102] 329 cyclosquamosin G cyclo (Gly-Tyr-Pro-Met-

A. squamosa [76] 330 squamtin A

A. cherimola [133] 331 cherimola cyclopeptide A Thr-Ala-Ile-Val) cyclo (Val-Thr-Gly-Tyr- oxo Met-Pro-Ile-Ala) cyclo (Pro-Gln-Thr-Gly- Met-Leu-Pro-Ile) cyclo (Pro-Gln-Thr-Gly- A. cherimola [133, 332 cherimola

cyclopeptide B A. squamosa A. cherimola 143] [131] 333 cherimola cyclopeptide C

334 annomuricatin C Mso-Leu-Pro-Ile) cyclo (Pro-Gly-Ala-Ala- Trp-Ile-Pro) cyclo (Pro–Gly–Phe–Val– Ser–Ala) [43, 129, 132]

A. muricata A. glauca A. montana A. cherimola [130] 335 cherimola cyclopeptide D A. glauca [132] 336 glauca cyclopeptide A A. cherimola [135] 337 cherimola cyclopeptide E A. cherimola [135] 338 cherimola cyclopeptide F cyclo (Pro–Gly– Leu–Asn–Ala–Val–Thr) cyclo (Pro–Gly–Ala–Gly– Val–Val–Leu) cyclo (Pro-Gly- Leu- Gly-Phe-Tyr) cyclo (Pro-Gly-Met-Gly- Ile-Tyr-Leu-Pro-Met) A. squamosa [143] 339 cyclosquamosin H cyclo (Gly-Pro-Thr-Val-

A. squamosa [143] 340 cyclosquamosin I

A. squamosa [143] 341 squamin A

A. squamosa [143] 342 squamin B

A. montana [43] 343 cyclomontanin A

A. montana [43] 344 cyclomontanin B

A. montana [43] 345 cyclomontanin C

A. montana [43] 346 cyclomontanin D

A. reticulata [134] 347 cycloreticulin A

A. reticulata [134] 348 cycloreticulin B

A. reticulata [128] 349 cycloreticulin C

A. squamosa [136] 350

Ala-Asp-Leu) cyclo (Thr-Thr-Tyr-Leu- Gly-Ala-Pro-Ala) cyclo (Pro-(S-oxo)-Met- Tyr-Gly-Thr-Val-Ala-Ile) cyclo (Pro-(R-oxo)-Met- Tyr-Gly-Thr-Val-Ala-Ile) cyclo (Gly-transPro-Thr- Trp-Ala-Asn-Leu) cyclo (Gly-transPro-Thr- Kyn-Ala-Asn-Leu) cyclo (Phe-transPro-cisPro- Thr-Phe-Asn-His-Val-Asn) cyclo-(Pro-Gly-Leu-Pro- Tyr-Ala-Asn) cyclo (Pro-Gly-Asp-Ile- Ser-Ile-Tyr-Tyr) cyclo (Pro-Mso-Tyr-Gly- Thr-Val-Ala-Val) cyclo (Pro-Gly-Gln-Pro- Pro-Tyr-Val) cyclo (Pro-Pro-Tyr-Leu- Pro-Gly-Val) cyclo(Pro-Ile-Tyr-Ala-Gly) A. squamosa [136] 351 fanlizhi cyclopeptide A fanlizhi cyclopeptide B

1.1.2.6. Các hợp chất khác

Ngoài ra, từ chi Annona còn phân lập được ba hợp chất sesquiterpene:

caryophyllene oxide (352), spathulenol (353), selin-11-en-4α-ol (354); một dẫn xuất

của phenol 1-(4-β-D-glucopyranosyloxyphenyl)-2-(β-D-glucopyranosyloxy)-ethane

(363); một diterpene: phytol (364); một phenyl propanoid vòng: pondaplin (355);

một hợp chất flavonoid: rutin (366); bốn steroid: β-sistosterol (356), β-sistosteryl-O-

β-D-glucopyranoside (357), stigmasterol (358) và stigmasteryl-O-β-D-

glucopyranoside (359); ba lignan: eudesmin (360), magnolin (361) và yangambin (362).

Bảng 1.8. Các hợp chất khác từ chi Annona

Loài A. salzmannii A. salzmannii A. salzmannii A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra A. glabra A. pickelii A. pickelii A. pickelii A. squamosa TLTK [45, 50] [45, 50] [45] [93] [99, 124] [72] [99, 124] [72] [50] [50] [50] [141] KH Tên chất 352 caryophyllene oxide 353 spathulenol 354 selin-11-en-4a-ol 355 pondaplin 356 β-sistosterol 357 β-sistosteryl-O-β-D-glucopyranoside 358 stigmasterol 359 stigmasteryl-O-β-D-glucopyranoside 360 eudesmin 361 magnolin 362 yangambin 363 1-(4-β-D-glucopyranosyloxyphenyl)-2-(β- D-glucopyranosyloxy)-ethane

rutin 364 phytol 365 sucrose octaacetate 366 A. pickelii A. cornifolia A. cherimola A. squamosa [50] [90] [52, 74, 141]

355

353

354

352 358 R=H 359 R=Glc

356 R=H 357 R=Glc

360 R1=R6=H; R2=R3=R4=R5=OMe 361 R1=H; R2=R3=R4=R5=R6=OMe 362 R1=R2=R3=R4=R5=R6=OMe

HO O

364

363

AcOH2C

AcO

CH2OAc O

OAc

HO O

OAc

CH2OAc

OAc

365

366

Kết luận:

Những nghiên cứu nêu trên cho thấy đặc điểm nổi bật về thành phần hóa học

của chi Annona chủ yếu là các nhóm chất diterpene khung ent-kaurane, acetogenin

và alkaloid. Thông qua các nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học đặc trưng sẽ

góp phần định hướng cho các nhà thực vật học xác định tên khoa học mẫu thực vật.

1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Annona

1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Theo các nghiên cứu gần đây, các hợp chất ent-kaurane thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào ung thư mạnh. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất ent-

kaur-16-en-19-oic acid (26) được phân lập từ vỏ thân loài A. senegalensis có khả

năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 1,0 µg/mL. Trong khi đó

hợp chất ent-16,17-diacetoxykauran-19-oic acid (16) và ent-19-

carbomethoxykauran-17-oic acid (27) gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3)

với giá trị IC50 lần lượt 17,71 μg/mL và 17,38 μg/mL [53].

Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh các acetogenin thể hiện

hoạt tính với các mức độ khác nhau trên nhiều loại tế bào ung thư như: ung thư

tuyến tụy (PACA-2), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư phổi (A-549), ung thư

gan (Hep G2, SMMC-7721), ung thư vú (MCF-7), ung thư biểu mô phổi (A-549),

ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư dạ dày (MKN-45)… Các acetogenin hoạt động

thông qua sự ức chế rất mạnh NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide

dehydrogenase), vốn là một enzyme căn bản cần thiết cho phức hợp I (complex I)

trong các hệ thống vận chuyển điện tử tại ty lạp thể kể cả của tế bào ung thư, cũng

như làm suy giảm nồng độ Adenosine triphosphate (ATP - chất cần thiết cho hoạt

động của tế bào ung thư) [21, 54].

Năm 1995, năm hợp chất thuộc loại bis-tetrahydrofuran acetogenin mới: 32-

hydroxybullatacin (185), 31-hydroxybullatacin (186), 30-hydroxybullatacin (187)

và (2,4-cis và trans)-28-hydroxybullatacinone (188, 189) được phân lập từ dịch

chiết ethanol của vỏ loài A. bullata. Các hợp chất này ức chế sự phát triển với sáu

dòng tế bào ung thư người (A-549, MCF-7, HT-29, A-498, PC-3 và PACA-2) [63],

Tiếp theo, hai acetogenin, murihexocin A và B (180, 181), được phân lập từ lá của

loài A. muricata, ức chế đáng kể sáu dòng tế bào ung thư người, đặc biệt ức chế

mạnh dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) với giá trị IC50 0,017 μg/mL) và

tuyến tụy (PACA-2) với giá trị IC50 0,0973 μg/mL) [147]. Hợp chất coriadienin (80)

từ rễ loài A. coriacea lại cho thấy khả năng gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB (ED50 1,9×10-6 μg/mL) [100].

Kết quả nghiên cứu về hạt loài A. muricata, hợp chất cis-annonacin (89) gây

độc trên dòng tế bào ung thư ruột kết (HT-29), mạnh hơn 10.000 lần so với

adriamycin, một thuốc đang được dùng điều trị ung thư [115]. Kết quả nghiên cứu

của Zheng và cộng sự cho thấy hợp chất annopentocin A (116) gây độc trên dòng tế

bào PACA-2, hợp chất annopentocin B, C (117, 118) gây độc đối với tế bào A-549

[146]. Trong các nghiên cứu của Hopp và cộng sự, bốn hợp chất (2,4-cis/trans)-

mosinone A (122), mosin B (123), mosin C (124) và annoreticuin-9-one (125) đều

thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư PACA-2, mạnh hơn từ 10-

100 lần so với adriamycin [69]. Hợp chất (2,4 cis và trans)-squamoxinone (160)

cũng thể hiện hoạt tính đầy hứa hẹn đối với dòng tế bào PACA-2 [68], hợp chất

bullacin B (192) gây độc chọn lọc dòng tế bào MCF-7 mạnh hơn khoảng một triệu

lần so với adriamycin [70]. Trong một nghiên cứu khác, hợp chất 125 cũng được

phát hiện có khả năng gây độc tế bào trên các dòng PACA-2, PC-3 và A-549 [114].

Bốn hợp chất acetogenin mới là annomuricin E (140), muricapentocin (139),

muricoreacin (141) và murihexocin C (142) được phân lập bởi Kim và cộng sự đã

được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 6 dòng tế bào ung thư (A-549, MCF-7,

HT-29, A-498, PC-3 và PACA-2). Kết quả cho thấy 2 hợp chất 139, 140 gây độc

mạnh trên dòng tế bào PACA-2 và HT-29 [80], 2 hợp chất 141 và 142 gây độc

mạnh trên dòng tế bào PACA-2 và PC-3 [79]. Purpuracenin (182) và annoglaucin

(183) cũng đã được phát hiện có khả năng ức chế sự phát triển của 6 dòng tế bào

ung thư nói trên [30]. Các hoạt động gây độc tế bào của carolin A, B và C (205-

207) đã được nghiên cứu và so sánh với squamocin (208) và spinencin (204). Cả

năm acetogenin này được phát hiện có hoạt tính cao hơn đáng kể trên dòng tế bào

ung thư (KB) so với dòng tế bào thường (VERO) [112]. Đến năm 2001 Chang và

Wu phân lập được bảy hợp chất acetogenin mới là muricin A-G (152-156, 106, 107)

cùng năm hợp chất đã biết từ loài A. muricata. Tất cả các acetogenin này đều có tác

dụng ức chế sự phát trển dòng tế bào gan (Hep G2) [27]. Từ một loài khác là A.

cherimolia, hai acetogenin: annomolin (135) và annocherimolin (108) được phân

lập. Cả hai hợp chất này đều thể hiện khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư

mạnh trên các dòng tế bào PC-3, MCF-7 và HT-29 [78]. Từ hạt của loài A.

miricata, ba acetogenin mới, muricin H (157), muricin I (113), và cis-annomontacin

(101) thể hiện hoạt tính độc tế bào gan Hep G2 [87]. Hai acetogenin mới, (+)-

monhexocin (62) và (-)-monhexocin (63) cùng với bốn acetogenin đã biết,

montalicin G (163), H (164), monlicin A, B (165, 166) và được phân lập từ hạt loài

A. montana đều thể hiện khả năng gây độc mạnh trên dòng tế bào gan (Hep G2) [88].

Một hợp chất phenylpropanoid vòng, pondaplin (343) đã được phân lập từ

dịch chiết ethanol của lá loài A. glabra có hoạt tính ức chế sự phát triển các dòng tế

bào ung thư ở mức độ trung bình [93]. Các cyclopeptide cũng thể hiện hoạt tính gây

độc tế bào KB đáng kể như cherimolacyclopeptide C (321) với giá trị IC50 0,072

µM [131].

Năm 2008, nhóm nghiên cứu của tác giả Cochrane đã công bố hoạt tính

chống ung thư trên các dòng tế bào ung thư máu của các dịch chiết ethanol mẫu lá,

thịt quả và hạt của loài na biển (A. glabra). Kết quả cho thấy, các cặn chiết ethanol

ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư máu kháng thuốc nhưng lại không gây độc

trên dòng tế bào lympho thường [8].

Theo công bố năm 2012 của Chen, dịch chiết hạt loài A. squamosa có hoạt

tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư gan in vitro và in vivo cho thấy đây là dịch

chiết tiềm năng để phát triển các thuốc trị ung thư gan mới [38].

1.1.3.2. Hoạt tính kháng viêm

Viêm là một chuỗi các hiện tượng do nhiều tác nhân như nhiễm trùng, các

phản ứng miễn dịch, tổn thương do nhiệt hoặc vật lý... gây ra các dấu hiệu lâm sàng

đặc trưng: sưng, nóng, đỏ, đau. Phương pháp điều trị hiện nay thường liên quan đến

thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs). Các chất kháng viêm hầu hết hoạt động

dựa trên cơ chế kìm hãm hoạt động của các enzyme xúc tác cho quá trình tạo các

chất gây viêm như cyclooxygenase (COX) làm giảm tổng hợp PGE2 và F1α là chất

trung gian hóa học của phản ứng gây viêm, hoặc làm bền màng lisosom (thể tiêu

bào) ngăn cản giải phóng các enzyme phân giải nên ức chế quá trình viêm, hoặc ức

chế vận chuyển bạch cầu...

Kết quả nghiên cứu về khả năng chống viêm của 6 hợp chất phân lập từ dịch

chiết methanol của hạt loài A. montana, cho thấy 3 hợp chất cyclomontanin A, C, D

(343, 345, 346) thể hiện tác dụng ức chế sản sinh các cytokine tiền viêm, kích thích

bởi lipopolysaccharide và J774A.1 Pam3Cys trong điều kiện đại thực bào [43, 143].

Trong quá trình tìm kiếm các dịch chiết từ vỏ loài A. squamosa có khả năng

giảm đau và kháng viêm trên chuột, Chavan và cộng sự đã phát hiện được dịch

chiết n-hexane có các tác dụng này ở liều 50,0 mg/kg. Nghiên cứu sâu hơn đã phát

hiện hợp chất caryophyllene oxide (352) có khả năng giảm đau và kháng viêm ở các

liều 12,5 và 25,0 mg/kg thể trọng, tương đương với aspirin [29].

Năm 2014, Wu và cộng sự đã phát hiện ra 2 hợp chất fanlizhicyclopeptide

A-B (350, 351) có khả năng ức chế sự sản sinh các cytokine gây viêm TNF-α và IL-

6 [136].

1.1.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 1995, Padmaja phát hiện được phân đoạn n-hexane của vỏ thân loài na

biển (A. glabra) thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng nấm và côn trùng. Từ

phân đoạn này, nhóm nghiên cứu đã phân lập được hợp chất ent-kaur-16-en-19-oic

acid (26) chiếm hàm lượng lớn và dự đoán hợp chất này có thể đóng vai trò quan

trọng quyết định hoạt tính của dịch chiết vỏ thân loài na biển (A. glabra). Kết quả

nghiên cứu cho thấy hợp chất 26 có khả năng ức chế sự phát triển mạnh 2 chủng vi

sinh vật Staphylococcus pyogenes, Pseudomonas pyocyaneae và 3 chủng nấm mốc

Aspergillus niger, Penicillium notatum, Trichophyton mentagrophytes [107].

Nghiên cứu về kháng khuẩn của Padhi đã phát hiện cả ba dịch chiết methanol, n-

hexane và dịch chiết nước của lá loài A. squamosa ức chế sự phát triển các chủng vi

khuẩn Gram (-), Gram (+), Bacillus epidermidis, Staphylococcus aureus và Vibrio

alginolyticus [105].

Theo nghiên cứu của Dang và cộng sự, dịch chiết methanol từ hạt loài A.

squamosa có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của 2 loại nấm Phytophthora

infestans và Puccinia recondita. Nghiên cứu sâu hơn nhóm đã phân lập được hai

hợp chất squamocin (208) và squamostatin A (219) ức chế sự phát triển của 2 loại

nấm này [48]. Hợp chất 9-hydroxy-folianin (229) từ hạt loài A. cornifolia đã ức chế

sự phát triển của chủng nấm Paracoccidioides brasiliensis với giá trị IC50 là 3,4

μg/mL, mạnh hơn trimethropin-sulfamethoxazole (thuốc đang được dùng điều trị

nhiễm khuẩn) [90].

1.1.3.4. Hoạt tính kháng virus và ký sinh trùng

Trong nghiên cứu về khả năng kháng virus, Padma và cộng sự đã phát hiện

dịch chiết ethanol từ loài A. muricata thể hiện hoạt tính chống lại virus Herpes

simplex-1 với giá trị IC50 là 1 mg/mL [106]. Một nghiên cứu khác của Wu đã tìm ra

hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (13) từ quả loài A. squamosa thể

hiện khả năng ức chế sự sao chép virus HIV trong tế bào lympho H9 với giá trị IC50

0,8 µg/mL [138]. Từ một loài khác là A. glabra, Chang và cộng sự đã phát hiện ra

hợp chất 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (14) ức chế quá trình phiên mã

ngược của virus HIV [25].

Theo nghiên cứu của Jaramillo, dịch chiết n-hexane, ethyl acetate và

methanol từ loài A. muricata ức chế sự phát triển ký sinh trùng Leishmania

braziliensis và Leishmania panamensis [73]. Trong nghiên cứu khác, hợp chất

liriodenine (290) và anonaine (284) có khả năng ức chế sự phát triển của ký sinh

trùng Leishmania và Trypanosoma cruzi [44, 110]. Ngoài ra, 3 alkalioid, N-

hydroxyannomontine (253), annomontine (254) và O-methylmoschatoline (287)

cũng đã được phát hiện có khả năng ức chế sự phát triển ký sinh trùng Leishmania

[44].

1.1.3.5. Hoạt tính chống oxy hóa

Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá

trình oxi hóa chất khác. Sự oxi hóa có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng

dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này

bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính

chúng.

Có nhiều thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxi hóa, trong đó thử nghiệm

chống oxi hóa dựa theo phương pháp DPPH thông qua phản ứng bao vây gốc tự do.

Phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) có khả năng tạo ra các gốc tự

do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp

này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm

cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được

đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng

khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm.

Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa từ loài A. squamosa, Nandhakumar đã

phát hiện dịch chiết methanol có khả năng thu dọn gốc tự do DPPH (97,99 % ),

LPO (94,15 %) [65, 104]. Từ loài khác là A. cornifolia, Luciana và cộng sự đã phát

hiện dịch chiết ethanol và các acetogenin phân lập từ loài này có khả năng chống

oxi hóa DPPH mạnh tương đương axit ascorbic [89].

1.1.3.6. Hoạt tính khác

Từ lá loài A. purpurea, 5 hợp chất bao gồm 7-hydroxy-

dehydrothalicsimidine (271), thalicsimidine (273), norpurpureine (274), lirinidine

(243) và N-methylasimilobine (244) có khả năng ức chế tụ tiểu cầu [28].

Trong nghiên cứu về khả năng trị bệnh đái tháo đường được gây ra bởi

streptozotocin - nicotinamide trên chuột của Shirwaikar. Kết quả theo dõi nồng độ

glucose lúc đói, nồng độ insulin và lipid trong huyết thanh, sự thay đổi trọng lượng

cơ thể, mức glycogen trong gan và mức TBARS trong tụy đã được đánh giá cho

thấy dịch chiết nước từ lá loài A. squamosa có khả năng làm hạ đường huyết và

chữa bệnh đái tháo đường tuýp 2 [120]. Theo một nghiên cứu khác, dịch chiết

ethanol từ lá loài này cũng có khả năng hạ đường huyết và đái tháo đường tuýp 2

trên chuột và thỏ với liều 350 mg/kg trọng lượng [64].

Hai hợp chất 270 và 300 phân lập từ loài A. squamosa đã thể hiện khả năng

ức chế hoạt động của enzyme Hydrogen Potassium ATPase (hydro-kali adenosin

triphosphatase còn gọi là bơm proton) của tế bào thành dạ dày tốt hơn thuốc

omeprazole (hiện đang dùng trong điều trị đau dạ dày, tá tràng) [75].

Nghiên cứu về khả năng diệt côn trùng, hợp chất ent-kaur-16-en-19-oic (26)

ức chế sự phát triển của mọt khoai tây Cylas formicarius ở nồng độ 1% [107].

Trong nghiên cứu của Tsai và cộng sự, bốn hợp chất alkaloid dạng muối (7S,14S)-(-

)-N-methyl-10-O-demethylxylopinine (267), pseudocolumbamine (260), palmatine

(263) và pseudopalmatine (264) thể hiện hoạt tính kháng enzyme

acetylcholinesterase (AChE) với giá trị IC50 lần lượt là 8,4, 5,0, 0,4 và 1,8 μM

[123].

Ba hợp chất lanuginosine (292), (+)-O-methylarmepavine (249), N-methyl-

6,7-dimethoxyisoquinolone (307) được Soni công bố có khả năng kích thích miễn

dịch thông qua hình thức tăng sinh tế bào B và T, tăng sự điều tiết các kháng

nguyên biệt hóa là CD4, CD8 và CD19. Hợp chất 307 được đánh giá có hoạt tính

cao nhất với giá trị 3,0 mg/kg thể trọng [121].

Năm 2014, kết quả thử nghiệm tác dụng diệt cỏ của Matsumoto và cộng sự

cho thấy các hợp chất 26, 49, 27 và 230 có hoạt tính mạnh, đặc biệt là hợp chất 49 thể hiện tác dụng rất mạnh với giá trị 95% ức chế tại nồng độ 10-3 M [99].

Kết luận:

Các hợp chất phân lập được từ chi Annona đã thể hiện nhiều hoạt tính đa

dạng và hữu ích như: hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng

viêm, giảm đau... Phần lớn các hợp chất thể hiện hoạt tính trên đều thuộc lớp chất

ent-kaurane, acetognin hoặc lớp chất alkaloid, điều này cũng góp phần cho định

hướng về chi khi nghiên cứu thành phần hóa học và cũng định hướng cho chúng tôi

khi nghiên cứu loài A. glabra.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI NA BIỂN

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Annona glabra Linn.

Tên Việt Nam: na biển, nê, bình bát nước, lê dại

Chi: Annona

Họ: Na (Annonaceae)

Đặc điểm mô tả: Na biển (A. glabra) là cây gỗ nhỏ, cao 2-5 m, cành ít phân

nhánh, dáng giống mãng cầu xiêm, lá không có lông, lá xoan hay xoan tròn dài, gân

bên 8-9 đôi. Hoa màu vàng, rộng 2 cm, lá đài xanh dài khoảng 5 mm, hoa có 6 cánh

dài 2-3 cm, có bớt đỏ ở trong và có nhiều nhị. Quả dài 7-10 cm, hình trứng, vỏ

nhẵn, vàng xanh, không gai, nạc, thịt trắng. Hạt màu nâu nhạt [2, 4, 47].

Hình 1.2. Loài na biển (Annona glabra Linn.)

Phân bố: Loài này phân bố chủ yếu ở châu Mỹ và Đông Nam Á. Ở Việt

Nam, cây mọc hoang ở các tỉnh ven biển từ Quảng Ninh vào Quảng Nam (Cù lao

Chàm) và các tỉnh Nam Bộ [2].

Sinh học và sinh thái: Mùa hoa quả gần như quanh năm. Cây mọc dựa

nước, bên bờ các kênh rạch, dọc bờ biển [1].

1.2.2. Công dụng

Quả na biển (A. glabra) chín ăn được. Gỗ nhẹ, dùng làm thuyền đánh cá.

Cây con có thể dùng làm gốc ghép cho các loài Na khác ở những vùng đất thường

xuyên ẩm ướt [1]. Lá na biển (A. glabra) có tính hàn, có tác dụng bổ âm, hút mủ,

giải cường nhiệt, ban đỏ, nhuận phế, mát gan, giải khát. Lá được dùng trị viêm khí

quản mạn tính. Dịch lá cây dùng để trừ chấy. Hạt nghiền nát có tính làm săn da, sát

trùng. Hạt thường dùng trị ỉa chảy, trị kiết lỵ và làm thuốc sát trùng. Vỏ cây giã ra

cũng có công dụng tương tự. Toàn cây dùng làm thuốc trị thũng lựu (u bướu) [2].

1.2.3. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) trên thế giới

Thống kê cho thấy có khoảng 84 hợp chất được phân lập từ loài na biển (A.

glabra) trong đó chủ yếu là hợp chất diterpenoid ent-kaurane (khoảng 32 hợp chất)

còn lại là các hợp chất thuộc các lớp chất acetogenin (23 hợp chất), alkaloid (20 hợp

chất), peptide vòng (4 hợp chất) và các hợp chất khác (5 hợp chất).

Từ quả loài A. glabra, hai hợp chất diterpenoid ent-kaurane mới là

annoglabasin A (32) và annoglabasin B (49) cùng với mười một hợp chất đã biết (4,

5, 7, 14, 15, 26, 35, 39, 41, 47, 51) được phân lập và xác định cấu trúc [25]. Nhóm

tác giả này đã công bố ba hợp chất diterpenoid ent-kaurane mới là annoglabasin C

(23), annoglabasin D (40) và annoglabasin E (46), một hợp chất nor-kaurane

diterpenoid mới annoglabasin F (6) cùng với mười ba hợp chất đã biết được phân

lập vào năm 2000 trong đó hợp chất 16α-methoxy-ent-kauran-19-oic acid (24) và

16α-hydro-ent-kauran-17,19-dimethyl ester (28) lần đầu tiên được phân lậ p từ tự

nhiên [36]. Đặc biệt, một hợp chất dimeric khung nor-ent-karane ít gặp là

annoglabayin (55) tiếp tục được phân lập từ quả loài này [31]. Cũng từ quả loài A.

glabra một hợp chất ent-kaurane mới annoglabasin G (48) cùng 27 hợp chất đã biết

được phân lập với 18 hợp chất khung ent-kaurane (4, 5, 7, 13, 14, 15, 21, 25, 26, 31,

33, 36, 37, 38, 46, 48, 49, 52, 53), bốn acetogenin: annomontacin (98), annonacin

(96), isoannonacinone (162) và squamocin (208); bốn steroid, β-sistosterol (356),

D-glucopyranoside (359) và một oxoaporphine, liriodenine (290) [72]. Năm 1998,

stigmasterol (358), β-sistosteryl-O-β-D-glucopyranoside (357) và stigmasteryl-O-β-

nhóm tác giả Gallardo đã phân lập được một hợp chất acetogenin mới là glabranin

(109) cùng mười một hợp chất tetrahydrofuran acetogenin đã biết (110, 111, 112,

96, 97, 99, 100, 198, 199, 200, 201) từ hạt A. glabra [54]. Cũng trong năm này

nhóm tác giả Liu XX công bố 4 hợp chất tetrahydrofuran acetogenin mới là glacin

A (131), glacin B (132), glabracin A (195), glabracin B (196) cùng các acetogenin

khác javoricin (93), bullatanocin (221) cũng từ loài A. glabra. Cấu trúc của các chất

mới được đưa ra dựa trên phân tích phổ và phương pháp Mosher [91, 92]. Sang năm

1999, Liu và cộng sự đã công bố bốn hợp chất acetogenin mới và hiếm gặp là

annoglaxin (130), 27-hydroxybullatacin (184), annoglacin A, B (133, 134) từ lá loài

A. glabra [94, 95]. Hợp chất 130 có cấu trúc độc đáo với nhóm OH ở C-8 và nhóm

cacbonyl ở C-12 thể hiện hoạt tính mạnh trên dòng tế bào ung thư vú MCF7, trong

khi đó hợp chất 184 thể hiện hoạt tính trên các dòng tế bào A-498, PC-3 và PACA-

2 mạnh hơn ít nhất 100.000 lần so với adriamycin [95], hợp chất 133, 134 hiện hoạt

tính trên các dòng tế bào MCF-7 và PACA-2 mạnh hơn tương ứng 1.000 và 10.000

lần so với adriamycin [94]. Ngoài ra, một số hợp chất peptide vòng và alkaloid cũng

được phân lập từ loài na biển (A. glabra) [83, 84, 123].

1.2.4. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) ở Việt Nam

Mặc dù loài na biển (A. glabra) là một cây thuốc quý, đã được sử dụng trong

y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh khác nhau. Các nghiên cứu về thành phần hóa

học đã công bố trên thế giới cho thấy loài này chứa nhiều lớp chất quý có cấu trúc

độc đáo, đặc biệt là lớp chất diterpenoid ent-kaurane và acetogenin. Các nghiên cứu

đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy một số hợp chất đã được phân lập từ loài này

thể hiện hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm như: hoạt tính gây độc tế bào, ức chế

enzyme phiên mã ngược của HIV.... Tuy nhiên, hiện rất ít các công trình khoa học

trong nước công bố cả về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây thuốc

quý này. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Minh Hợi thuộc Viện Sinh

thái và Tài nguyên sinh vật cùng các cộng sự ở trường Đại học Vinh đã nghiên cứu

từ hạt loài A. glabra xác định được 6 hợp chất là axit béo, chiếm hầu hết tổng hàm

lượng dầu béo. Trong đó, các hợp chất n-hexadecanoic (50,9%), 9-octadecenoic

(28,0%) và 10-octadecenoic (15,6%) là các hợp chất chính [5]. Một nghiên cứu về

tinh dầu của lá loài A. glabra cho thấy hàm lượng tinh dầu chiếm 0,1% trọng lượng

tươi. 35 hợp chất được tìm thấy chiếm 83,9% tổng trọng lượng tinh dầu trong đó

thành phần chủ yếu trong tinh dầu gồm β-caryophyllen (21,5%) và germacren D

(17,7%) [3].

Việc nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần

làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học cũng nh ư các kinh nghiệm sử dụng cây thuốc

này trong dân gian và đặc thù loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên

cứu ứng dụng tiếp theo.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. MẪU THỰC VẬT

Mẫu lá, quả loài na biển (Annona glabra) được thu hái vào tháng 5 năm

2013 tại thành phố Hồ Chí Minh. Tên khoa học được TS. Bùi Văn Thanh, Viện

Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (AG1605) được lưu trữ

tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Mẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của loài na biển (A. glabra)

2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai

bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10%

được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

F254 (105875, Merck), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm

và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch sulforic acid

10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng

chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh

trong dung môi thích hợp.

2.2.3. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường với kích

thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); pha đảo sử dụng loại YMC có cỡ hạt là

30-50 µm (Fuji silysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical

Indutries Co., Ltd.).

2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC

Để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sử dụng kết hợp xác định các

thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại đồng thời kết hợp phân tích, tra

cứu tài liệu tham khảo. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm:

2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh

biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.2. Độ quay cực ([α]D)

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện

Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.3. Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy Agilent 1100 của

Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass

spectrophotometer tại Viện Hóa học , Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)

Phổ NMR đo trên máy Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS),

tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm: • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY.

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi C5D5N, CD3OD, CDCl3. Việc

lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung

môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

2.3.5. Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD được đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied

Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Hàn Quốc.

2.3.6. Phương pháp xác định đường

Các hợp chất được tiến hành thuỷ phân trong môi trường axit. Sau khi thuỷ

phân, phần đường tách ra được silyl hoá để nhận dạng. Các bước tiến hành như sau:

Cân mỗi mẫu 2 mg hoà tan trong 1,0 ml dung dịch HCl 1N (HCl trong

dioxane/nước, 1:1, v/v). Đun nóng cách thuỷ, có lắp sinh hàn hồi lưu ở nhiệt độ 80oC, trong 3 giờ. Sau đó để nguội dung dịch, trung hoà bằng dung dịch bạc

cacbonat. Sau khoảng 1 giờ (cho AgCl kết tủa hết), lọc bỏ chất rắn thu lấy dung

dịch. Dung dịch thu được có thể làm khô bằng khí N2 (trong khoảng thời gian từ 2 - 3 giờ) hoặc cô quay trong chân không với nhiệt độ nồi cách thuỷ là 40oC. Đem hỗn

hợp chiết bằng CHCl3 (0,5 ml CHCl3 + 0,5 ml nước, thực hiện chiết lặp lại 2 lần).

Loại bỏ lớp CHCl3, thu lấy lớp nước, sau đó làm khô bằng khí N2 rồi cô quay trong

chân không. Tiếp tục hoà tan cặn rắn này bằng 0,1 ml pyridine và thêm vào đó L- cysteine metyl este hydrochloride 0,06 M. Đun hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong bình

cách thuỷ có lắp sinh hàn, tiến hành trong 2 giờ. Tiếp tục thêm 0,1 ml trimethylsilylimidazole và đun tiếp hỗn hợp phản ứng trong 1,5 giờ ở 60oC. Phân bố

hỗn hợp phản ứng trong hệ dung môi n-hexan:nước (0,1ml x 2 lần), thu lấy phần n-

hexan.

Với các đường chuẩn cũng tiến hành các thực nghiệm tương tự như trên.

Các dẫn xuất silyl hóa của các đường được đối chiếu với các dẫn xuất silyl

hóa của các đường chuẩn bằng phương pháp GC.

Chương trình chạy GC: Máy GC - model: Shimazu-2010; cột: SPB-1 (0,25 mmx30m); detector FID: 300oC; khí mang: He 30ml/phút; nhiệt độ cột: 210oC; nhiệt độ buồng tiêm: 270oC.

Máy GC - model Shimazu-2010 Khoa Dược, Đại học Chungnam, Hàn Quốc.

2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

2.4.1.1. Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc dòng tế bào HL-60, HEL-299 được thực hiện tại Khoa

Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.

Hoạt tính gây độc dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2, KB được thực hiện

tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam.

Ảnh hưởng của các hợp chất đến sự tăng trưởng của tế bào ung thư được xác

định bằng cách kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào thông qua sử dụng chất 3-[4,5-

dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Các tế bào ung thư

và tế bào thường HEL-299 được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS, 100 U/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin trong điều kiện 370C và CO2 5%. Thí nghiệm MTT được tiến hành như sau: các tế bào ung thư người (3x105

tế bào/mL) được xử lý với 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 µM của các hợp chất cũng

như mitoxantrone, ellipticine trong 3 ngày. Sau thời gian ủ, 0,1 µg MTT được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 4h ở 370C. Các đĩa tế bào sau đó được ly tâm ở tốc độ

1000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó môi trường nuôi cấy được hút bỏ.

Dimethylsulfoxide (150 µL) được thêm vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể

formazan. Các đĩa sau đó được đọc ở bước sóng 540 nm sử dụng máy đọc micro-

plates (Amersham Pharmacia Biotech., USA). Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và

các giá trị trung bình được tính toán.

Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử

tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0),

DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công

thức:

% ức chế= 100% - CS%

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel

để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo

công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ

σ =

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm

tiếp để tìm giá trị IC50.

Giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình

Table curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ

chất thử để tính giá trị IC50.Kết quả tính được là phần trăm ức chế-thể hiện bằng sự

giảm hấp thụ của các mẫu được xử lý với chất thử so với đối chứng không được xử

lý với chất thử. Đường cong hoạt tính theo nồng độ được xây dựng và nồng độ gây

ức chế 50% tế bào được xác định cho mỗi hợp chất.

2.4.1.2. Phân tích hình thái của các tế bào chết theo chương trình sử dụng chất

nhuộm Hoechst 33342

Để xác định các tế bào chết theo chương trình, các tế bào HL-60 được cấy ở mật độ 3x105 tế bào/mL trên các đĩa 24 giếng. Sau 24h ủ để các tế bào bám vào đáy

giếng, các tế bào được xử lý trong 24h hoặc 48h với nồng độ IC50 của hợp chất 18

và 22. Các tế bào sau đó được ủ với Hoechst 33342 (chất này được pha loãng vào môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ 10µg/mL) ở 370C trong 20 phút. Sau đó các đĩa

nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang IX-71 Olympus camera và

ảnh được chụp lại (độ phóng đại x200) tại Khoa Dược , Đại học Qu ốc gia

Chungnam, Hàn Quốc.

2.4.1.3. Western Blot

Các tế bào HL-60 (3x105 tế bào/mL) được xử lý với hợp chất 18 và 22 ở nồng

độ IC50 trong 24h và 48h. Sau đó các tế bào được thu lại, rửa 2 lần với PBS lạnh. Các

tế bào sau đó được phân giải với dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM

NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol,

1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 25 μg/mL aprotinin, 25 μg/mL leupeptin, 1%

Nonidet P-40) và giữ trên đá trong 30 phút. Dung dịch các tế bào đã được làm vỡ sau đó được ly tâm ở 15000 rpm, 40C trong 15 phút. Phần dịch nổi phía trên được lưu lại ở nhiệt độ -200C cho tới khi được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Nồng độ

Protein được xác định bằng thí nghiệm Bradford. Một lượng bằng nhau của Protein

được điện di trên 8-10% gel SDS-PAGE và sau đó được chuyển lên màng

polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bằng

dung dịch đệm glycine chuyển màng (192 mM glycine, 25 mM Tris-HCl [pH 8,8],

và 20% MeOH [v/v]) với hiệu điện thế 100V trong 2h. Sau khi “blocking” với 5%

nonfat dried milk, màng được ủ với kháng thể cấp 1 nhận biết PARP (1:1000),

Caspase 3 dạng phân cắt (1:1000), Bcl-2 (1:500), Bax (1:1000), P-AKT (1:1000),

C-myc (1:1000) và β-actin, sau đó màng tiếp tục được ủ với kháng thể cấp 2 HRP

(1:5000 Vector Laboratories, Burlingame, VT, USA) ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng

màng được phơi sáng với X-ray film (AGFA, Bỉ) và các băng protein được xác định bởi WEST-ZOL® plus Western Blot Detection System (iNtRON, Gyeonggi-do, Hàn

Quốc).

2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Hoạt tính kháng viêm được thực hiện tại Khoa Dược , Đại học Qu ốc gia

Chungnam, Hàn Quốc.

Để đánh giá tác dụng ức chế của các hợp chất đã phân lập đối với sự sản sinh

NO trong điều kiện đại thực bào RAW 264.7 được kích thích với LPS, các tế bào được cấy trên đĩa nuôi cấy 24 giếng với mật độ 5x105 tế bào/mL. Sau 3h, các tế bào

được xử lý với các hợp chất ở các nồng độ khác nhau trong 24h trong điều kiện có

hoặc không có LPS với nồng độ 1µg/mL. Nồng độ Nitrite được xác định trong môi

trường nổi bởi phản ứng Griess. Đầu tiên, các hợp chất được kiểm tra độ độc của

chúng đối với các tế bào ở nồng độ 30 µM.

Sau đó, mỗi hợp chất được sàng lọc về tác dụng của chúng đối với sự sản

sinh NO của các tế bào RAW 264.7-khi đã bị kích ứng với LPS. Quá trình sàng lọc

này được tiến hành ở các nồng độ 3, 10 và 30 µM của các hợp chất bởi vì không có

tác dụng độc tính đáng kể nào được tìm thấy trên các tế bào. Trong điều kiện không

có mặt của các chất thử và LPS, NO được sản sinh với nồng độ rất ít (3,16 ± 0,27

µM). LPS có tác dụng làm tăng mạnh sản sinh NO với nồng độ 14,48 ± 0,43 µM.

Để có được giá trị IC50 của các hợp chất có tính ức chế cao, hoạt tính ức chế phụ

thuộc vào nồng độ đã được kiểm tra. Các nồng độ thích hợp của mỗi hợp chất được

ước lượng từ các kết quả sàng lọc và được sử dụng cho thí nghiệm kiểm tra hoạt

tính phụ thuộc nồng độ.

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI NA BIỂN

Để định hướng cho việc phân lập các hợp chất, một lượng nhỏ mẫu lá, quả loài na biển (A. glabra) được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 40oC. Các mẫu

đã được nghiền mịn, ngâm chiết methanol có sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm.

Các dịch chiết methanol từ lá và quả loài na biển tiếp tục được chiết phân bố trong

n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Các dịch chiết tổng và phân đoạn từ lá

và quả na biển được thử sàng lọc hoạt tính với 2 dòng tế bào ung thư phổi (LU-1)

và ung thư biểu mô (KB). Kết quả trên Bảng 4.24 cho thấy các phân đoạn từ quả thể

hiện hoạt tính mạnh hơn các phân đoạn từ lá. Đồng thời hai phân đoạn

dichloromethane và nước từ quả đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn

phân đoạn khác. Từ kết quả kiểm tra này đã giúp định hướng phân lập các chất tập

trung vào hai phân đoạn dichloromethane và nước từ quả loài na biển.

Quả loài na biển (A. glabra) được thái nhỏ, sấy khô, nghiền mịn thu được 4,0

kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 5 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và

cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 300 g cặn chiết methanol. Cặn

chiết này được hòa tan vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-

hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Các dịch chiết n-hexane,

dichloromethane, ethyl acetate được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu

được các phân đoạn n-hexane (AG1, 51,0 g), dichloromethane (AG2, 190,5 g),

ethyl acetate (AG3, 3,5 g) và lớp nước (AG4, 54,0 g).

Phân đoạn dichloromethane AG2 được hòa tan bằng dichloromethane với

lượng tối thiểu, tẩm với silica gel (1/2,5, m/m), trộn đều, cất loại dung môi đến khô,

nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải

gradient n-hexane/ethyl acetate (100/1 → 1/100, v/v) thu được 4 phân đoạn AG2.1-

AG2.4.

Phân đoạn AG2.2 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha

thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (4/1, v/v) thu được 3 phân

đoạn nhỏ hơn, AG2.2.1- AG2.2.3. Phân đoạn AG2.2.1 được đưa lên cột pha đảo với

hệ dung môi rửa giải bằng acetone/nước (3,0/1,0, v/v) thu được các hợp chất 6 (51,0

mg), 7 (321,0 mg) và 11 (217,0 mg). Phân đoạn AG2.2.2 được đưa lên cột pha đảo

với hệ dung môi rửa giải bằng acetone/nước (4/1, v/v) thu được các hợp chất 22

(400 mg).

Phân đoạn AG2.4 tiếp tục được phân tách thành 3 phân đoạn AG2.4.1-

AG2.4.3 bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-

hexane/acetone (2/1, v/v). Phân đoạn AG2.4.1 được tinh chế bằng cột kí silica gel

pha đảo với hệ dung môi acetone/nước (5/1, v/v) thu được hợp chất 8 (7,0 mg) và 9

(10,0 mg). Hợp chất 12 (9,0 mg) và 19 (7,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân

đoạn AG2.4.2 bằng cột sắc ký silica gel pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải

acetone/nước (3/1, v/v).

Dịch nước được cô quay loại bỏ ethyl acetate sau đó đưa lên cột Diaion HP-

20, loại bỏ đường bằng nước sau đó tăng dần nồng độ methanol trong nước (25, 50,

75 và 100% methanol) thu được 4 phân đoạn, AG4.1− AG4.4.

Phân đoạn AG4.1 được đưa lên cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18 với hệ

dung môi rửa giải acetone /nước (1/2, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn, AG4.1.1-

AG4.1.3. Phân đoạn AG4.1.1 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha

thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (15/1, v/v) thu được

hợp chất 10 (10,0 mg) và hợp chất 13 (5,0 mg). Hợp chất 16 (6,0 mg) và 18 (5,0

mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn AG4.1.2 bằng cột sắc ký silica gel pha

thường sử dụng hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (15/1, v/v). Hợp

chất 14 (8,0 mg), 20 (6,0 mg) và 21 (7,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn

AG4.1.3 bằng cột sắc ký silica gel pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải

acetone/nước (3/1, v/v).

Phân đoạn AG4.3 được phân tách bằng cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung

môi dichloromethane/methanol (6/1, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn AG4.3.1−

AG4.3.3. Phân đoạn AG4.3.1 được đưa lên cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18 với

hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1,5, v/v) thu được hợp chất 1 (5,0 mg) và 4

(3,0 mg). Phân đoạn AG4.3.2 được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi

dichloromethane/ethyl acetate (10/1, v/v) thu được 2 phân đoạn AG4.3.2.1 và

AG4.3.2.2. Ba hợp chất 2 (4,0 mg), 3 (3,0 mg) và 5 (6,0 mg) thu từ phân đoạn

AG4.3.2.1 bởi cột silica gel pha đảo với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v). Hai

hợp chất 15 (5,0 mg) và 17 (5,0 mg) thu từ phân đoạn AG4.3.2.2 bởi cột silica gel

pha đảo với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v).

Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A. glabra)

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước

3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT

Dα : –64,9 (c 0,1, MeOH).

3.2.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực[ ]25 Nhiệt độ nóng chảy: 298-299oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1. HR-ESI-MS: m/z 375,2159 [M+Na]+. Tính toán lý thuyết [C20H32O5Na]+: 375,2142. Công thức phân tử C20H32O5, M = 352.

3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Dα : –40,7 (c 0,1, MeOH);

Độ quay cực[ ]25 Nhiệt độ nóng chảy: 185-186oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.2. HR-ESI-MS: m/z 521,2732 [M+Na]+. Tính toán lý thuyết [C26H42O9Na]+: 521,2721. Công thức phân tử C26H42O9, M = 498.

3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-

Dα : –38,5 (c 0,1, MeOH).

glucopyranoside ester (mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực[ ]25 Nhiệt độ nóng chảy: 280-281oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.3. HR-ESI-MS: m/z 519,2550 [M+Na]+. Tính toán lý thuyết [C26H40O9Na]+: 519,2565. Công thức phân tử C26H40O9, M = 496.

3.2.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-

Dα : – 40 (c 0,1, MeOH).

glucopyranoside ester (mới)

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]25 Nhiệt độ nóng chảy: 191-192oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.4. HR-ESI-MS: m/z 681,3095. Tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+: 681,3093. Công thức phân tử C32H50O14, M = 658.

Dα : +56 (c 0,1, MeOH)

3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 192-193oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.5. Công thức phân tử C26H42O9, M = 498.

Dα : -25 (c 0,1, CHCl3)

3.2.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane

Tinh thể hình kim, không màu. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 153-154oC. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.6. Công thức phân tử C20H34O2, M = 306.

Dα : -32 (c 0,1, CHCl3)

3.2.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane

Tinh thể hình kim, không màu. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 151-152oC. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.7. ESI-MS: m/z 329,2 [M+Na]+. Công thức phân tử C20H34O2, M = 306.

Dα : – 45 (c 0,1, CHCl3).

3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al

Tinh thể hình kim, không màu. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 186-187oC. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.8. ESI-MS: m/z 319,2 [M-H]-. Công thức phân tử C20H32O3, M = 320.

Dα : – 57 (c 0,01, MeOH).

3.2.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

Tinh thể hình kim, không màu. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 296-297oC. 1H-NMR (500 MHz, C5D5N) và 13C-NMR (125 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.9. ESI-MS: m/z 335,2 [M-H]-. Công thức phân tử C20H32O4, M = 336.

3.2.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E

Dα : – 70 (c 0,07, MeOH).

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31

Nhiệt độ nóng chảy: 203-204oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.10. ESI-MS: m/z 319 [M-H]− Công thức phân tử C20H32O3, M = 320.

Dα : – 40 (c 0,1, CHCl3).

3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 166-167oC. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.11. ESI-MS: m/z 361 [M-H]-. Công thức phân tử C22H34O4, M = 362.

Dα : -61 (c 0,1, MeOH).

3.2.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực [ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 278-279oC. 1H-NMR (500 MHz, C5D5N) và 13C-NMR (125 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.12. Công thức phân tử C19H30O3, ,M = 306.

3.2.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-

D-glucopyranoside (mới)

Dα : −25,0 (c 0,1, MeOH).

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực [ ]25 Nhiệt độ nóng chảy: 229-230oC. CD (c = 1,5 ×10-5, MeOH), [θ] (λmax, nm) –52481 (237). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.13. HR-ESI-MS: m/z 629,2431[M+Na]+. Tính toán lý thuyết: [C27H42O15Na]+ 629,2416. Công thức phân tử C27H42O15, M = 606.

3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-

glucopyranoside

Chất bột, màu trắng.

Dα : -110 (c 1,0, MeOH).

Nhiệt độ nóng chảy: 199-200oC. Độ quay cực [ ]31 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.14. Công thức phân tử C21H32O10, M = 444.

Dα : + 35 (c 0,1, MeOH).

3.2.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I

Dạng dầu màu vàng nhạt. Độ quay cực[ ]31 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.15. Công thức phân tử C13H20O4, M = 240.

Dα : +25 (c 0,3, CHCl3)

3.2.16. Hợp chất 16: Blumenol A

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 112-113oC. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.16. Công thức phân tử C13H20O3, M = 224.

Dα : -42 (c 0,05, MeOH).

3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 183-184oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.17. Công thức phân tử C19H30O8, M = 386.

Dα : -52 (c 0,1, MeOH).

3.2.18. Hợp chất 18: Icariside D2

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 151-152oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.18. Công thức phân tử C14H20O7, M = 300.

3.2.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside

Chất bột, màu trắng.

Dα : -32 (c 0,05, MeOH).

Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.19. Công thức phân tử C18H26O11, M = 418.

Dα : -26 (c 0,4, MeOH).

3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột, màu trắng. Độ quay cực[ ]31 Nhiệt độ nóng chảy: 195-196oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.20. Công thức phân tử C14H20O8, M = 316.

3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid

Chất bột, màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 190-191oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.21. Công thức phân tử C7H6O4, M = 154.

3.2.22. Hợp chất 22: Squamocin M

Dạng sáp, màu trắng. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.22. Công thức phân tử C37H66O6, M = 606.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

H COOH

4.1.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới)

9 1a

1

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 1 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của 1

được xác định là C20H32O5 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI- MS xuất hiện pic ion tại m/z 375,2159 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C20H32O5Na]+: 375,2142).

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của 2 nhóm methyl bậc ba dưới

dạng singlet tại δH 1,00 (3H, s) và 1,18 (3H, s), 1 nhóm oxymethine tại δH 3,63 (1H, br

s), 1 nhóm oxymethylene tại δH 3,62 (1H, d, J = 11,5 Hz) và 3,72 (1H, d, J = 11,5 Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của 1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử

cacbon trong đó có 1 cacbon cacboxylic, 4 cacbon không có hydro, 4 nhóm

methine, 9 nhóm methylene và 2 nhóm methyl. Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý đây là một diterpenoid khung ent-kaurane. So sánh số liệu 13C-NMR của 1 với hợp

chất có khung ent-kaurane tương tự, 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9)

[138] gợi ý 1 có cùng cấu trúc khung ent-kaurane.

Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,18) với C-3 (δC 34,23)/C-4 (δC

44,25)/C-5 (δC 48,09)/C-19 (δC 182,00) khẳng định vị trí của nhóm methyl và

cacboxylic tại C-4. Nhóm methyl tại C-4 được xác định có cấu hình β bởi tương tác

NOESY giữa H-18 (δH 1,18) với H-5 (δH 1,77). Tương tác HMBC từ H-13 (δH

2,08)/H-15 (δH 1,56 và 1,74) tới C-16 (δC 82,86)/C-17 (δC 66,71) khẳng định vị trí

của 2 nhóm hydroxyl tại C-16 và C-17.

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo

($) DEPT

(@)

(@) δH

(#) δC 41,2

C 1 δC 41,1 CH2

19,9 2 19,8 CH2 δC 41,71 0,93 (m) 1,87 (m) 20,29 1,44 (m) 1,96 (m) 38,8 3 38,7 CH2

34,23 1,08 (dd, J = 4,5 Hz, 13,5 Hz) 2,17 (d, J = 13,5 Hz) -

44,0 57,1 22,5 4 5 6 43,9 C 57,0 CH 23,0 CH2 44,25 48,09 1,77 (d, J = 9,0 Hz) 30,48 1,98 (m) 2,11 (m)

42,6 43,9 56,8 40,1 19,5 7 8 9 10 11 42,8 CH 45,0 C 56,3 CH 40,1 C 19,0 CH2

26,7 12 26,8 CH2

41,7 38,6 13 14 45,9 CH 37,8 CH2

53,5 15 53,9 CH2

78,05 3,63 (br s) 49,00 - 51,08 1,43 (d, J = 7,5 Hz) 40,44 - 19,11 1,57 (m) 1,64 (m) 27,64 1,57 (m) 1,68 (m) 46,09 2,08 (m) 37,50 1,70 (dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz) 1,83 (d, J = 12,0 Hz) 50,13 1,56 (d, J = 13,5 Hz) 1,74 (d, J = 13,5 Hz) -

79,8 70,5 16 17 81,7 C 66,5 CH2 82,86 66,71 3,62 (d, J = 11,5 Hz) 3,72 (d, J = 11,5 Hz)

#δC của 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9) đo trong CDCl3 [138], $δC của 16α,17- dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (1a) đo trong CDCl3 [138], @ đo trong CD3OD.

18 19 20 29,4 180,2 16,0 29,27 1,18 (s) 182,00 - 16,14 1,00 (s) 29,3 CH3 180,1 C 16,0 CH3

Bên cạnh đó, cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-16 được xác định là α bằng

cách so sánh độ chuyển dịch C-13 (δC 46,09), C-16 (δC 82,86), và C-17 (δC 66,71)

của 1 với các hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9) [138] [δC 41,7

(C-13), 79,8 (C-16) và 70,5 (C-17)] và 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

(1a) [138] [δC 45,9 (C-13), 81,7 (C-16) và 66,5 (C-17)]. Vị trí của nhóm hydroxyl

tại C-7 được xác định thông qua tương tác HMBC giữa H-5 (δH 1,77)/H-15 (δH

1,74) với C-7 (δC 78,05) cùng với đó là tương tác COSY giữa các proton H-5 (δH

1,77)/H-6 (δH 1,98 và 2,11)/H-7 (δH 3,63).

Thêm vào đó, tương tác NOESY giữa H-7 (δH 3,63) với H-14 (δH 1,70) và

dạng tín hiệu broad singlet của H-7, cho phép khẳng định H-7 có cấu hình α (vị trí

equatorial). Từ các phân tích trên, hợp chất 1 được xác định là 7β,16α,17-

trihydroxy-ent-kauran-19-oic. Tra cứu trên Science Finder cho phép kết luận đây là

COSY

COOH

HMBC

hợp chất mới.

1

Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY quan trọng của hợp chất 1

Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

Hình 4.6. Phổ DEPT của hợp chất 1

Hình 4.7. Phổ HSQC của hợp chất 1

Hình 4.8. Phổ HMBC của hợp chất 1

Hình 4.9. Phổ COSY của hợp chất 1

Hình 4.10. Phổ NOESY của hợp chất 1

4.1.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (mới)

O 2a

O 2

H CHO

2b

HOHO

1' OH

HOHO

Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử

của 2 được xác định là C26H42O9 dựa vào kết quả phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 521,2732 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H42O9Na]+: 521,2721). Phổ 1H-NMR của 2 khá giống 1 đều có sự xuất hiện tín

hiệu 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,99 (3H, s) và 1,22 (3H, s), 1 nhóm oxymethine

tại δH 3,50 (1H, br s), 1 nhóm oxymethylene tại δH 3,35 (2H, m) gợi ý 2 cũng có cấu

trúc khung ent-kaurane. Bên cạnh đó, tín hiệu 1 proton anome tại δH 5,42 (1H, d, J

= 8,0 Hz) cho thấy sự có mặt của 1 phân tử đường.

Phổ 13C-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, bao gồm 1

nhóm cacboxyl, 3 cacbon bậc 4, 10 cacbon methine (trong đó có 6 nhóm

oxymethine), 10 cacbon methylene (trong đó có 2 nhóm oxymethylene) và 2 nhóm methyl. Phổ 1H- và 13C-NMR của 2 khá tương đồng với hợp chất helikauranoside A

(2a) [13], ngoại trừ 2 xuất hiện thêm nhóm hydroxyl tại C-7.

Vị trí nhóm hydroxyl tại C-7 được khẳng định bởi tương tác HMBC giữa

proton H-5 (δH 1,78)/H-9 (δH 1,43)/H-15 (δH 1,12 và 1,71) với C-7 (δC 78,70).

Tương tự như 1, cấu trúc lập thể của proton H-7 trong 2 được xác định là α (vị trí

equatorial) bởi dạng tín hiệu broad singlet của H-7. Tương tác HMBC giữa H-17

(δH 3,35) với C-13 (δC 39,46)/C-15 (δC 42,58)/C-16 (δC 44,66) gợi ý có nhóm

hydroxyl tại C-17. Bên cạnh đó, cấu trúc lập thể của nguyên tử hydro tại C-16 được

xác định là α bằng việc so sánh giá trị độ chuyển dịch của C-12 (δC 32,96) C-13 (δC

39,46), C-16 (δC 44,66) và C-17 (δC 67,66) với dữ kiện của 16α-ent-kaurane:

helikauranoside A (2a) [δC 32,5 (C-12), 39,5 (C-13), 44,5 (C-16) và 67,7 (C-17)]

[13] và 16β-ent-kaurane: 17-hydroxy-16β-ent-kauran-19-al (2b) [δC 25,8 (C-12),

36,9 (C-13), 43,1 (C-16), và 64,1 (C-17)] [138]. Tương tác HMBC giữa H-18 (δH

1,22) với C-3 (δC 39,09)/C-4 (δC 44,69)/C-5 (δC 49,50)/C-19 (δC 178,67) khẳng định

nhóm cacboxyl tại C-4.

Thủy phân hợp chất 2 trong môi trường axit thu được đường D-glucose (xác

định bằng dẫn xuất TMS). Bên cạnh đó, tương tác HMBC giữa proton anome H-1′

(δH 5,42) với C-19 (δC 178,67) cho thấy phân tử đường D-glucose liên kết với

aglycone tại C-19. Bên cạnh đó hằng số tương tác JH-1′/2′ = 8,0 Hz chứng tỏ H-1′ và

H-2′ đều chiếm vị trí axial. Do đó, nhóm hydroxyl tại cacbon anomeric có cấu hình

β. Căn cứ vào những dữ kiện phổ trên, 2 được xác định là 7β,17-dihydroxy-16α-ent-

kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester. Hợp chất này cũng là hợp chất

mới.

HOHO

Hình 4.12. Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 2

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo

(@) δH

($) δC 41,9 19,0 39,8 48,4 56,6 20,1 40,5 44,0 55,9 39,3 18,3 25,8 36,9 34,2 43,6 43,1 64,1 24,2 206,0 178,67 16,3

(@) δC 41,77 0,94 (m)/1,88 (m) 20,20 1,45 (m)/1,94 (m) 39,09 1,13 (m)/2,22 (m) 44,69 49,50 1,78 (d, J = 13,0 Hz) 30,68 1,97 (m)/2,18 (dd, J = 13,0 Hz, 14,5 Hz) 78,70 3,50 (br s) 49,80 - 50,62 1,43 (m) 40,47 - 19,51 1,57 (m)/1,63 (m) 32,96 1,43 (m)/1,63 (m) 39,46 2,11 (m) 37,17 1,08 (m)/1,80 (d, J = 11,5 Hz) 42,58 1,12 (m)/1,71 (dd, J = 3,5 Hz, 10,0 Hz) 44,66 1,94 (m) 67,66 3,35 (m) 28,82 1,22 (s) - 16,28 0,99 (s)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

19-OGlc

(#) δC 42,1 20,0 39,1 45,1 58,8 23,5 43,0 45,9 56,0 40,9 20,2 32,5 39,5 37,9 46,3 44,5 67,7 29,1 178,3 16,5 95,6 74,1 78,7 71,1 78,7 62,4

#δC của helikauranoside A (2a) đo trong CD3OD [13], $δC của 17-hydroxy-16β-ent-kauran-19-al (2b) đo trong CDCl3 [138], @ đo trong CD3OD.

1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 95,66 5,42 (d, J = 8,0 Hz) 74,07 3,38 (m) 78,67 3,45 (m) 71,14 3,39 (m) 78,56 3,39 (m) 62,42 3,71(dd, J = 4,0 Hz, 11,5 Hz) 3,86 (d, J = 11,5 Hz)

Hình 4.13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2

Hình 4.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2

Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2

Hình 4.16. Phổ HSQC của hợp chất 2

Hình 4.17. Phổ HMBC của hợp chất 2

4.1.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-

1' OH

HOHO

glucopyranoside ester (mới)

3

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 3

Hợp chất 3 thu được được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử

của 3 được xác định là C26H40O9 bởi sự xuât hiện pic ion phân tử tại m/z 519,2550 trên phổ HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H40O9Na]+: 519,2565).

Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3

(@)

δC 41,72 C 1 DEPT CH2

20,17 2 CH2

39,10 3 CH2

44,71 48,30 29,28 4 5 6 C CH CH2

75,62 54,25 43,56 40,88 19,65 7 8 9 10 11 CH C CH C CH2

26,33 42,19 43,51 12 13 14 CH2 CH CH2

132,13 148,11 61,21 28,79 178,58 16,10 δH 1,03 (dd, J = 3,5 Hz, 13,5 Hz) 1,87 (d, J = 13,5 Hz) 1,44 (dt, J = 5,0 Hz, 10,0 Hz) 1,96 (m) 1,12 (dd, J = 4,0 Hz, 13,5 Hz) 2,22 (m) - 1,78 (m) 1,96 (m) 2,23 (m) 3,59 (br s) - 1,39 (d, J = 7,5 Hz) - 1,58 (m) 1,64 (m) 1,52 (m) 2,57 (m) 1,42 (dd, J = 7,5 Hz, 10,5 Hz) 2,06 (d, J = 10,5 Hz) 5,81 (s) - 4,13 (d, J = 1,0 Hz) 1,22 (s) - 1,02 (s) CH C CH2 CH3 C CH3

96,64 74,06 78,70 71,13 78,69 62,41 15 16 17 18 19 20 19-OGlc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ CH CH CH CH CH CH2

@ đo trong CD3OD

5,42 (d, J = 7,5 Hz) 3,38 (m) 3,42 (m) 3,40 (m) 3,39 (m) 3,71 (dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz) 3,85 (dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz)

Phổ 1H-NMR của 3 xuất hiện tín hiệu 1 proton olefin tại δH 5,81 (1H, s) và 2

nhóm methyl tại δH 1,02 (3H, s) và 1,22 (3H, s), gợi ý sự có mặt của cấu trúc khung

ent-kaurane; tín hiệu 1 proton anome tại δH 5,42 (1H, d, J = 7,5 Hz) cho thấy 3 có

cấu trúc khung ent-kaurane đính đường.

Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, trong đó

có 20 nguyên tử cacbon thuộc khung ent-kaurane diterpenoid và 6 nguyên tử cacbon của một phân tử đường. Phổ 1H- và 13C-NMR của 3 khá giống với 7β,17-

dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2), ngoại

trừ sự xuất hiện thêm liên kết đôi tại C-15/C-16. Liên kết đôi này được xác định

dựa trên các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 1,42 và 2,06)/H-17 (δH 4,13) với C-15

(δC 132,13)/C-16 (δC 148,11); giữa H-15 (δH 5,81) với C-7 (δC 75,62)/C-8 (δC

54,25)/C-9 (δC 43,56)/C-14 (δC 43,51)/C-16 (δC 148,11)/C-17 (δC 61,21). Cấu hình

của nhóm hydroxyl tại C-7 dược xác định tương tự như 7β,17-dihydroxy-16α-ent-

kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2). Từ những dữ kiện phổ trên,

3 được xác định là một hợp chất mới có tên khoa học 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-

en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester.

Hình 4.19. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 3

Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3

Hình 4.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3

Hình 4.22. Phổ HSQC của hợp chất 3

Hình 4.23. Phổ HMBC của hợp chất 3

4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-

COOH

1' OH

COOH

18 O

glucopyranoside ester (mới)

4a

4

Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 4 phân lập được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử

của hợp chất 4 được xác định là C32H50O14 bởi sự xất hiện pic ion phân tử tại m/z 681,3095 trên phổ HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+: 681,3093). Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc

ba tại δH 0,97 (3H, s) và 1,24 (3H, s), gợi ý sự có mặt của cấu trúc khung ent-

kaurane; 2 proton anome tại δH 5,43 (d, J = 8,0 Hz) và 5,53 (d, J = 8,0 Hz), gợi ý sự

có mặt của 2 phân tử đường.

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 32 nguyên tử

cacbon gồm 2 cacbonyl, 3 cacbon bậc bốn, 14 nhóm methine, 11 nhóm methylene và 2 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 4 giống với của hợp

chất 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) [71], ngoại trừ sự xuất hiện tín

hiệu của 2 phân tử đường tại C-17 và C-19.

Tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,24) với C-3 (δC 39,04)/C-4 (δC 45,11)/C-5

(δC 58,61)/C-19 (δC 178,43) gợi ý sự có mặt của nhóm methyl và cacboxyl tại C-4;

giữa proton H-13 (δH 2,55)/H-15 (δH 1,59 và 1,97)/H-16 (δH 3,06) với C-17 (δC

175,32) khẳng định nhóm cacboxyl tại C-16; giữa H-1′ (δH 5,53) với C-17 (δC

175,32) và giữa H-1″ (δC 5,43) với C-19 (δC 178,43) khẳng định vị trí của 2 phân tử

glucopyranosyl tại C-17 và C-19. Tương tác NOESY giữa H-18 (δH 1,24) với H-5

(δH 1,15) nhưng không có tương tác với H-20 (δH 0,97) chứng tỏ nhóm methyl tại

C-4 có cấu hình β.

Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo (@)

(@)

(#) δC 40,0 20,3 41,1

C 1 2 3 δC 41,44 19,15 39,04 DEPT CH2 CH2 CH2

44,8 58,2 23,5 41,6 45,6 57,8 40,8 19,3 28,5 40,5 43,1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 45,11 58,61 23,19 42,91 45,62 57,59 40,83 20,14 28,05 41,09 41,87 C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH2 CH CH2

42,0 46,7 178,1 29,5 180,6 16,8 15 16 17 18 19 20 42,69 46,62 175,32 29,04 178,43 16,36 δH 0,87(m)/1,88 (m) 1,52 (m)/1,69 (m) 1,11 (m) 1,21 (d, J = 14,0 Hz) - 1,15 (m) 1,88 (m)/2,00 (m) 1,57 (m)/1,96 (m) - 1,08 (m) - 1,43 (m)/1,94 (m) 1,47 (m)/1,71 (m) 2,55 (m) 1,17 (m) 2,16 (d, J = 12,0 Hz) 1,59 (m)/1,97 (m) 3,06 (m) - 1,24 (s) - 0,97 (s) CH2 CH C CH3 C CH3

17-O-Glc

1' 2' 3' 4' 5' 6' 95,61 74,04 78,68 71,11 78,68 62,40 CH CH CH CH CH CH2

5,53 (d, J = 8,0 Hz) 3,35 (m) 3,48 (m) 3,42 (m) 3,40 (m) 3,71 (dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz) 3,84 (d, J = 11,5 Hz)

19-O-Glc

#δC của 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) đo trong CD3OD [71], @ đo trong CD3OD.

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 95,61 74,04 78,68 71,11 78,68 62,34 CH CH CH CH CH CH2 5,43 (d, J = 8,0 Hz) 3,38 (m) 3,48 (m) 3,42 (m) 3,40 (m) 3,71 (dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz) 3,84 (d, J = 11,5 Hz)

Ngoài ra, tương tác NOESY của H-16 (δH 3,06) với H-13 (δH 2,55); H-16 (δH

3,06) với Hα-15 (δH 1,59); và giữa H-9 (δH 1,08) với Hβ-15 (δH 1,97) khẳng định cấu

hình α của H-16. Thủy phân hợp chất 4 trong môi trường axit thu được D-glucose

[17]. Bên cạnh đó, hằng số tương tác J giữa glc H-1′/glc H-2′; glc H-1″/glc H-2″, J

= 8,0 Hz cho phép khẳng định các proton này đều chiếm vị trí axial. Do đó, 2 nhóm

hydroxyl liên kết với cacbon anomeric C-1′ và C-1′′ có cấu hình β. Từ những dữ

kiện phổ trên, hợp chất mới 4 được xác định là 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic

HOHO

Glc HMBC COSY NOESY

acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester.

Hình 4.25. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY quan trọng của hợp chất 4

Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 4

Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất 4

Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4

Hình 4.29. Phổ DEPT của hợp chất 4

Hình 4.30. Phổ HSQC của hợp chất 4

Hình 4.31. Phổ HMBC của hợp chất 4

Hình 4.32. Phổ COSY của hợp chất 4

Hình 4.33. Phổ NOESY của hợp chất 4

4.1.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV H

Hình 4.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 5

Hợp chất 5 phân lập được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của hợp chất 5 được xác định là C26H42O9. Trên phổ 1H-NMR của 5 xuất hiện tín

hiệu của 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,99 (3H, s), 1,23 (3H, s), một nhóm

oxymetilene tại δH 3,62 (1H, d, J = 11,5 Hz) và 3,72 (1H, d, J = 11,5 Hz), gợi ý sự

có mặt của khung ent-kaurane; một proton anome tại δH 5,43 (1H, d, J = 8,0) gợi ý

một phân tử đường.

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và hợp chất tham khảo

(@)

C 1

(#) δC 40,9

δC 41,80 DEPT CH2

2 3 19,5 38,5 19,62 39,05 CH2 CH2

4 5 6 44,2 57,5 22,5 45,10 58,53 23,16 C CH CH2

7 43,8 43,32 CH2

8 9 10 11 44,9 56,3 40,1 19,0 45,77 57,32 40,88 20,10 C CH C CH2

12 26,7 27,16 CH2

13 14 45,9 37,6 46,20 38,07 CH CH2

15 53,7 53,69 CH2

16 17 81,7 66,5 82,99 66,87 C CH2

18 19 20 28,6 176,9 15,9 29,02 178,37 16,35

(@) δH 0,91 (m) 1,88 (m) 1,62 (m) 1,12 (m) 2,21(m) - 1,10 (dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz) 1,87 (m) 2,01 (m) 1,52 (m) 1,68 (m) - 1,03 (m) - 1,42 (m) 1,97 (m) 1,50 (m) 1,61 (m) 2,01 (m) 1,72 (m) 2,02 (m) 1,42 (m) 1,58 (m) - 3,62 (m) 3,71 (m) 1,23 (s) - 0,99 (s)

CH3 C CH3

19-O-Glc

1ꞌ 2ꞌ 3ꞌ 4ꞌ 5ꞌ 6ꞌ 95,60 74,03 78,67 71,11 78,67 62,41 95,8 CH 74,1 CH 79,3 CH 71,2 CH 79,3 CH 62,2 CH2

5,43 (d, J = 8,0 Hz) 3,40 * 3,42 (m) 3,90 (m) 3,43 * 3,85 (dd J = 11,5 Hz, 2,5 Hz) 3,71 (dd J = 11,5 Hz, 6,0 Hz) #δC của paniculoside IV đo trong C5D5N [9], @ đo trong CD3OD.

Phổ 13C-NMR và DEPT của 5 cho biết sự có mặt của 26 cacbon, bao gồm 6

cacbon tại δC 96,60 (C-1ꞌ), 74,03 (C-2ꞌ), 78,67 (C-3ꞌ), 71,11 (C-4ꞌ), 78,67 (C-5ꞌ) và

62,41 (C-6ꞌ) gợi ý sự có mặt của 1 phân tử đường glucopyranosyl; 20 cacbon đặc

trưng của khung ent-kaurane. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 giống với số liệu

phổ của paniculoside IV ở các vị trí tương ứng [9].

Các tương tác HMBC giữa H-20 (δH 0,99) với C-1 (δC 41,80)/C-10 (δC

40,88)/C-5 (δC 58,53)/C-9 (δC 57,32) cho biết vị trí của nhóm methyl tại C-10.

Tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,23) với C-3 (δC 39,05)/C-4 (δC 45,10)/C-5 (δC

58,53)/C-19 (δC 178,38) cho biết vị trí của nhóm methyl và nhóm cacboxyl tại C-4.

Hơn nữa, tương tác HMBC từ glc H-1' (δH 5,43) đến C-19 (δC 178,38) cho phép xác

định vị trí glucopyranosyl tại C-19 của aglycone ent-kaurane. Vị trí hai nhóm

hydroxyl được khẳng định dựa trên tương tác HMBC giữa H-17 (δH 3,62 và 3,71)

và C-13 (δC 46,20)/C-15 (δC 53,69)/C-16 (δC 82,99). Từ các bằng chứng phổ phân

tích ở trên, cho phép kết luận hợp chất 5 là paniculoside IV [9]. Hợp chất này lần

đầu tiên được phân lập từ chi Annona.

4.1.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane

Hình 4.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6

Phổ 1H-NMR của 6 xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,01

(3H, s), 0,84 (3H, s), 0,80 (3H, s) và tín hiệu của proton oxymethylene tại δH 3,77

(1H, d, J = 11,0 Hz) và 3,65 (1H, d, J = 11,0 Hz).

Trên phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 6 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng

của một diterpene ent-kaurane với 20 tín hiệu cacbon bao gồm 3 nhóm methyl tại δC

17,72 (C-20), 21,55 (C-19) và 33,56 (C-18), 10 nhóm methylene trong đó có một

nhóm oxymethylene tại δC 66,38 (C-17), 3 nhóm methine tại δC 45,51 (C-13),

56,17 (C-5) và 56,72 (C-9), 3 cacbon bậc 4 tại δC 33,26 (C-4), δC 39,38 (C-10),

44,75 (C-8) và 1 cacbon bậc ba nối với nguyên tử oxy tại δC 81,89. Các dữ liệu phổ

trên gợi ý đây là một diterpenoid khung ent-kaurane có 2 nhóm hydroxyl. Sự phù

hợp về số liệu phổ NMR của 6 với tài liệu đã công bố [77] cùng với các phân tích

phổ nêu trên khẳng định hợp chất 6 là 16α,17-dihydroxy-ent-kaurane [77]. Hợp chất

này lần đầu tiên được phân lập từ loài A. glabra.

Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 6 và hợp chất tham khảo

(@)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

(#) δC 42,0 18,2 42,0 33,4 56,1 20,5 37,2 44,6 56,7 39,4 18,3 26,3 45,5 40,4 53,4 81,6 66,2

DEPT CH2 CH2 CH2 C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH2 CH CH2 CH2 C CH2

(@) δH δC 42,02 18,28 42,06 33,26 - 56,17 0,77,(dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz) 20,45 37,31 44,75 - 56,72 1,12 (dt, J = 4,5 Hz, 14,0 Hz) 39,38 - 18,59 26,32 45,51 40,33 1,59 (br d, J = 9,0 Hz) 53,39 1,43* 81,89 - 66,38 3,65 (d, J = 11,0 Hz) 3,77 (d, J = 11,0 Hz)

33,56 0,84 (s) 21,55 0,80 (s) 17,72 1,01 (s) 33,4 21,5 17,7 CH3 CH3 CH3

18 19 20 #δC của 16α,17-dihydroxy-ent-kaurane đo trong CDCl3 [77], @ đo trong CDCl3.

4.1.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane

Hình 4.36. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 7

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 7 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 329,2 [M+Na]+, cùng với các dữ kiện thu được trên phổ NMR cho phép xác định công thức phân tử của 7 là C20H34O2, (M = 320). Phổ 1H-NMR của 7 xuất hiện tín

hiệu của 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,79 (3H, s), 0,84 (3H, s), 1,02 (3H, s) cùng

với tín hiệu của proton oxymethylene tại δH 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz) và 3,46 (1H, d, J = 11,0 Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 7 xuất hiện tín hiệu của

20 cacbon, bao gồm 3 nhóm methyl [δC 17,57 (C-20), δC 21,60 (C-19) và δC 33,60

(C-18)], 1 nhóm oxymethylene tại δC 69,90 (C-17), 1 cacbon bậc ba nối với nguyên

tử oxy tại δC 79,82. Các dữ liệu phổ trên gợi ý đây là một diterpenoid khung ent-

kaurane có 2 nhóm hydroxyl. Tra cứu và so sánh các dữ liệu đã công bố cho thấy số

liệu phổ của hợp chất này phù hợp với số liệu phổ của 16β,17-dihydroxy-ent-

kaurane [77].

Các proton liên kết trực tiếp với cacbon được xác định thông qua các tương

tác trên phổ HSQC (xem Bảng 4.7). Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 0,84) và

H-19 (δH 0,79) với các tín hiệu cacbon δC 42,10 (C-3), 33,27 (C-4), 56,21 (C-5)

khẳng định vị trí của 2 nhóm methyl này tại C-4; các tương tác HMBC giữa H-20

(δH 1,02) với các tín hiệu cacbon δC 40,45 (C-1), 56,21 (C-5), 57,06 (C-9), 39,43

(C-10) gợi ý vị trí của nhóm methyl này tại C-10. Vị trí 2 nhóm hydroxyl tại C-16

và C-17 được khẳng định lại nhờ tương tác HMBC giữa proton tại δH 3,38 và 3,46

(H-17) với các tín hiệu cacbon tại δC 79,82 (C-16), 40,89 (C-13) và 52,84 (C-15),

giữa proton tại δH 2,07 (H-13) với tín hiệu cacbon tại δC 79,82 (C-16) [77].

Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) δC 41,4

δC δH 40,45 0,76 (m) C 1 DEPT CH2 1,82 (d, J = 12,0 Hz) 18,7 18,82 1,41* 2 CH2

42,0 3 CH2 1,63 (m) 42,10 1,12 (m) 1,46 (m)

33,2 56,1 20,0 4 5 6 C CH CH2

38,2 43,5 56,9 39,3 18,6 7 8 9 10 11 CH2 C CH C CH2

26,7 12 CH2

52,6 40,4 13 14 CH CH2 33,27 - 56,21 0,77 (m) 20,05 1,25 (m) 1,51 (m) 41,93 1,37 (m) 43,58 - 57,06 1,12 (m) 39,43 - 18,64 1,63 (m) 1,87 (m) 26,76 1,55 (m) 1,75 (m) 40,89 2,07 (m) 38,32 0,99 (br d, J = 12,0 Hz) 1,99 (br d, J = 12,0 Hz) 56,1 15 CH2 52,84 1,38 (m) 1,42 (m)

79,7 69,7 16 17 C CH2 79,82 - 69,90 3,38 (d, J = 11,0 Hz) 3,46 (d, J = 11,0 Hz)

#δC của 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane đo trong CDCl3 [77], @ đo trong CDCl3.

33,6 21,5 17,6 33,60 0,84 (s) 21,60 0,79 (s) 17,57 1,02 (s) 18 19 20 CH3 CH3 CH3

Cấu hình β của nhóm hydroxyl tại C-16 được xác định bằng cách so sánh giá

trị độ chuyển dịch hóa học cacbon của hợp chất 7 tại C-16, C-17 với các số liệu

tương ứng của hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane. Các vị trí của cacbon trong

phân tử được xác định chi tiết bởi kết hợp phổ 1D và 2D-NMR. Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của 7 có sự sai khác với số liệu công bố trong tài liệu tham khảo [77]

của hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane ở các vị trí C-7, C-13, C-14 và C-15.

Giá trị δC của C-7 và C-14 trong tài liệu tham khảo cần đổi chỗ cho nhau dựa trên

tương tác HSQC H-14 (δH 0,99 và 1,99)/C-14 (δC 38,32), H-14 lại có tương tác

HMBC với C-16 (δC 79,82). Độ chuyển dịch hóa học tại C-13, C-15 được xác định

bởi tương tác HMBC giữa H-17 (δH 3,38 và 3,46) với C-13 (δC 40,89) và C-15 (δC

52,84). Từ tất cả các phân tích nêu trên, hợp chất 7 được xác định là 16β,17-

dihydroxy-ent-kaurane [77].

CHO

4.1.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al

Hình 4.37. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 8

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 8 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 319,2 [M-H]-, cùng với các dữ kiện thu được trên phổ NMR cho phép xác định công thức phân tử của 8 là C20H32O3, (M = 320). Phổ 1H-NMR của 8 xuất hiện tín

hiệu của 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,93 (3H, s), 1,00 (3H, s), proton

oxymethylene tại δH 3,32 (1H, d, J = 11,5 Hz) và 3,43 (1H, d, J = 11,5 Hz) và tín

hiệu của 1 proton aldehyde tại δH 9,75 (1H, d, J = 1,5 Hz).

Trên phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 8 xuất hiện tín hiệu của 20

cacbon, bao gồm 2 nhóm methyl tại δC 16,85 (C-20) và 24,57 (C-18), 1 nhóm

oxymethylene tại δC 70,61 (C-17), 1 cacbon bậc ba nối với nguyên tử oxy tại δC

80,74 và 1 cacbon methine tại δC 207,87 đặc trưng của nhóm aldehyde. Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của 8 cũng tương tự như 7 cho thấy đây cũng là

một hợp chất dạng diterpenoid khung ent-kaurane có 2 nhóm hydroxyl và 1 nhóm

aldehyde.

Phân tích phổ HSQC cho phép gán độ chuyển dịch hóa học của các proton

với cacbon tương ứng (xem Bảng 4.8). Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH

1,00)/H-19 δH 9,75 với C-3 (δC 35,28), C-4 (δC 49,84), C-5 (δC 57,90) cho phép xác

định nhóm methyl và aldehyde tại C-4; tương tác giữa H-20 (δH 0,93) với các

cacbon δC 41,02 (C-1), δC 57,90 (C-5), δC 57,19 (C-9) và 40,65 (C-10) gợi ý sự có

mặt nhóm methyl tại C-10. Vị trí 2 nhóm hydroxyl tại C-16 và C-17 được khẳng

định lại nhờ tương tác HMBC giữa proton tại δH 3,32 (H-17) với các tín hiệu

cacbon tại δC 80,74 (C-16), 42,20 (C-13) và 53,09 (C-15), giữa proton tại δH 2,08

(H-13) với tín hiệu cacbon tại δC 80,74 (C-16). Như vậy 8 có cấu trúc tương tự 7

nhưng nhóm methyl C-19 được thay thế bằng nhóm aldehyde. Sự phù hợp về dữ

kiện phổ của 8 với tài liệu đã công bố cùng với các phân tích nêu trên khẳng định hợp

chất 8 là 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al [138].

Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và hợp chất tham khảo

(@)

C 1

(#) δC 41,8

δC 41,02 DEPT CH2

2 18,8 19,47 CH2

3 34,2 35,28 CH2

4 5 6 48,4 56,5 19,6 49,84 57,90 20,71 C CH CH2

7 8 9 10 11 39,4 43,3 55,4 39,7 18,3 43,08 44,69 57,19 40,65 19,82 CH2 C CH C CH2

12 26,5 27,77 CH2

13 14 40,6 38,3 42,20 39,41 CH CH2

15 16 17 52,3 79,8 69,7 53,09 80,74 70,61 CH2 C CH2

18 19 20

(@) δH 0,88 (m) 1,90 (m) 1,44 (m) 2,07 (m) 1,06 (m) 2,12 (m) - 1,23 (dd, J = 2,5 Hz, 12,5 Hz) 1,59 (m) 1,63 (m) 1,52 (m) - 1,16 (m) - 1,72 (m) 1,89(m) 1,49 (m) 1,84 (m) 2,08 (m) 1,13 (m) 2,00 (dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz) 1,45 (m) - 3,32 (d, J = 11,5 Hz) 3,43 (d, J = 11,5 Hz) 1,00 (s) 9,75 (d, J = 1,5 Hz) 0,93 (s)

#δC của 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al đo trong CDCl3 [138], @ đo trong CDCl3.

24,2 206,0 16,3 24,57 207,87 16,85 CH3 CH CH3

COOH

4.1.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 9 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 335,2 [M-H]-, cùng với các dữ kiện thu được trên phổ NMR cho phép xác định công thức phân tử của 9 là C20H32O4, (M = 336). Phổ 1H-NMR của 9 xuất hiện tín

hiệu của 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,21 (3H, s), 1,34 (3H, s), proton

oxymethylene tại δH 3,77 (1H, d, J = 10,5 Hz) và 3,84 (1H, d, J = 10,5 Hz).

Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và hợp chất tham khảo

(@)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

(#) δC 41,2 19,9 38,8 44,0 57,1 22,5 42,6 43,9 56,8 40,1 19,5 27,6 41,7 38,6 53,5 79,8 70,5

δC 41,16 19,85 38,73 43,91 57,07 22,48 42,50 43,96 56,72 40,07 19,43 27,57 41,67 38,58 53,38 79,81 70,49 DEPT CH2 CH2 CH2 C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH2 CH CH2 CH2 C CH2

#δC của 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid đo trong CD3OD [138], @ đo trong C5D5N.

18 19 20 δH - - - - 3,77 (d, J = 10,5 Hz) 3,84 (d, J = 10,5 Hz) 1,34 (s) - 1,21 (s) 29,4 180,2 16,0 29,37 180,18 15,96 CH3 C CH3

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 9 xuất hiện tín hiệu của 20 cacbon, bao

gồm 2 nhóm methyl tại δC 15,96 (C-20) và 29,37 (C-18), 10 nhóm methylene trong

đó có 1 nhóm oxymethylene tại δC 70,49 (C-17), 3 nhóm methine tại δC 41,67 (C-

13), 57,07 (C-5) và 56,72 (C-9); 3 cacbon bậc 4 tại δC 40,07 (C-10), 43,91 (C-4),

43,96 (C-8), 1 cacbon bậc ba nối với nguyên tử oxy tại δC 79,81 (C-16) và 1 cacbon

không còn hydro tại δC 180,18 đặc trưng cho sự có mặt của nhóm axit cacboxylic.

Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của 9 gần tương tự như các phổ

tương ứng của 8 ngoại trừ việc xuất hiện tín hiệu của nhóm axit cacboxylic thay cho

các tín hiệu của nhóm aldehyde của 8 (δC 207,87/δH 9,75) đã bị mất. Từ các kết quả

phân tích phổ NMR thu được và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất 9 được xác

định là 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid [138].

17 COOH

COOH

4.1.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E

Hình 4.39. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 10

Hợp chất 10 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Phổ khối lượng ESI- MS xuất hiện pic ion tại m/z 319,2 [M-H]−, cùng với các phổ NMR cho phép xác

định công thức phân tử của 10 là C20H32O3, (M = 320).

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 10 xuất hiện tín hiệu proton của 2 nhóm

methyl bậc 3 tại δH 0,95 (3H, s) và 1,05 (3H, s), một nhóm oxymethylene tại δH 3,34 (1H, d, J = 11,0 Hz) và 3,73 (1H, d, J = 11,0 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện

các tín hiệu đặc trưng của một diterpene ent-kaurane với 20 tín hiệu cacbon bao

gồm 2 nhóm methyl tại δC 18,79 (C-20), 27,83 (C-18), 10 nhóm methylene trong đó

có một nhóm oxymethylene tại δC 65,16 (C-19), 4 nhóm methine tại δC 41,08 (C-

13), 46,71 (C-16), 58,25 (C-5) và 59,00 (C-9); 3 cacbon bậc 4 tại δC 39,78 (C-4),

Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) δC 40,8

δC 41,72 C 1 DEPT CH2

18,4 19,06 2 CH2

36,73 36,1 3 CH2

39,78 58,25 21,62 39,1 57,6 21,0 4 5 6 C CH CH2

43,19 42,4 7 CH2

45,54 59,00 40,41 19,32 44,6 57,0 39,3 18,7 8 9 10 11 C CH C CH2

28,50 27,9 12 CH2

41,08 41,56 40,1 40,6 13 14 CH CH2

43,34 42,7 15 CH2

46,71 178,42 27,83 65,16 46,9 176,9 28,0 64,1 16 17 18 19 CH C CH3 CH2

(@) δH 1,87 (m) 2,11 (d, J = 11,5 Hz) 1,68 (m) 1,41 (m) 0,93 (dd, J = 3,5 Hz, 13,5 Hz) 1,84* - 0,99 (dd, J = 5,0 Hz, 12,0 Hz) 1,62 (m) 2,43 (m) 1,52 (m) 1,95 (m) - 0,99 (m) - 1,57 (m) 1,65 (m) 1,52 (m) 1,62 (m) 2,52 (br s) 0,86 (dd, J = 3,5 Hz, 13,5 Hz) 1,10 (dd, J = 3,5 Hz, 13,5 Hz) 1,54 (m) 1,91 (m) 2,92 (dt, J = 12,0 Hz, 6,0 Hz) - 0,95 (s) 3,34 (d, J = 11,0 Hz) 3,73 (d, J = 11,0 Hz) 1,05 (s)

18,79 20 CH3 18,4 #δC của annoglabasin E đo trong C5D5N [36], @ đo trong CD3OD.

40,41 (C-10), 45,54 (C-8) và một nhóm cacbonyl tại δC 178,42 (C-17). Các dữ kiện

phổ NMR của hợp chất 10 rất tương tự với các số liệu tương ứng đã công bố đối với

hợp chất annoglabasin E [36].

Các tương tác HMBC giữa H-20 (δH 1,05) và C-1 (δC 41,72)/C-5 (δC

58,25)/C-9 (δC 59,00)/C-10 (δC 40,41); giữa H-18 (δH 0,95) và C-3 (δC 36,73)/C-4

(δC 39,78)/C-5 (δC 58,25)/C-19 (δC 65,16) cho phép xác định hai nhóm methyl tại

C-4 và C-10, nhóm hydroxymethylene tại C-4. Các tương tác HMBC giữa H-16 (δH

2,92)/Ha-15 (δH 1,91)/Hb-15 (δH 1,54) và C-17 (δC 178,42) khẳng định nhóm

cacboxyl tại C-16. Từ các phân tích trên cùng với sự phù hợp hoàn toàn các dữ liệu

phổ NMR với tài liệu đã công bố [36] cho phép kết luận hợp chất 10 là

annoglabasin E, một hợp chất cũng đã được phân lập từ loài A. glabra năm 2000.

17 COOH

COOH

4.1.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B

Hình 4.40. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 11

Sự xuất hiện pic ion tại m/z 361,2 [M-H]- trên phổ khối lượng ESI-MS cùng

với kết quả phân tích phổ NMR cho phép xác định công thức phân tử của 11 là C22H34O4, (M = 362). Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 11 xuất hiện tín hiệu proton

của 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,94 (3H, s) 1,01 (3H, s) và 2,04 (3H, s), một nhóm

oxymethylene tại δH 3,88 (1H, d, J = 11,0 Hz) và 4,20 (1H, d, J = 11,0 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện 22 tín hiệu cacbon bao gồm 3 nhóm methyl tại δC

18,07 (C-20), 21,02 (C-22), 27,53 (C-18), 10 nhóm methylene trong đó có một

nhóm oxymethylene tại δC 67,19 (C-19), 4 nhóm methine tại δC 39,80 (C-13), 45,29

(C-16), 56,71 (C-5) và 57,17 (C-9); 3 cacbon bậc 4 tại δC 37,04 (C-4), 39,13 (C-10),

44,35 (C-8) và 2 nhóm cacbonyl tại δC 179,95 (C-17) và 171,47 (C-21). Các tương

tác HMBC giữa H-20 (δH 1,01) và C-1 (δC 40,23)/C-5 (δC 56,71)/C-9 (δC 57,17)/C-

10 (δC 39,13); giữa H-18 (δH 0,94) và C-3 (δC 36,33)/C-4 (δC 37,04)/C-5 (δC

56,71)/C-19 (δC 67,19) cho phép xác định hai nhóm methyl tại C-4 và C-10, nhóm

hydroxymethylene tại C-4. Mặt khác, các tương tác HMBC từ H-15 (δH 1,90 và

1,55)/H-16 (δH 2,94) đến C-17 (δC 179,95) chứng tỏ sự có mặt của nhóm cacboxyl

tại C-16.

Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và hợp chất tham khảo

(@)

C 1

(#) δC 41,6

δC 40,23 DEPT CH2

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 18,1 36,2 39,1 57,1 20,6 41,8 44,3 56,6 39,1 18,0 27,2 39,7 40,2 40,5 18,20 36,33 37,04 56,71 20,64 41,87 44,35 57,17 39,13 18,01 27,31 39,80 40,55 41,69 CH2 CH2 C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH2 CH CH2 CH2

16 17 18 19 45,3 180,1 27,5 67,2 45,29 179,95 27,53 67,19 CH C CH3 CH2

18,0 171,5 CH3 C 18,07 171,47 δH 0,78 (dd, J = 3,5 Hz, 13,0 Hz) 1,81 (br d, J = 13,0 Hz) 1,40 (m)/1,52 (m) 0,98 (m)/1,68 (m) - 0,95 (m) 1,33 (m)/1,67 (m) 1,50 (m) - 1,08 (m) - 1,52 (m)/1,63 (m) 1,51 (m)/1,66 (m) 2,57 (m) 1,05 (m)/2,04 (m) 1,55 (dd, J = 13,0 Hz, 6,5 Hz) 1,90 (dd, J = 13,0 Hz, 6,5 Hz) 2,94 (m) - 0,94 (s) 3,88 (d, J = 11,0 Hz) 4,20 (d, J = 11,0 Hz) 1,01 (s) -

#δC của annonaglabasin B đo trong CDCl3 [25], @ đo trong CDCl3 Phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT của 11 khá giống với phổ tương ứng hợp chất

21,0 21,02 2,04 (s) CH3 20 21 (CH3COO) 22 (CH3COO)

10 ngoại trừ sự khác nhau rất rõ ràng là có mặt thêm tín hiệu của nhóm axetyl tại C-

19. Sự khác nhau này được khẳng định thêm bằng phổ HMBC với sự xuất hiện

tương tác giữa proton của nhóm CH3COO (δH 2,04) và H-19 (δH 3,88 và 4,20) với

CH3COO (δC 171,47). Phân tích các phổ NMR và phổ khối lượng, kết hợp so sánh

với tài liệu tham khảo khẳng định hợp chất 11 là annonaglabasin B [25], một hợp

chất đã biết từ loài A. glabra [25].

17 COOH

CH2OH

4.1.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid

12 12a

Hình 4.41. Cấu trúc hóa học của 12 và hợp chất tham khảo

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 12 xuất hiện tín hiệu proton của 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,95 (3H, s) và 1,27 (3H, s). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp

chất 12 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của một diterpene dạng khung 19-nor-ent-

kaurane với 19 cacbon bao gồm 1 nhóm cacboxyl tại δC 175,91 (C-17), 3 cacbon

bậc 4 tại δC 71,02 (C-4), 44,63 (C-8), 40,05 (C-10), 4 nhóm methine tại δC 58,10

(C-5), 57,41 (C-9), 46,03 (C-16), 40,17 (C-13), 9 nhóm methylene δC 39,98 (C-1),

18,66 (C-2), 43,68 (C-3), 19,79 (C-6), 41,03 (C-7), 20,16 (C-11), 28,05 (C-12),

41,17 (C-14), 43,15 (C-15) và 2 nhóm methyl tại δC 23,43 (C-18), 17,39 (C-20). Độ

chuyển dịch hóa học của C-4 dịch chuyển về vùng trường thấp gợi ý sự có mặt của

nhóm hydroxyl tại vị trí C-4 [144].

Các dữ liệu phổ NMR của 12 khá tương tự với số liệu phổ đã công bố của

hợp chất 16α-hydro-19-nor-ent-kauran-4α,17-diol (12a) [144] ngoại trừ sự khác

biệt về độ dịch chuyển hóa học tại C-16 và C-17, trong đó nhóm cacboxyl đã thay

cho nhóm CH2OH. Vị trí nhóm cacboxyl tại C-16 của hợp chất 12 được khẳng định

thêm bằng các tương tác HMBC giữa H-15 (δH 1,92 và 1,52)/H-16 (δH 3,15) với C-

17 (δC 179,95). Tương tác HMBC từ H-18 (δH 1,27) đến C-3 (δC 43,68)/C-4 (δC

71,02)/C-5 (δC 58,10) khẳng định hai nhóm methyl và hydroxyl tại C-4. Các tương

tác HMBC giữa H-20 (δH 0,95) và C-1 (δC 39,98)/C-5 (δC 58,10)/C-9 (δC 57,41)/C-

10 (δC 40,05) cho phép xác định nhóm methyl tại C-10. Từ các bằng chứng phổ trên

và so sánh với hợp chất tương tự trong tài liệu tham khảo, hợp chất 12 được xác

định là 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid [144], một hợp chất đã biết từ loài A.

glabra [72].

Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và hợp chất tham khảo (@)

C 1

(#) δC 39,9

δC 39,98 DEPT CH2

2 19,2 18,66 CH2

3 40,7 43,68 CH2

4 5 6 71,1 57,3 19,7 71,02 58,10 19,79 C CH CH2

7 41,9 41,03 CH2

8 9 10 11 44,2 57,8 39,8 19,9 44,63 57,41 40,05 20,16 C CH C CH2

12 26,2 28,05 CH2

13 14 37,6 43,4 40,17 41,17 CH CH2

15 44,5 43,15 CH2

16 17 18 20 43,7 63,2 23,2 17,3

(@) δH 1,76 (m) 2,28 (m) 1,52 (m) 2,02 (m) 1,62 (m) 1,93 (m) - 1,38 (m) 1,52 (m) 2,20 (m) 1,12 (dd, J = 4,0 Hz, 6,5 Hz) 2,07 (m) - 1,18 (d, J =7,5 Hz) - 1,51 (m) 2,25 (m) 1,53 (m) 2,05 (m) 2,74 (m) 1,52 (m) 2,27 (m) 1,52 (m) 1,92(m) 3,15 (m) - 1,27 (s) 0,95 (s)

#δC của 16α-hydro-19-nor-ent-kauran-4α,17-diol (12a) đo trong C5D5N [144], @ đo trong

C5D5N.

COOH

46,03 175,91 23,43 17,39 CH C CH3 CH3

Hình 4.42. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 12

4.1.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-

D-glucopyranoside (mới)

COOH

6'''

GlcO

1" OH

1'''

3'''

14

13

Hình 4.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 13 phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử được

xác định là C27H42O15 bởi sự xuất hiện pic ion trên phổ HR-ESI-MS tại m/z 629,2431 (tính toán lý thuyết cho công thức [C27H42O15Na]+: 629,2416). Phổ 1H-

NMR của hợp chất 13 xuất hiện tín hiệu 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,96 (3H, s),

1,19 (3H, s) và 2,14 (3H, s), 3 proton olefin tại δH 5,86 (1H, s), 6,62 (1H, d, J = 16,0

Hz), 8,05 (1H, d, J = 16,0 Hz), 2 proton anome tại δH 4,38 (1H, d, J = 8,0 Hz) và δH

5,54 (1H, d, J = 8,0 Hz), những tín hiệu này gợi ý sự có mặt cấu trúc khung megastigmane và 2 phân tử đường. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 13 xuất

hiện tín hiệu của 27 cacbon: 1 cacbonyl, 4 cacbon bậc 4, 14 nhóm methine, 5 nhóm methylene và 3 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 13 khá

tương đồng (từ C-1′ đến C-9′; từ C-1‴ đến C-6‴) với hợp chất

(2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside (14) [16],

ngoại trừ sự xuất hiện thêm một đơn vị đường tại vị trí C-1. Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của 13 có sự sai khác tại vị trí C-1, 2, 3, 4, 5, 6 với số liệu công bố của

hợp chất 14 được giải thích do sự có mặt của đơn vị đường tại vị trí C-1.

Trên phổ HMBC, tương tác giữa proton H-5 (δH 6,62) với C-3 (δC

154,00)/C-1′ (δC 48,83)/C-5′ (δC 87,63)/C-6′ (δC 83,25); giữa H-6 (δH 2,14) với C-2

(δC 117,78)/C-3 (δC 154,00)/C-4 (δC 131,78); và giữa H-2 (δH 5,86) với C-1 (δC

166,00)/C-3 (δC 154,00)/C-6 (δC 21,32) khẳng định có hai liên kết đôi tại C-2/C-3

và C-4/C-5. Bên cạnh đó, hằng số tương tác J giữa H-4 và H-5, J = 16,0 Hz khẳng

định cấu hình của liên kết đôi tại C-4/C-5 là E. Trên phổ NOESY tương tác giữa H-

5 (δH 6,62) và H-6 (δH 2,14) nhưng không có tương tác giữa H-2 (δH 5,86) và H-6

(δH 2,14) cho thấy liên kết đôi tại C-2/C-3 cũng có cấu hình E.

Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) δC 175,0 127,9 139,2 132,3 129,0 19,5 48,3 41,9

C 1 2 3 4 5 6 1′ 2′

(@) δC 166,00 117,78 154,00 131,78 136,43 21,32 48,83 42,86

DEPT C CH C CH CH CH3 C CH2

73,2 41,9 3′ 4′ 73,99 42,86 CH CH2

86,7 82,8 76,3 5′ 6′ 7′ 87,63 83,25 77,13 C C CH2

δH - 5,86 (s) - 8,05 (d, J = 16,0 Hz) 6,62 (d, J = 16,0 Hz) 2,14 (s) - 1,82 (m) 2,02 (m) 4,28 (m) 1,82 (m) 2,21 (m) - - 3,78 (d, J = 7,0 Hz) 3,83 (d, J = 7,0 Hz) 0,96 (s) 1,19 (s) 15,4 18,8 8′ 9' 16,34 19,72 CH3 CH3 1-O-Glc

1″ 2″ 3″ 4″ 5″ 6″ 95,44 73,86 78,04 71,66 78,79 62,76 CH CH CH CH CH CH2 5,54 (d, J = 8,0 Hz) 3,17 (t, J = 8,0 Hz) 3,30 (m) 3,30 (m) 3,42 3,70 (m) 3,87 (m) 3′-O-Glc

#δC của (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside (14) đo trong CD3OD [16], @ đo trong CD3OD.

102,3 74,2 77,2 70,8 77,0 61,9 1‴ 2‴ 3‴ 4‴ 5‴ 6‴ 103,04 73,99 77,96 71,14 78,08 62,37 CH CH CH CH CH CH2 4,38 (d, J = 8,0 Hz) 3,40 (m) 3,46 (t, J = 8,0 Hz) 3,39 (m) 3,39 3,70 (m) 3,87 (m)

Tương tác HMBC giữa H-8′ (δH 0,96) với C-1′ (δC 48,83)/C-2′ (δC 42,86)/C-

6′ (δC 83,25)/C-7′ (δC 77,13); giữa H-9′ (δH 1,19) với C-4′ (δC 42,86)/C-5′ (δC

87,63)/C-6′ (δC 83,25) khẳng định vị trí của hai nhóm methyl tại C-1′ và C-5′. Vị trí

cầu epoxy giữa C-5′ và C-7′ được xác định dựa trên tương tác HMBC giữa proton

H-7′ (δH 3,78 và 3,83) với C-1′ (δC 48,83)/C-2′ (δC 42,86)/C-5′ (δC 87,63)/C-6′ (δC

83,25)/C-8′ (δC 16,32).

Phổ CD của hợp chất 13 xuất hiện hiệu ứng Cotton âm tại 237 nm và hiệu

ứng Cotton dương tại 275 nm, tương tự với hợp chất (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-

dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside (14) [16], khẳng định cấu hình của

C-6′ là S (OH chiếm vị trí α). Trên phổ NOESY không nhận thấy xuất hiện tương

tác giữa H-5 (δH 6,62) và H-7′ (δH 3,78 và 3,83) cho thấy C-7′ chiếm vị trí α và do

đó O ở C-5′ cũng chiếm vị trí α. Điều này cũng phù hợp với sự xuất hiện của tương

tác NOESY giữa H-5 và Haxial-2′/Haxial-4′ (δH 1,82). Ngoài ra, H-3′ (δH 4,28) có

tương tác NOESY với Ha-7′ (δH 3,83), cho thấy proton H-3′ có cấu hình α. Như vậy

cấu hình tuyệt đối tại C-1′, C-3′, C-5′, và C-6′ được xác định lần lượt là 1′R, 3′S,

5′R, và 6′S. Thủy phân hợp chất 13 trong môi trường axit thu được D-glucose. Thêm

vào đó, tương tác HMBC giữa H-1″ (δH 5,54) với C-1 (δC 166,00); H-1‴ (δH 4,38)

với C-3′ (δC 73,99) gợi ý 2 phân tử đường glucopyranosyl liên kết với aglycone

megastigmane tại C-1 và C-3′. Căn cứ vào những dữ kiện phổ trên, cấu trúc hóa học

của 13 được xác định là (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-D-

Glc HMBC NOESY

glucopyranoside, đây là một hợp chất mới.

Hình 4.44. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất 13

Hình 4.45. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 13

Hình 4.46. Phổ 1H-NMR của hợp chất 13

Hình 4.47. Phổ 13C-NMR của hợp chất 13

Hình 4.48. Phổ DEPT của hợp chất 13

Hình 4.49. Phổ HSQC của hợp chất 13

Hình 4.50. Phổ HMBC của hợp chất 13

Hình 4.51. Phổ NOESY của hợp chất 13

4.1.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-

COOH 1

6''

1''

3''

glucopyranoside

Hình 4.52. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 14

Hợp chất 14 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp

chất 14 xuất hiện tín hiệu 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,95 (3H, s), 1,18 (3H, s) và

2,17 (3H, s), 3 proton olefin tại δH 5,85 (1H, s), 6,31 (1H, d, J = 16,0 Hz), 7,78 (1H,

d, J = 16,0 Hz), 1 proton anome tại δH 4,37 (1H, d, J = 8,0 Hz), những tín hiệu này

gợi ý sự có mặt cấu trúc khung megastigmane và 1 phân tử đường.

Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 14 và hợp chất tham khảo

(@)

δH 5,85 (s)

7,78 (d, J = 16Hz) 6,31 (d, J = 16Hz) 2,17 (s)

C 1 2 3 4 5 6 1ꞌ 2ꞌ 3ꞌ 4ꞌ δC 175,0 127,9 139,2 132,3 129,0 19,5 48,3 41,9 73,2 41,9 δC 174,50 126,76 142,57 132,95 130,98 20,62 49,83 42,89 74,09 42,83

(#) DEPT C CH C CH CH CH3 C CH2 CH CH2

5ꞌ 6ꞌ 7ꞌ 86,7 82,2 76,3 87,63 83,16 77,19 C C CH2

15,4 18,8 16,34 19,74 1,96 (m) 4,28 (m) 1,19 (m) 2,17 (m) 3,76 (d, J =7,5Hz) 3,82 (dd, J = 2,0 Hz, 7,5Hz) 0,95 (s) 1,18 (s) CH3 CH3

8ꞌ 9ꞌ 3′-O-Glc 1ꞌꞌ 2ꞌꞌ 3ꞌꞌ 4ꞌꞌ 5ꞌꞌ 6ꞌꞌ 102,3 74,2 77,2 70,8 77,0 61,9 103,16 75,13 78,09 71,69 77,94 62,79 CH CH CH CH CH CH2

#δC của (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside đo trong CD3OD [16], @ đo trong CD3OD.

4,37 (d, J = 8,0 Hz) 3,16 (dd, J = 8,0 Hz, 9,0Hz) 3,30 (m) 3,29 (m) 3,39 (m) 3,29 (dd, J = 2,0 Hz, 12,0Hz) 3,90 (dd, J = 5,0 Hz, 12,0Hz)

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 14 xuất hiện tín hiệu của 21 cacbon: 1

cacboxyl, 4 cacbon bậc 4, 9 nhóm methine, 4 nhóm methylene và 3 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 14 khá tương đồng với hợp chất

(2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside [16].

Trên phổ HMBC, tương tác giữa H-5 (δH 6,31) với C-3 (δC 142,57)/C-4 (δC

132,95)/C-6′ (δC 83,16); giữa H-6 (δH 2,17) với C-2 (δC 126,76)/C-3 (δC 142,57)/C-

4 (δC 132,95); và giữa H-2 (δH 5,85) với C-1 (δC 174,50)/C-3 (δC 142,57)/C-6 (δC

20,62) khẳng định hai liên kết đôi tại C-2/C-3 và C-4/C-5. Bên cạnh đó, hằng số

tương tác J giữa H-4 và H-5, J = 16,0 Hz khẳng định cấu hình của liên kết đôi tại C-

4/C-5 là E. Tương tác HMBC giữa H-8′ (δH 0,95) với C-1′ (δC 49,83)/C-2′ (δC

42,89)/C-6′ (δC 83,16)/C-7′ (δC 77,19); giữa H-9′ (δH 1,18) với C-4′ (δC 42,83)/C-5′

(δC 87,63)/C-6′ (δC 83,16) khẳng định vị trí của hai nhóm methyl tại C-1′ và C-5′.

Vị trí cầu epoxy giữa C-5′ và C-7′ được xác định dựa trên tương tác HMBC

giữa H-7′ (δH 3,76 và 3,82) với C-1′ (δC 49,83)/C-2′ (δC 42,89)/C-5′ (δC 87,63)/C-6′

(δC 83,16)/C-8′ (δC 16,34). Thêm vào đó, tương tác HMBC giữa glc H-1″ (δH 4,37)

với C-3′ (δC 74,09) gợi ý phân tử đường glucopyranosyl liên kết với aglycone megastigmane tại C-3′. Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của 14 hoàn toàn phù

hợp với số liệu phổ của hợp chất (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-

β-D-glucopyranoside [16]. Từ các dữ kiện nêu trên, hợp chất 14 được xác định là

(2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất

này lần đầu tiên được phân lập từ chi Annona.

4.1.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I

Hình 4.53. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 15

Hợp chất 15 được phân lập dưới dạng dầu màu vàng nhạt. Phổ 1H-NMR của

hợp chất 15 xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,04 (3H, s), 1,06

(3H, s) và 1,94 (3H, s), một nhóm oxymethine tại δH 4,22, hai proton của nhóm

oxymethylene tại δH 3,53 (1H, dd, J = 11,0, 5,0 Hz) và 3,48 (H, dd, J = 11,0, 7,0

Hz), 3 proton olefin tại δH 5,81 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz), 5,90 (1H, s), 5,92 (1H, d,

J = 16,0 Hz), những tín hiệu này gợi ý sự có mặt cấu trúc khung megastigmane.

Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 15 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

(@)

C 1 2 δC 42,38 50,72 δC 42,3 C 50,6 CH2

3 4 5 6 7 8 9 10 201,25 127,16 167,30 80,13 132,54 132,43 73,62 67,28 200,7 C 126,9 CH 166,9 C 80,0 C 132,2 CH 132,1 CH 73,5 CH 67,1 CH2

δH - 2,18 (d, J = 17,0 Hz) 2,53 (d, J = 17,0 Hz) - 5,90 (s) - - 5,92 (d, J = 16,0 Hz) 5,81 (dd, J = 5,5 Hz, 16,0 Hz) 4,22 (m) 3,53 (dd, J = 5,5 Hz, 11,0 Hz) 3,48 (dd, J = 7,0 Hz, 11,0 Hz) 1,06 (s) 1,04 (s) 1,94 (s) 11 12 13 23,43 24,50 19,56

23,4 CH3 24,5 CH3 19,6 CH3 #δC của cucumegastigmane I đo trong CD3OD [10], @ đo trong CD3OD. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 15 xuất hiện tín hiệu của 13 cacbon

bao gồm: 1 cacbonyl, 3 cacbon bậc 4, 4 nhóm methine, 2 nhóm methylene và 3 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 15 giống với số liệu của

hợp chất cucumegastigmane I [10]. Các proton liên kết trực tiếp với cacbon được

xác định thông qua các tương tác trên phổ HSQC (xem Bảng 4.15).

Trên phổ HMBC, tương tác giữa H-7 (δH 5,92) và C-9 (δC 73,62)/C-8 (δC

132,43)/C-6 (δC 80,13)/C-5 (δC 167,30); giữa H-13 (δH 1,94) và C-6 (δC 80,13)/C-5

(δC 167,30)/C-4 (δC 127,16) khẳng định vị trí của hai liên kết đôi tại C-4/C-5 và C-

7/C-8. Bên cạnh đó, hằng số tương tác J giữa H-7 và H-8, J = 16,0 Hz khẳng định

cấu hình của liên kết đôi tại C-4/C-5 là E. Tương tác HMBC giữa H-11 (δH 1,06) và

H-12 (δH 1,04) với C-1 (δC 42,38)/C-2 (δC 50,72)/C-6 (δC 80,13); giữa H-11(δH

1,06) với C-12 (δC 24,50); giữa H-12 (δH 1,04) với C-11 (δC 23,43) khẳng định 2

nhóm methyl tại C-1. Tương tác HMBC giữa H-13 (δH 1,94) với C-4 (δC 127,16)/C-

5 (δC 167,30)/C-6 (δC 80,13) khẳng định nhóm methyl tại C-5. Mặt khác, tương tác

HMBC giữa H-10 (δH 3,53) với C-8 (δC 132,43)/C-9 (δC 73,62); giữa H-9 (δH 4,22)

với C-8 (δC 132,43)/C-10 (δC 67,28) cho phép xác định vị trí của 2 nhóm hydroxy

tại C-9 và C-10. Tương tác HMBC giữa H-7 (δH 5,92)/H-11 (δH 1,06)/H-12 (δH

100

1,04) với C-6 (δC 80,13) cho phép xác định vị trí của nhóm hydroxy tại C-6. Từ các

bằng chứng phổ trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất 15 được xác

định là cucumegastigmane I [10]. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi

Annona.

4.1.16. Hợp chất 16: Blumenol A

Hình 4.54. Cấu trúc hóa học chất 16

Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 16 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

C 1 2 δC 41,16 49,70 δC 41,1 C 49,7 CH2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 δH - 2,22 (d, J = 17,0 Hz) 2,43 (d, J = 17,0 Hz) - 5,91 (br s) - - 5,77 (d, J = 16,0 Hz) 5,86 (dd, J = 5,0 Hz, 16,0 Hz) 4,41 (m) 1,30 (d, J = 6,5 Hz) 1,02 (s) 1,08 (s) 1,90 (s) 198,06 126,88 162,60 79,04 135,74 129,02 68,02 23,74 22,90 24,03 18,89 197,9 C 126,9 CH 162,6 C 79,0 C 135,7 CH 129,0 CH 68,0 CH 23,8 CH3 22,9 CH3 24,0 CH3 18,9 CH3 #δC của blumenol A đo trong CDCl3 [62], @ đo trong CDCl3.

Phổ 1H-NMR của hợp chất 16 xuất hiện tín hiệu 3 nhóm methyl bậc 3 tại δH

1,02 (3H, s), 1,08 (3H, s) và 1,90 (3H, s), 1 nhóm methyl bậc 2 tại δH 1,30 (3H, d, J

= 6,6 Hz), một nhóm oxymethine tại δH 4,41, 3 proton olefin tại δH 5,77 (1H, d, J =

16,0 Hz), 5,86 (1H, dd, J = 5,0, 16,0 Hz), 5,91 (1H, br s), những tín hiệu này gợi ý

sự có mặt cấu trúc khung megastigmane.

101

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 16 xuất hiện tín hiệu của 13 cacbon

bao gồm: 1 cacbonyl, 3 cacbon bậc 4, 4 nhóm methine, 1 nhóm methylene và 4 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 16 gần giống phổ của hợp

chất 15. Sự khác biệt dễ nhận thấy là sự mất đi tín hiệu của nhóm oxymethylene và

thay thế bằng tín hiệu của nhóm methyl bậc 2 [δC 23,74/ δH 1,30 (3H, d, J = 6,5 Hz)]. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất 16 với hợp chất blumenol A [62]

thấy hoàn toàn phù hợp, do đó cho phép khẳng định hợp chất 16 chính là blumenol A.

C 7

1' OH

4.1.17. Hợp chất 17: Icariside B1

Hình 4.55. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 17

Phổ 1H-NMR của hợp chất 17 cho thấy tín hiệu của bốn nhóm methyl singlet

tại δH 1,18, 1,41, 1,42 và 2,21, một proton olefin tại δH 5,86 (1H, s, H-8), một

proton anome tại δH 4,45 (1H, d, J = 7,5 Hz). Tương tự như hợp chát 15 và 16, phân

tích sơ bộ cho biết đây là hợp chất thuộc khung megastigmane và một phân tử đường. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 17 xuất hiện tín hiệu của 19 cacbon,

bao gồm 13 cacbon đặc trưng của khung megastigmane; 6 cacbon tại δC 102,66,

75,07, 78,11, 71,63, 77,87 và 62,72 gợi ý sự có mặt của 1 phân tử đường glucopyranosyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 17 giống với số liệu đã

được công bố của hợp chất icariside B1[11].

Tương tác HMBC giữa H-11 (δH 1,18) và H-12 (δH 1,41) với C-1 (δC

36,99)/C-2 (δC 48,11)/C-6 (δC 120,08); giữa H-11(δH 1,18) với C-12 (δC 29,40);

giữa H-12 (δH 1,41) với C-11 (δC 32,24) khẳng định 2 nhóm methyl tại C-1. Tương

tác HMBC giữa H-8 (δH 5,86) với C-6 (δC 120,08)/C-7 (δC 211,48)/C-9 (δC

200,86)/C-10 (δC 26,53); giữa H-10 (δH 2,21) với C-8 (δC 101,15)/C-9 (δC 200,86)

102

cho phép xác định vị trí nhóm methyl, nhóm cacbonyl tại C-9 và allen tại C-6/C-

7/C-8; tương tác giữa H-13 (δH 1,42) với C-4 (δC 46,61)/C-5 (δC 72,37)/C-6 (δC

120,08) cho phép xác định nhóm methyl, nhóm hydroxyl của aglycone tại C-5.

Tương tác HMBC từ glc H-1' (δH 4,45) đến C-3 (δC 72,57) cho phép xác định vị trí

của glucopyranosyl tại C-3. Điều này cho phép khẳng định hợp chất 17 chính là

icariside B1[11]. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Annona.

Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất 17 và hợp chất tham khảo (@)

(#) DEPT

(@)

C 1 2 δC 36,99 48,11 δC 36,9 C 48,1 CH2

3 4 72,57 46,61 72,6 CH 46,8 CH2

72,37 120,08 211,48 101,15 200,86 26,53 32,24 29,40 30,79 δH - 1,50 (dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz) 2,11 (d, J = 12,0 Hz) 4,37 (tt, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz) 1,47 (dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz) 2,39 (d, J = 12,0 Hz) - - - 5,86 (s) - 2,21 (s) 1,18 (s) 1,41 (s) 1,42 (s) 72,5 C 120,2 C 211,1 C 101,4 CH 202,2 C 27,1 CH3 32,5 CH3 29,3 CH3 30,8 CH3

#δC của icariside B1 đo trong CD3OD [11], @ đo trong CD3OD.

5 6 7 8 9 10 11 12 13 3-O-Glc 1' 2' 3' 4' 5' 6' 102,66 75,07 78,11 71,63 77,87 62,72 102,7 CH 75,1 CH 78,0 CH 71,6 CH 77,9 CH 62,7 CH2 4,46 (d, J = 7,5 Hz) 3,18 (m) 3,36 (m) 3,36 (m) 3,40 (m) 3,71 (dd, J = 5,0 Hz, 12,0 Hz) 3,90 (br d, J = 12,0 Hz)

4.1.18. Hợp chất 18: Icariside D2

Hình 4.56. Cấu trúc hóa học và các tương tác chính của hợp chất 18

103

Hợp chất 18 phân lập được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của

hợp chất 18 xuất hiện tín hiệu của 4 proton thơm tại δH 7,16 (2H, d, J = 8,0 Hz) và

7,04 (2H, d, J = 8,0 Hz) đặc trưng cho vòng thơm thế para, 1 proton anome tại δH 4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz) gợi ý 1 phân tử đường β. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp

chất 18 xuất hiện tín hiệu của 14 cacbon, bao gồm 6 cacbon tại δC 102,56 (C-1ꞌ),

74,95 (C-2ꞌ), 78,11 (C-3ꞌ), 71,42 (C-4ꞌ), 78,02 (C-5ꞌ) và 62,54 (C-6ꞌ) gợi ý sự có mặt

của 1 phân tử đường glucopyranosyl; 6 cacbon tại δC 134,29 (C-1), 130,85 (C-2, 6),

117,82 (C-3, 5), 157,64 (C-4) đặc trưng của vòng thơm và 2 cacbon của phân tử ethan-2-ol-1-yl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 18 khá tương đồng với

hợp chất icariside D2 [14]. Tương tác HMBC giữa glc H-1′ (δH 4,88) với C-4 (δC

157,64) gợi ý phân tử glucopyranosyl tại C-4. Tương tác HMBC giữa H-7 (δH 2,78)

với C-1 (δC 134,29)/C-2 (δC 130,85)/C-6 (δC 130,85)/C-8 (δC 64,36) xác định vị trí của ethan-2-ol-1-yl tại C-1 của vòng thơm. Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của

hợp chất 18 hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ của hợp chất icariside D2. Hợp chất

này lần đầu tiên được phân lập từ chi Annona.

Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất 18 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

(@)

δC 134,29 130,85 117,82 157,64 39,41 64,36 δH - 7,16 (d, J = 8,0 Hz) 7,04 (d, J = 8,0 Hz) - 2,78 (t, J = 7,5 Hz) 3,73 (m) δC 133,9 C 130,5 CH 117,0 CH 157,2 C 39,6 CH2 63,7 CH2

C 1 2, 6 3, 5 4 7 8 4-O-Glc 1ꞌ 2ꞌ 3ꞌ 4ꞌ 5ꞌ 6ꞌ 102,56 74,95 78,11 71,42 78,02 62,54 102,5 CH 75,0 CH 78,8 CH 71,4 CH 78,6 CH 62,5 CH2

#δC của Icariside D2 đo trong C5D5N [14], @ đo trong CD3OD.

4,88 (d, J = 7,5 Hz) 3,46 (m) 3,46 (m) 3,43 (m) 3,46 (m) 3,72 (dd, J = 5,0 Hz, 12,0 Hz) 3,89 (dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz)

104

HOHO

4.1.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside

Hình 4.57. Cấu trúc hóa học của hợp chất 19

Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất 19 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

(@)

δC 134,33 130,96 117,81 157,45 39,36 64,32 δH - 7,08 (d, J = 8,0 Hz) 7,18 (d, J = 8,0 Hz) - 2,79 (t, J = 7,0 Hz) 3,74 (t, J = 7,0 Hz) δC 133,9 C 130,6 CH 117,2 CH 157,2 C 39,6 CH2 63,7 CH2

4,88 (d, J = 7,5 Hz)

102,32 74,93 77,84 71,44 77,34 69,67 102,7 CH 75,1 CH 78,4 CH 71,2 CH 77,6 CH 69,7 CH2

#δC của Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside đo trong C5D5N [20], @ đo trong CD3OD.

C 1 2, 6 3, 5 4 7 8 4-O-Glc 1ꞌ 2ꞌ 3ꞌ 4ꞌ 5ꞌ 6ꞌ 6ꞌ-O-Xyl 1ꞌꞌ 2ꞌꞌ 3ꞌꞌ 4ꞌꞌ 5ꞌꞌ 105,23 74,88 77,56 71,44 66,81 4,36 (d, J = 7,5 Hz) 105,8 CH 74,9 CH 78,2 CH 71,2 CH 67,1 CH2

Hợp chất 19 phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp

chất 19 xuất hiện tín hiệu của 4 proton thơm tại δH 7,18 (2H, d, J = 8,0 Hz) và 7,08

(2H, d, J = 8,0 Hz) đặc trưng của một vòng thơm thế para, 2 proton anome tại δH

4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 4,36 (1H, d, J = 7,5 Hz) gợi ý sự có mặt của 2 phân tử đường. Trên phổ 13C-NMR và DEPT của 19 xuất hiện tín hiệu của 19 cacbon: 2

cacbon bậc 4, 9 methine, 3 methylene tương tự với hợp chất 18 ngoại trừ xuất hiện

thêm 1 phân tử đường xylopyranoside tại C-6ꞌ gợi ý bởi độ chuyển dịch hóa học tại

vị trí này chuyển về vùng trường yếu tại δC 69,67. Tiến hành tra cứu tài liệu tham

105

khảo cho biết số liệu phổ của hợp chất này phù hợp với số liệu phổ của hợp chất

icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside [20]. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập

từ chi Annona.

HO3SO

OCH3

HOHO

OCH3

4.1.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside

20a

20

Hình 4.58. Cấu trúc hóa học của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo Hợp chất 20 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của 20

xuất hiện 3 tín hiệu proton tại δH 6,87 (1H, d, J = 8,5 Hz), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz)

và 6,68 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz) đặc trưng của một vòng thơm có hệ proton dạng

ABX một proton anome tại δH 4,80 (1H, d, J = 7,5 Hz) gợi ý sự có mặt của 1 phân

tử đường và tín hiệu của hai nhóm methoxy tại δH 3,80 (3H, s) và 3,83 (3H, s).

Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

(@)

δC 153,96 104,13 146,06 151,16 113,99 109,36 57,16 56,62 δH - 6,84 (d, J = 2,0 Hz) - - 6,87 (d, J = 8,5 Hz) 6,68 (dd, J = 2,0 Hz, 8,5 Hz) 3,80 (s) 3,83 (s) δC 153,7 C 103,5 CH 145,6 C 150,8 C 113,6 CH 108,9 CH 56,7 CH3 56,3 CH3

4,80 (d, J = 7,5 Hz)

#δC của 3,4-dimethoxyphenyl-1-O-β-D- (6-sulpho)-glucopyranoside (20a) đo trong CD3OD [97], @ đo trong CD3OD.

C 1 2 3 4 5 6 3-OCH3 4-OCH3 1-O-Glc 1ꞌ 2ꞌ 3ꞌ 4ꞌ 5ꞌ 6ꞌ 103,47 74,98 78,05 71,57 78,22 62,64 103,5 CH 74,6 CH 77,5 CH 71,4 CH 76,0 CH 68,2 CH2 3,69 (dd, J = 5,0 Hz, 12,5 Hz) 3,92 (dd, J = 2,5 Hz, 12,5 Hz)

106

Trên phổ 13C-NMR và DEPT của 20 xuất hiện tín hiệu của 14 cacbon, bao

gồm 6 cacbon tại δC 103,47 (C-1ꞌ), 74,98 (C-2ꞌ), 78,05 (C-3ꞌ), 71,57 (C-4ꞌ), 78,22

(C-5ꞌ) và 62,64 (C-6ꞌ) gợi ý sự có mặt của 1 phân tử đường glucopyranosyl; 6

cacbon tại δC 153,96 (C-1), 104,13 (C-2), 146,06 (C-3), 151,16 (C-4), 113,99 (C-5),

109,36 (C-6) đặc trưng của vòng thơm và 2 cacbon oxymethyl tại δC 57,16 (3-

OCH3) và 56,62 (4-OCH3). Số liệu phổ của hợp chất 20 khá tương đồng với số liệu

phổ của hợp chất 3,4-dimethoxyphenyl-1-O-β-D-(6′-sulpho)-glucopyranoside (20a)

[97] ngoại trừ sự khác biệt mạnh về độ chuyển dịch hóa học của C-5′ (ΔδC +2,2

ppm) và C-6′ (ΔδC ‒5,4 ppm), cho thấy sự vắng mặt của nhóm (6′-sulpho) ở hợp chất 20. Mặt khác, bộ số liệu phổ 13C-NMR [103,47 (C-1ꞌ), 74,98 (C-2ꞌ), 78,05 (C-

3ꞌ), 71,57 (C-4ꞌ), 78,22 (C-5ꞌ) và 62,64 (C-6ꞌ)] cũng hoàn toàn phù hợp với sự có

mặt của một đơn vị đường D-glucopyranoside trong hợp chất 20. Từ các phân tích

trên cho phép khẳng định hợp chất 20 là 3,4-dimethoxyphenyl-1-O-β-D-

glucopyranoside. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ chi Annona.

HOOC

4.1.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid

Hình 4.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất 21

Trên phổ 1H-NMR của 21 xuất hiện 3 tín hiệu proton tại δH 6,82 (1H, d, J =

8,0 Hz), 7,44 (1H, d, J = 8,0 Hz) và 7,45 (1H, s) đặc trưng của một vòng thơm có hệ proton dạng ABX. Trên phổ 13C-NMR và DEPT của 21 xuất hiện tín hiệu của 7

cacbon, bao gồm 3 nhóm methine tại δC 115,73, 117,76 và 123,84, 3 cacbon bậc 4

tại δC 123,84, 145,99, 151,33 đặc trưng của vòng thơm và một nhóm cacboxylic tại

δC 170,51. So sánh số liệu phổ của 21 với số liệu phổ của hợp chất 3,4-

dihydroxybenzoic acid [66] thấy số liệu hoàn toàn phù hợp điều này cho phép

khẳng định hợp chất 21 là 3,4-dihydroxybenzoic acid [66]. Hợp chất này lần đầu

tiên được phân lập từ loài A.glabra.

107

Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất 21 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

(@)

#δC của 3,4-dihydroxybenzoic acid đo trong DMSO [66], @ đo trong CD3OD.

C 1 2 3 4 5 6 COOH δC 122,3 C 116,9 CH 145,2 C 150,3 C 115,5 CH 122,0 CH 167,7 C δC 123,84 117,76 145,99 151,33 115,73 123,84 170,51 δH - 7,45 (s) - - 6,82 (d, J = 8,0 Hz) 7,44 (d, J = 8,0 Hz) -

4.1.22. Hợp chất 22: Squamocin M

22

Hình 4.60. Cấu trúc hóa học của hợp chất 22

Hợp chất 22 thu được dưới dạng sáp, màu trắng. Phổ khối lượng ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 629,1 [M+Na]+, cùng với các phổ NMR cho phép xác định công thức phân tử của 22 là C37H66O6, (M = 606). Phổ 1H-NMR của 22 xuất hiện

tín hiệu của 1 proton olefin tại δH 6,98 (br s), 1 nhóm methyl dạng doublet tại δH

1,40 (d, J = 7,0), 1 nhóm methyl dạng triplet tại δH 0,87 (t, J = 6,5 Hz), 7 nhóm

oxymethine và nhiều nhóm methylene tại δH 1,26 gợi ý sự có mặt của khung acetogenin.

Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một acetogenin

với 2 nhóm methyl tại δC 14,08 (C-34), 19,20 (C-37), 8 nhóm methine tại δC 74,05

(C-15/C-24), 77,37 (C-36), 81,76 (C-19/C-20), 83,14 (C-16/C-23) và 148,83 (C-

35); 1 cacbon bậc 4 tại δC 134,34 (C-2) và một nhóm cacbonyl tại δC 173,86 (C-1)

đặc trưng của vòng lacton. Từ các phân tích trên cùng với sự phù hợp hoàn toàn các

dữ liệu phổ NMR của hợp chất squamocin M được công bố trong tài liệu [18], kết

hợp với sự phù hợp về phổ khối lượng tại m/z 629,1. Hơn nữa, squamocin M được

108

thông báo là thành phần acetogenin có trong loài A. glabra [137]. Vì vậy, cho phép

kết luận hợp chất 22 là squamocin M.

Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất 22 và hợp chất tham khảo

(@)

(#) DEPT

29÷30

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 δC δH 173,86 - 134,34 - 25,16 27,40 29,17÷29,72 25,64 33,46 74,05 3,39 (m) 83,14 3,86 (m) 28,39 28,94 81,76 3,86 (m) 81,76 3,86 (m) 28,94 28,39 83,14 3,86 (m) 74,05 3,39 (m) 33,46 25,64 29,17÷29,72 31,90 22,66 14,08 0,87 (t, J = 6,5 Hz) 148,83 6,98 (br s) 77,37 4,99 (m) 19,20 1,40 (d, J = 7,0) δC 173,8 C 134,3 C 25,1 CH2 27,4 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 25,6 CH2 33,5 CH2 74,0 CH 83,1 CH 28,5 CH2 28,9 CH2 81,7 CH 81,7 CH 28,9 CH2 28,5 CH2 83,1 CH 74,0 CH 33,5 CH2 25,6 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 31,9 CH2 22,6 CH2 14,1 CH3 148,8 CH 77,3 CH 19,2 CH3 #δC của squamocin M đo trong CDCl3 [18], @ đo trong CDCl3.

109

Kết luận:

Từ quả loài na biển (A. glabra), sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký đã

phân lập được 22 hợp chất , bao gồm 12 hợp chất khung ent-kaurane, 5 hợp chất

khung megastigmane, 4 hợp chất phenolic và 1 hợp chất acetogenin. Trong số đó,

có 5 chất mới (1, 2, 3, 4, 13), 7 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Annona (5, 14, 15,

17, 18, 19, 20), 2 hợp chất lần đầu phân lập từ loài A. glabra (6, 21).

Cấu trúc hóa học và tên gọi của 22 hợp chất phân lập được từ loài na biển (A.

OGlc

COOGlc

H COOH

glabra) được trình bày trong hình và bảng dưới đây:

COOGlc 2

3 COOGlc 4

1

COOH

H OH

12 5 R = COOGlc 6 R = CH3

10 R = H 11 R = Ac

7 R = CH3 8 R = CHO 9 R = COOH

COOH

OGlc

GlcO

13

16

15

14

COOH

GlcO

OCH3

RO HOHO

GlcO

OCH3

OH 17

20

21 18 R = H 19 R = Xylopyranosyl

22

Hình 4.61. Các hợp chất phân lập được từ loài na biển

Theo các công bố trên thế giới đã có 84 hợp chất được phân lập từ loài na

biển (A. glabra), nhưng với kết quả: 5 chất mới; 7 hợp chất lần đầu phân lập từ chi

Annona và 2 hợp chất lần đầu phân lập từ loài A. glabra gợi ý có sự ảnh hưởng của

yếu tố địa lý đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp.

110

Bảng 4.23. Thống kê hợp chất phân lập được từ loài na biển

KH Hợp chất Lớp chất Tính mới Khối lượng (mg)

5 Mới 4 Mới 1 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid ent-kaurane ent-kaurane 2 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid

19-O-β-D-glucopyranoside ester

ent-kaurane 3 Mới 3 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid

19-O-β-D-glucopyranoside ester

ent-kaurane 3 Mới 4 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid

17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester

* #

6 51 321 7 10 10 217 9 5 Mới ent-kaurane 5 Paniculoside IV ent-kaurane 6 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane ent-kaurane 7 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane 8 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al ent-kaurane 9 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid ent-kaurane ent-kaurane 10 annoglabasin E ent-kaurane 11 annoglabasin B ent-kaurane 12 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid megastigmane 13 (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid

1,3′-di-O-β-D-glucopyranoside

megastigmane 8 * 14 (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid

3′-O-β-D -glucopyranoside

megastigmane megastigmane megastigmane phenolic phenolic phenolic 5 6 5 5 7 6 * * * * * 15 Cucumegastigmane I 16 Blumenol A 17 Icariside B1 18 Icariside D2 19 Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside 20 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-

glucopyranoside

* lần đầu phân lập từ chi Annona, # lần đầu phân lập từ loài A. glabra.

phenolic acetogenin 7 400 # 21 3,4-Dihydroxybenzoic acid 22 Squamocin M

111

4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn

Bảng 4.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết và các phân đoạn từ lá và quả loài na biển (A. glabra)

IC50 (µg/mL) Dịch chiết LU-1 KB Lá Quả Quả Lá

Bộ phận na biển 32,43 ± 2,12 14,59 ± 3,16 38,19 ± 1,23 12,57 ± 3,62 Dịch chiết MeOH Phân đoạn n-hexane 25,15 ± 2,70 16,15 ± 1,04 30,35 ± 1,08 13,10 ± 1,23 Phân đoạn dichloromethane 9,02 ± 1,34 2,21 ± 0,15 6,85 ± 0,11 1,08 ± 0,14 > 100 > 100 Phân đoạn ethyl acetate > 100 3,70 ± 0,98 Phân đoạn nước 0,36 ± 0,08 Ellipticine > 100 > 100 > 100 3,47 ± 0,29 0,34 ± 0,09

Các dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A. glabra) sau khi được

tạo ra, đã được đánh giá sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư

LU-1 và KB. Kết quả cho biết dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A.

glabra) đã thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào là LU-1 và KB

với giá trị IC50 trong khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ± 1,23 µg/mL. Các phân đoạn

sau khi được tạo ra từ lá và quả, bao gồm n-hexane, dichoromethane, ethyl acetate

và nước cũng được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.

So sánh khả năng ức chế sự phát triển hai dòng tế bào ung thư LU-1 và KB

được thử nghiệm của các phân đoạn từ lá và quả cho thấy các phân đoạn từ quả thể

hiện hoạt tính mạnh hơn các phân đoạn từ lá. Đồng thời hai phân đoạn

dichloromethane và nước từ quả đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá

trị IC50 trong khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98. Đây là cơ sở để lựa chọn cho các

nghiên cứu về thành phần hóa học.

4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất

Tất cả các hợp chất được đánh giá hoạt tính độc tế bào trên 5 dòng tế bào

ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2, KB và HL-60. Ellipticine và mitoxantrone được

sử dụng như là chất đối chứng. Kết quả được trình bày ở bảng dưới đây.

Trong số 12 hợp chất thuộc khung ent-kaurane từ quả loài na biển (A.

glabra), hợp chất 3, 4 và 6 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50

112

trong khoảng 0,65 ÷7,39 µM trên 4 dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và

KB; hợp chất megastigmane 14 và 15, phenolic 18 và acetogenin 22 thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB với

giá trị IC50 trong khoảng 2,79 ÷11,17 µM. Các hợp chất 1, 2, 5, 7, 19 và 17 thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình. Các hợp chất còn lại không thể hiện

hoạt tính.

Riêng với dòng tế bào ung thư HL-60 hợp chất 7, 8, 18 và 22 thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 6,94 ÷ 9,38 µM khi so sánh

với mitoxantrone (IC50: 6,8 µM). Cả bốn hợp chất này sau đó đều được đánh giá

khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào thường HEL-299. Theo kết quả thu được,

chỉ có hợp chất 18 và 22 thể hiện độc tính ít (% sống sót tại nồng độ 9,02 và 8,72

µM tương ứng là 93,25 và 94,69 %). Hai hợp chất này sau đó được nghiên cứu sâu

hơn về khả năng gây chết của các hợp chất này có theo cơ chế apoptosis hay không?

Hơn nữa, khi xử lý với hợp chất 18 và 22, kết quả cho thấy số lượng các tế

bào siêu lưỡng bội (hypodiploid cells) ở giai đoạn G1 tăng lên theo thời gian xử lý.

Họ protein Bcl-2 được chia ra thành 2 loại: Bcl-2 là protein ức chế quá trình tự chết

và Bax là tiền protein của quá trình tự chết. Bax kích thích quá trình tự chết của tế

bào thông qua sự giải phóng Cytochrome c từ ty thể. Ngược lại, Bcl-2 ức chế quá

trình giải phóng Cytochrome c. Trong quá trình tự chết, giải phóng cytochrome c

dẫn đến sự cắt (phân giải) Caspase-9, sau đó là sự phân cắt của Caspase-3 và PARP.

Bởi vậy, với mục đích nghiên cứu cơ chế gây nên quá trình tự chết của tế bào,

chúng tôi kiểm tra độ biểu hiện của các protein liên quan tới quá trình này. Khi xử

lý với chất hợp chất 18 (9,0 µM) và 22 (8,7 µM) trong 24 h và 48 h, chúng tôi quan

sát thất sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan tới quá trình tự chết

của tế bào, ví dụ như: tăng cường biểu hiện của Bax, giảm độ biểu hiện của Bcl-2,

phân cắt Caspase 3 và PARP. Những kết quả này cho thấy hợp chất 18 và 22 gây

nên quá trình tự chết của tế bào thông qua làm thay đổi mức độ biểu hiện của các

protein liên quan trong tế bào HL-60.

113

Bảng 4.25. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất 1-22

Hợp chất % ss(*)

62,36 94,10 4,46 4,64 77,97 7,39 55,46 >100 >100 >100 >100 >100 37,94 7,28 11,17 >100 80,91 55,76 >100 58,79 68,22 >100 35,64 6,94 9,38 56,54 66,87 32,61 30,17 25,82 >100 >100 >100 >100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 78,10 82,17

IC50 (µM) LU-1$ MCF-7$ SK-Mel2$ KB$ HL-60# HEL-299# 53,66 58,38 55,68 61,85 80,80 88,47 1,73 1,79 0,65 3,68 4,42 4,06 84,58 80,66 67,07 6,44 3,69 1,70 93,17 23,27 25,59 >100 75,72 >100 >100 >100 >100 >100 74,58 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 18,96 19,93 16,72 6,71 5,36 5,33 5,13 5,58 2,79 >100 >100 >100 90,05 117,0 92,67 7 8,50 6,63 93,97 >100 >100 >100 >100 >100 7,93 9,57 4,04 3,35 10,07 74,43 >100 >100 10,61 3,73 6,30 80,50 >100 >100 6,75 3,50 9,02 49,09 32,23 64,61 8,72 6,8 >100 >100 93,25 94,69

18 19 20 21 22 Ellipticine Mitoxantrone * % sống sót của tế bào thường HEL-299 tại nồng độ thử IC50, # thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, $ thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa sự sống, tăng trưởng và quá trình tự

chết của tế bào. Đặc biệt, AKT dạng hoạt hóa tham gia vào quá trình sống và tăng

trưởng của các tế bào ung thư thông qua protein c-myc. C-myc thường biểu hiện

mạnh ở nhiều dạng khối u. Nhằm tìm hiểu xem con đường tín hiệu nội bào nào bị

ảnh hưởng bởi hợp chất 18 và 22, chúng tôi phân tích quá trình photphorin hóa của

AKT và độ biểu hiện của c-myc bằng thí nghiệm Western-blot. Kết quả cho thấy,

114

sau khi xử lý với hợp chất 18 và 22, quá trình photphorin hóa của AKT bị giảm đi,

dẫn tới các tế bào tự chết. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của c-myc cũng đồng thời

thấp hơn. Đây là những bằng chứng cho thấy tác dụng làm các tế bào chết theo

chương trình của hợp chất 18 và 22 là thông qua sự giảm mức độ biểu hiện của p-

18 (9,0 µM)

22 (8,7 µM)

AKT và c-myc.

Hình 4.62. Mức độ chết theo cơ chế apoptosis của tế bào HL-60 dưới sự

18 (9,0 µM)

22 (8,7 µM)

tác động của hợp chất 18 và 22 tại thời điểm 24 h và 48 h ở nồng độ IC50

Hình 4.63. Ảnh hưởng của hợp chất 18 và 22 đến các biểu hiện ở cấp độ

protein trên dòng tế bào HL-60 ở nồng độ IC50 tại 24 h và 48 h

4.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất

Nitric oxit (NO) được tạo ra với số lượng lớn bởi enzyme tổng hợp Nitric

oxit (iNOS)- NO chịu trách nhiệm với sự giãn mạch máu và tăng huyết áp-biểu hiện

115

trong sốc nhiễm khuẩn và quá trình viêm. Sự sản sinh NO làm thay đổi hoạt tính

gây ức chế sinh trưởng tế bào và gây độc trên các đại thực bào-nhằm chống lại các

vi khuẩn và các tế bào ung thư. NO là nhân tố trung gian của nhiều hoạt động sinh

học như: giãn mạch máu, dẫn truyền thần kinh, ức chế sự kế dính của các tế bào

tiểu cầu, quá trình tấn công các tác nhân gây bệnh của các đại thực bào và các bạch

cầu trung tính. Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng sự sản sinh

NO-được kích hoạt bởi các Cytokine có thể dẫn tới loại bỏ các tác nhân gây bệnh

cũng như các tế bào ung thư, nhưng NO cũng được cho là có liên quan tới việc phá

hủy các tế bào khỏe mạnh bình thường.

NO được tiết ra trong giai đoạn đầu của các căn bệnh miễn dịch cấp tính và

mãn tính, ví dụ như: hen suyễn, viêm khớp, sốc nhiễm khuẩn (hay nhiễm trùng máu)

và một số các bệnh dị ứng khác, hoặc trong quá trình hoạt hóa các tế bào miễn dịch T.

Các hợp chất 1-3, 5-18, 20, 22 được đánh giá sơ bộ tác dụng ức chế sự sản

sinh ra NO, tiết ra bởi LPS của đại thực bào RAW 264.7. Các tế bào được nuôi cấy trong đĩa 24 giếng với số lượng 5×105 tế bào/ mL.

Để đánh giá tác dụng ức chế của các hợp chất đã phân lập đối với sự sản sinh

được xử lý với các hợp chất ở các nồng độ khác nhau trong 24h trong điều kiện có

hoặc không có LPS với nồng độ 1µg/mL. Nồng độ Nitrite được xác định trong môi

trường nổi bởi phản ứng Griess. Đầu tiên, các hợp chất được kiểm tra độ độc của

chúng đối với các tế bào ở nồng độ 30 µM. Sau đó, mỗi hợp chất được sàng lọc về

tác dụng của chúng đối với sự sản sinh NO của các tế bào RAW 264.7-khi đã bị

kích ứng với LPS. Quá trình sàng lọc này được tiến hành ở các nồng độ 0,3, 3, 10

và 30 µM của các hợp chất bởi vì không có tác dụng đáng kể nào được tìm thấy trên

các tế bào. Trong điều kiện không có mặt của các chất thử và LPS, NO được sản

sinh với nồng độ rất ít (3,16 ± 0,27 µM). LPS có tác dụng làm tăng mạnh sản sinh

NO với nồng độ 14,48 ± 0,43 µM. Ở nồng độ 30 µM, hợp chất 1, 3, 8, 12 và 13 gây

giảm mạnh sản sinh NO thấp hơn chất đối chứng dexamethasone. Để có được giá trị

IC50 của các hợp chất có tính ức chế cao, hoạt tính ức chế phụ thuộc vào nồng độ đã

116

được kiểm tra. Các nồng độ thích hợp của mỗi hợp chất được tính toán từ các kết

quả sàng lọc và được sử dụng cho thí nghiệm kiểm tra hoạt tính phụ thuộc nồng độ.

Kết quả cho thấy hợp chất 3 gây ức chế sự sản sinh NO của các đại thực bào RAW

264.7 trong điều kiện bị kích thích bởi LPS, giá trị IC50 của hợp chất này là 0,01

µM; các hợp chất 1, 8, 12 và 13 cũng ức chế đáng kể sự sản sinh NO với các giá trị

IC50 lần lượt là 0,39, 0,32, 0,10 và 0,42 µM. Dexamethasone là một loại thuốc

kháng viêm và kháng lại các bệnh tự miễn, chất này được sử dụng làm đối chứng

dương trong các thí nghiệm. Giá trị IC50 của Dexamethasone là 0,8 µM.

Trong các nghiên cứu trước đây cho thấy các dịch chiết từ loài A. glabra thể

hiện hoạt tính kháng viêm mạnh [29, 43, 143]. Hơn nữa, một số ent-kaurane đã

được ghi nhận là có khả năng ức chế sản sinh NO ở các đại thực bào RAW 264.7

được kích thích bởi LPS [12, 42, 108]. Trong thí nghiệm của chúng tôi, hợp chất 1,

3, 8 và 12 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh (hơn cả đối chứng dương) đối với sự sản

sinh NO trong RAW 264.7 được kích thích bởi LPS với giá trị IC50 trong khoảng từ

0,42 - 0,01 µM. Kết quả này, góp phần khẳng định rằng lớp chất diterpene ent-

kaurane đóng vai trò quyết định đến tính chất kháng viêm của loài thực vật này. Do

vậy, cần nghiên cứu thêm các thí nghiệm kháng viêm của hợp chất 1, 3, 8 và 12 để

định hướng cho thực nghiệm in vivo.

Bảng 4.26. Tác dụng ức chế NO trong đại thực bào

IC50 (µM) 0,39 >30 0,01 3,1 17,06 6,20 0,32 12,1 >30 >30 IC50 (µM) 0,10 0,42 14,7 >30 16,3 >30 1,21 1,84 3,21 0,80 Hợp chất 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 Hợp chất 12 13 14 15 16 17 18 20 22 Dexamethasone

117

KẾT LUẬN

1. Từ cây na biển (Annona glabra) đã phân lập và xác định được cấu trúc

hóa học của 22 hợp chất bao gồm

 5 hợp chất mới:

 4 hợp chất diterpenoid ent-kaurane: 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic

acid (1), 7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-

glucopyranoside ester (2), 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-

O-β-D-glucopyranoside ester (3), 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid

17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester (4);

 1 hợp chất megastigmane: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 1,3′-

di-O-β-D-glucopyranoside (13).

 17 hợp chất đã biết:

 8 hợp chất diterpenoid ent-kaurane: paniculoside IV (5), 16α,17-dihydroxy-

ent-kaurane (6), 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane (7), 16β,17-dihydroxy-ent-

kauran-19-al (8), 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9),

annoglabasin E (10), annoglabasin B (11), 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic

acid (12);

 4 hợp chất megastigmane: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-

β-D-glucopyranoside (14), cucumegastigmane I (15), blumenol A (16),

icariside B1 (17);

 4 hợp chất phenolic: icariside D2 (18), icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside

(19), 3,4-dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside (20), 3,4-

dihydroxybenzoic acid (21);

 1 hợp chất acetogenin: squamocin M (22).

 7 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Annona (5, 14, 15, 17-20), 2 hợp chất lần

đầu phân lập từ loài A. glabra (6, 21);

2. Đã tiến hành sàng lọc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào từ các dịch chiết

methanol, các phân đoạn n-hexane, dichoromethane, ethyl acetate và nước của quả

và lá loài na biển (A. glabra) trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư

118

phổi LU-1. Kết quả cho biết dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A.

glabra) đã thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào là LU-1 và KB

với giá trị IC50 trong khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ± 1,23 µg/mL. Hai phân đoạn

dichloromethane và nước từ quả đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá

trị IC50 trong khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98. Đây là cơ sở quan trọng cho các

nghiên cứu về thành phần hóa học.

3. Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư LU-

1, MCF-7, SK-Mel2 và KB của 22 hợp chất, hợp chất khung ent-kaurane 3, 4 và 6

thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 0,65 ÷7,39 µM;

hợp chất megastigmane 14 và 15, phenolic 18 và acetogenin 22 thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 2,79 ÷11,17 µM trên cả 4 dòng tế

bào ung thư.

4. Hợp chất 18 và 22 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển dòng tế bào ung

thư HL-60 với giá trị IC50 lần lượt là 9,02 và 8,72 µM, đồng thời không thể hiện độc

tính trên dòng tế bào thường HEL-299. Nghiên cứu về cơ chế gây chết tế bào ung

thư của hai hợp chất ngày đã chỉ ra hai hợp chất này gây chết theo chương trình.

Đồng thời các nghiên cứu chuyên sâu western blot ở cấp độ phân tử cũng đã được

nghiên cứu với hợp chất 18 và 22.

5. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm thông qua sự ức chế sự sản sinh NO

trong điều kiện đại thực bào của các hợp chất. Kết quả đã phát hiện ra hợp chất 1, 3,

8, 12, và 13 ức chế sự sản sinh NO mạnh hơn chất đối chứng dexamethasone, với

giá trị IC50 trong khoảng 0,01 ÷ 0,42 µM.

119

KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây na

biển (A. glabra), chúng tôi nhận thấy:

Các hợp chất mới 3, 4 với khung ent-kaurane có hoạt tính ức chế tốt sự phát

triển của 4 dòng tế bào ung thư thực nghiệm (LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB). Vì

vậy, cần thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế, tác dụng dược lý của 2 hợp chất này.

Trong thí nghiệm của chúng tôi, hợp chất 1, 3, 8 và 12 thể hiện hoạt tính ức

chế mạnh (hơn cả đối chứng dương) đối với sự sản sinh NO trong RAW 264.7 được

kích thích bởi LPS với giá trị IC50 trong khoảng từ 0,42 - 0,01 µM. Kết quả này, góp

phần khẳng định rằng lớp chất diterpene ent-kaurane đóng vai trò quyết định đến

tính chất kháng viêm của loài thực vật này. Do vậy, cần nghiên cứu thêm các thí

nghiệm kháng viêm của hợp chất 1, 3, 8 và 12 để định hướng cho thực nghiệm in

vivo.

120

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Thi Thu Hien, Bui Huu Tai, Hoang Le

Tuan Anh, Dan Thi Thuy Hang, Tran Hong Quang, Phan Van Kiem, Chau Van

Minh, Wonmin Ko, Seungjun Lee, Hyuncheol Oh, Seung Hyun Kim, and Young

Ho Kim. New ent-kauranes from the fruits of Annona glabra and their inhibitory

nitric oxide production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. Bioorganic and

Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25, 254-258.

2. Hoang Le Tuan Anh, Nguyen Thi Thu Hien, Dan Thi Thuy Hang, Tran

Minh Ha, Nguyen Xuan Nhiem, Truong Thi Thu Hien, Vu Kim Thu, Do Thi Thao,

Chau Van Minh and Phan Van Kiem. ent-Kaurane Diterpenes from Annona glabra

and Their Cytotoxic Activities. Natural Products Communications, 2014, 9, 1681-

1682.

3. Nguyen Thi Thu Hien, Nguyen Xuan Nhiem, Duong Thi Hai Yen, Dan

Thi Thuy Hang, Bui Huu Tai, Tran Hong Quang, Hoang Le Tuan Anh, Phan Van

Kiem, Chau Van Minh, Eun-Ji Kim, Seung Hyun Kim, Hee Kyoung Kang, and

Young Ho Kim. Chemical constituents of the Annona glabra fruit and their

cytotoxic activity. Pharmaceutical Biology, 2015, 53 (11), 1602-1607.

4. Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Hải Yến, Dương Thị Dung, Đan Thị Thúy

Hằng, Nguyễn Xuân Nhiệm, Trần Minh Đức, Ninh Khắc Bản, Hoàng Lê Tuấn Anh,

Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm. Các hợp chất đitecpenoit phân lập từ quả cây Na

biển Annona glabra (Phần 1). Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (3), 392-395.

5. Nguyễn Thị Thu Hiền, Đan Thị Thúy Hằng, Dương Thị Dung, Nguyễn

Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Hoàng Lê Tuấn Anh, Nguyễn Xuân Nhiệm, Châu

Văn Minh, Phan Văn Kiệm. Các hợp chất đitecpenoit phân lập từ quả loài Na biển

Annona glabra (Phần 2). Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (4), 526-530.

121

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

[1] N.T. Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam - Họ Na (Annonaceae), tr. 316-321.

[2] V.V. Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), 1, tr. 117-118.

[3] Đ.N. Đài (2013), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, thành phần hóa học

tinh dầu của các loài trong họ Na (Annonaceae Juss) ở Bắc Trung Bộ, Luận án

tiến sĩ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

[4] P.H. Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, tr. 242-281.

[5] B.T.M. Nguyệt, P.T. Hằng, T.Đ. Thắng, Đ.N. Đài, T.M. Hợi (2011), Thành

phần axit béo từ hạt của loài mãng câu xiêm (Annona muricata L.) và nê

(Annona glabra L.) ở Việt Nam, Hội nghị khoa học toàn quốc về Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật lần thứ 4.

[6] T.G. McCloud, D.L. Smith, C.J. Chang, J.M. Cassady (1987), "Annonacin, a

novel, biologically active polyketide from Annona densicoma", Experientia 43,

pp. 947-949.

Tiếng Anh:

[7] L. Bingtao M.G. Gilber Annonaceae, 19, tr.

[8] C.B. Cochrane, P.K.R. Nair, S.J. Melnik, A.P. Resek, C. Ramachandran

(2008), "Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human leukemia

cell lines", Anticancer Research 28, pp. 965-971.

[9] L. Harinantenaina, R. Kasai, K. Yamasaki (2002), "A new ent-kaurane

diterpenoid glycoside from the leaves of Cussonia bojeri, a malagasy endemic

plant", Chemical & Pharmaceutical Bulletin 50, pp. 1122-1123.

[10] K. Hisaihiro, B. Masaki, O. Toru (2007), "Two new megastigmanes from the

leaves of Cucumis Sativus", Chemical & Pharmaceutical Bulletin 55, pp. 133-

136.

[11] M. Hisamoto, H. Kikuzaki, N. Nakatani (2004), "Constituents of the leaves of

Peucedanum japonicum Thunb. and their biological activity", Journal of

Agricultural and Food Chemistry 52, pp. 445-450.

122

[12] H. Lim, H.A. Jung, J.S. Choi, Y.S. Kim, S.S. Kang, H.P. Kim (2009), "Anti-

inflammatory activity of the constituents of the roots of Aralia continentalis",

Archives of Pharmacal Research 32, pp. 1237-1243.

[13] F. Macías, A. López, R. Varela, A. Torres, J.G. Molinillo (2008),

"Helikauranoside A, a new bioactive diterpene", Journal of Chemical Ecology

34, pp. 65-69.

[14] T. Miyase, A. Ueno, N. Takizawa, H. Kobayashi, H. Oguchi (1989), "Ionone

and lignan glycosides from Epimedium diphyllum", Phytochemistry 28, pp.

3483-3485.

[15] H. Miyashita, M. Nishida, M. Okawa, T. Nohara, H.Y. Oshimitsu (2010),

"Four New ent-Kaurane Diterpenoids from the Fruits of Annona cherimola",

Chemical & Pharmaceutical Bulletin 58, pp. 765-768.

[16] N.T. Ngan, T.H. Quang, B.H. Tai, S.B. Song, D. Lee, Y.H. Kim (2012),

"Anti-inflammatory and PPAR transactivational effects of components from the

stem bark of Ginkgo biloba", Journal of Agricultural and Food Chemistry 60,

pp. 2815-2824.

[17] N.X. Nhiem, N.H. Tung, P.V. Kiem, C.V. Minh, Y. Ding, J.H. Hyun, H.K.

Kang, Y.H. Kim (2009), "Lupane triterpene glycosides from leave of

Acanthopanax koreanum and their cytotoxic activity", Chemical &

Pharmaceutical Bulletin 57, pp. 986-9.

[18] M. Sahai, S. Singh, M. Singh, Y.K. Gupta, S. Akashi, R. Yuji, K. Hirayama,

H. Asaki, H. Araya, N. Hara, T. Eguchi, K. Kakinuma, Y. Fujimoto (1994),

"Annonaceous acetogenins from the seeds of Annona squamosa. Adjacent bis-

tetrahydrofuranic acetogenins", Chemical & Pharmaceutical Bulletin 42, pp.

1163-1174.

[19] V.T. Tam, P.Q. Hieu, B. Chappe, F. Roblot, B. Figadere, A. Cave (1995),

"Reticulatain-1 and -2 with reticulatamone: three new polyketides from the

seeds of Annona reticulata", Bulletin de la Societe Chimique de France 132, pp.

324-329.

123

[20] C. Zhao, W. Cao, A. Nagatsu, Y. Ogihara (2001), "Three new glycosides

from Sinopodophyllum emodi (Wall.) Ying", Chemical & Pharmaceutical

Bulletin 49, pp. 1474-1476.

[21] F.Q. Alali, X.-X. Liu, J.L. McLaughlin (1999), "Annonaceous Acetogenins:

Recent Progress", Journal of Natural Products 62, pp. 504-540.

[22] H. Araya, M. Sahai, S. Singh, A.K. Singh, M. Yoshida, N. Hara, Y. Fujimoto

(2002), "Squamocin-O1 and squamocin-O2, new adjacent bis-tetrahydrofuran

acetogenins from the seeds of Annona squamosa", Phytochemistry 61, pp. 999-

1004.

[23] F.R. Campos, R.L. Batista, C.L. Batista, E.V. Costa, A. Barison, A.G. dos

Santos, M.L.B. Pinheiro (2008), "Isoquinoline alkaloids from leaves of Annona

sericea (Annonaceae)", Biochemical Systematics and Ecology 36, pp. 804-806.

[24] F.-R. Chang, J.-L. Chen, C.-Y. Lin, H.-F. Chiu, M.-J. Wu, Y.-C. Wu (1999),

"Bioactive acetogenins from the seeds of Annona atemoya", Phytochemistry 51,

pp. 883-889.

[25] F.-R. Chang, P.-Y. Yang, J.-Y. Lin, K.-H. Lee, Y.-C. Wu (1998), "Bioactive

kaurane diterpenoids from Annona glabra", Journal of Natural Products 61, pp.

437-439.

[26] F.-R. Chang, C.-Y. Chen, P.-H. Wu, R.-Y. Kuo, Y.-C. Chang, Y.-C. Wu

(2000), "New alkaloids from Annona purpurea", Journal of Natural Products 63,

pp. 746-748.

[27] F.-R. Chang Y.-C. Wu (2001), "Novel cytotoxic annonaceous acetogenins

from Annona muricata", Journal of Natural Products 64, pp. 925-931.

[28] F.-R. Chang, J.-L. Wei, C.-m. Teng, Y.-C. Wu (1998), "Two new 7-

dehydroaporphine alkaloids and antiplatelet action aporphines from the leaves

of Annona purpurea", Phytochemistry 49, pp. 2015-2018.

[29] M.J. Chavan, P.S. Wakte, D.B. Shinde (2010), "Analgesic and anti-

inflammatory activity of Caryophyllene oxide from Annona squamosa L. bark",

Phytomedicine 17, pp. 149-151.

124

[30] D. Chávez R. Mata (1999), "Purpuracenin: a new cytotoxic adjacent bis-

tetrahydrofuran annonaceous acetogenin from the seeds of Annona purpurea",

Phytochemistry 50, pp. 823-828.

[31] C.-H. Chen, T.-J. Hsieh, T.-Z. Liu, C.-L. Chern, P.-Y. Hsieh, C.-Y. Chen

(2004), "Annoglabayin, a novel dimeric kaurane diterpenoid, and apoptosis in

Hep G2 cells of annomontacin from the fruits of Annona glabra", Journal of

Natural Products 67, pp. 1942-1946.

[32] C.-Y. Chen, F.-R. Chang, H.-F. Yen, Y.-C. Wu (1998), "Amides from stems

of Annona cherimola", Phytochemistry 49, pp. 1443-1447.

[33] C.-Y. Chen, F.-R. Chang, H.-F. Chiu, M.-J. Wu, Y.-C. Wu (1999), "Aromin-

A, an annonaceous acetogenin from Annona cherimola", Phytochemistry 51, pp.

429-433.

[34] C.-Y. Chen, F.-R. Chang, Y.-C. Wu (1997), "Cherimoline, a novel alkaloid

from the stems of Annona cherimola", Tetrahedron Letters 38, pp. 6247-6248.

[35] C.-Y. Chen, F.-R. Chang, Y.-C. Wu (1998), "Cherinonaine, a novel dimeric

amide from the stems of Annona cherimola", Tetrahedron Letters 39, pp. 407-

410.

[36] C.-Y. Chen, F.-R. Chang, C.-P. Cho, Y.-C. Wu (2000), "Ent-kaurane

diterpenoids from Annona glabra", Journal of Natural Products 63, pp. 1000-

1003.

[37] C.-Y. Chen, F.-R. Chang, W.-B. Pan, Y.-C. Wu (2001), "Four alkaloids from

Annona cherimola", Phytochemistry 56, pp. 753-757.

[38] Y. Chen, S.-s. Xu, J.-w. Chen, Y. Wang, H.-q. Xu, N.-b. Fan, X. Li (2012),

"Anti-tumor activity of Annona squamosa seeds extract containing annonaceous

acetogenin compounds", Journal of Ethnopharmacology 142, pp. 462-466.

[39] Y. Chen, J.-w. Chen, X. Li (2011), "Cytotoxic Bistetrahydrofuran

Annonaceous Acetogenins from the Seeds of Annona squamosa", Journal of

Natural Products 74, pp. 2477-2481.

125

[40] Y. Chen, J.-w. Chen, X. Li (2012), "Monotetrahydrofuran annonaceous

acetogenins from the seeds of Annona squamosa", Phytochemistry Letters 5, pp.

33-36.

[41] Y. Chen, J.-w. Chen, Y. Wang, S.-s. Xu, X. Li (2012), "Six cytotoxic

annonaceous acetogenins from Annona squamosa seeds", Food Chemistry 135,

pp. 960-966.

[42] R.J. Choi, E.M. Shin, H.A. Jung, J.S. Choi, Y.S. Kim (2011), "Inhibitory

effects of kaurenoic acid from Aralia continentalis on LPS-induced

inflammatory response in RAW264.7 macrophages", Phytomedicine 18, pp.

677-682.

[43] P.-H. Chuang, P.-W. Hsieh, Y.-L. Yang, K.-F. Hua, F.-R. Chang, J. Shiea, S.-

H. Wu, Y.-C. Wu (2008), "Cyclopeptides with Anti-inflammatory Activity from

Seeds of Annona montana", Journal of Natural Products 71, pp. 1365-1370.

[44] E.V. Costa, M.L.B. Pinheiro, C.M. Xavier, J.R.A. Silva, A.C.F. Amaral,

A.D.L. Souza, A. Barison, F.R. Campos, A.G. Ferreira, G.M.C. Machado,

L.L.P. Leon (2006), "A Pyrimidine-β-carboline and Other Alkaloids from

Annona foetida with Antileishmanial Activity", Journal of Natural Products 69,

pp. 292-294.

[45] P.E.O. da Cruz, E.V. Costa, V.R.d.S. Moraes, P.C.d.L. Nogueira, M.E.

Vendramin, A. Barison, A.G. Ferreira, A.P.d.N. Prata (2011), "Chemical

constituents from the bark of Annona salzmannii (Annonaceae)", Biochemical

Systematics and Ecology 39, pp. 872-875.

[46] E.L.M. Da Silva, F. Roblot, O. Laprévote, L. Sérani, A. Cavé (1997),

"Coriaheptocins A and B, the first heptahydroxylated acetogenins, isolated from

the Roots of Annona coriacea", Journal of Natural Products 60, pp. 162-167.

[47] Đ.N. Đài (2001), "Tài nguyên cây thuốc họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam",

Tạp chí Khoa học và Công nghệ 49, pp. 1-6.

[48] Q.L. Dang, W.K. Kim, C.M. Nguyen, Y.H. Choi, G.J. Choi, K.S. Jang, M.S.

Park, C.H. Lim, N.H. Luu, J.-C. Kim (2011), "Nematicidal and antifungal

activities of annonaceous acetogenins from Annona squamosa against various

126

plant pathogens", Journal of Agricultural and Food Chemistry 59, pp. 11160-

11167.

[49] P. Duret, R. Hocquemiller, A. Cavé (1997), "Annonisin, a bis-tetrahydrofuran

acetogenin from Annona atemoya seeds", Phytochemistry 45, pp. 1423-1426.

[50] L.M. Dutra, E.V. Costa, V.R.d.S. Moraes, P.C.d.L. Nogueira, M.E.

Vendramin, A. Barison, A.P.d.N. Prata (2012), "Chemical constituents from the

leaves of Annona pickelii (Annonaceae)", Biochemical Systematics and Ecology

41, pp. 115-118.

[51] S. Etcheverry, S. Sahpaz, D. Fall, A. Laurens, A. Cavé (1995), "Annoglaucin,

an acetogenin from Annona glauca", Phytochemistry 38, pp. 1423-1426.

[52] P.L. Falé, C. Ferreira, F. Maruzzella, M. Helena Florêncio, F.N. Frazão,

M.L.M. Serralheiro (2013), "Evaluation of cholesterol absorption and

biosynthesis by decoctions of Annona cherimola leaves", Journal of

Ethnopharmacology 150, pp. 718-723.

[53] M.O. Fatope, O.T. Audu, Y. Takeda, L. Zeng, G. Shi, H. Shimada, J.L.

McLaughlin (1996), "Bioactive ent-kaurene diterpenoids from Annona

senegalensis", Journal of Natural Products 59, pp. 301-303.

[54] T. Gallardo, R. Aragon, J.R. Tormo, M.A. Blázquez, M.C. Zafra-Polo, D.

Cortes (1998), "Acetogenins from Annona glabra seeds", Phytochemistry 47,

pp. 811-816.

[55] C. Gleye, P. Duret, A. Laurens, R. Hocquemiller, A. Cavé (1998), "Cis-

monotetrahydrofuran acetogenins from the roots of Annona muricata", Journal

of Natural Products 61, pp. 576-579.

[56] C. Gleye, A. Laurens, R. Hocquemiller, O. Laprévote, L. Serani, A. Cavé

(1997), "Cohibins A and B, acetogenins from roots of Annona muricata",

Phytochemistry 44, pp. 1541-1545.

[57] C. Gleye, S. Raynaud, C. Fourneau, A. Laurens, O. Laprévote, L. Serani, A.

Fournet, R. Hocquemiller (2000), "Cohibins C and D, two important metabolites

in the biogenesis of acetogenins from Annona muricata and Annona nutans",

Journal of Natural Products 63, pp. 1192-1196.

127

[58] C. Gleye, A. Laurens, O. Laprévote, L. Serani, R. Hocquemiller (1999),

"Isolation and structure elucidation of sabadelin, an acetogenin from roots of

Annona muricata", Phytochemistry 52, pp. 1403-1408.

[59] C. Gleye, A. Laurens, R. Hocquemiller, A. Cavé, O. Laprévote, L. Serani

(1997), "Isolation of montecristin, a key metabolite in biogenesis of acetogenins

from Annona muricata and its structure elucidation by using tandem mass

spectrometry", The Journal of Organic Chemistry 62, pp. 510-513.

[60] C. Gleye, S. Raynaud, R. Hocquemiller, A. Laurens, C. Fourneau, L. Serani,

O. Laprévote, F. Roblot, M. Leboeuf, A. Fournet, A. Rojas De Arias, B.

Figadere, A. Cavé (1998), "Muricadienin, muridienins and chatenaytrienins, the

early precursors of annonaceous acetogenins", Phytochemistry 47, pp. 749-754.

[61] C. Gleye, A. Laurens, R. Hocquemiller, B. Figadère, A. Cavé (1996),

"Muridienin-1 and -2: The missing links in the biogenetic precursors of

acetogenins of annonaceae", Tetrahedron Letters 37, pp. 9301-9304.

[62] A.G. González, J.A. Guillermo, A.G. Ravelo, I.A. Jimenez, M.P. Gupta

(1994), "4,5-Dihydroblumenol A, a new nor-isoprenoid from Perrottetia

multiflora", Journal of Natural Products 57, pp. 400-402.

[63] Z.-M. Gu, L. Zeng, J.T. Schwedler, K.V. Wood, J.L. McLaughlin (1995),

"New bioactive adjacent bis-THF annonaceous acetogenins from Annona

bullata", Phytochemistry 40, pp. 467-477.

[64] R.K. Gupta, A.N. Kesari, P.S. Murthy, R. Chandra, V. Tandon, G. Watal

(2005), "Hypoglycemic and antidiabetic effect of ethanolic extract of leaves of

Annona squamosa L. in experimental animals", Journal of Ethnopharmacology

99, pp. 75-81.

[65] R.K. Gupta, A.N. Kesari, S. Diwakar, A. Tyagi, V. Tandon, R. Chandra, G.

Watal (2008), "In vivo evaluation of anti-oxidant and anti-lipidimic potential of

Annona squamosa aqueous extract in Type 2 diabetic models", Journal of

Ethnopharmacology 118, pp. 21-25.

128

[66] M. Guria, P. Mitra, T. Ghosh, S. Gupta, B. Basu, P.K. Mitra (2013), "3, 4

diHydroxyBenzoic acid Isolated from the Leaves of Ageratum conyzoides L.",

European Journal of Biotechnology and Bioscience 1, pp. 25-28.

[67] A. Hisham, U. Sreekala, L. Pieters, T.D. Bruyne, H. Van den Heuvel, M.

Claeys (1993), "Epoxymurins A and B, two biogenetic precursors of

annonaceous acetogenins from Annona muricata", Tetrahedron 49, pp. 6913-

6920.

[68] D.C. Hopp, F.Q. Alali, Z.-M. Gu, J.L. McLaughlin (1998), "Mono-THF ring

annonaceous acetogenins from Annona squamosa", Phytochemistry 47, pp. 803-

809.

[69] D.C. Hopp, L. Zeng, Z.-m. Gu, J.F. Kozlowski, J.L. McLaughlin (1997),

"Novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins, from the bark of Annona

squamosa, showing cytotoxic selectivities for the Human Pancreatic Carcinoma

cell line, PACA-2", Journal of Natural Products 60, pp. 581-586.

[70] D.C. Hopp, F.Q. Alali, Z.-m. Gu, J.L. McLaughlin (1998), "Three new

bioactive bis-adjacent THF-ring acetogenins from the bark of Annona

squamosa", Bioorganic & Medicinal Chemistry 6, pp. 569-575.

[71] T.-J. Hsieh, Y.-C. Wu, S.-C. Chen, C.-S. Huang, C.-Y. Chen (2004),

"Chemical constituents from Annona glabra", Journal of the Chinese Chemical

Society 51, pp. 869-876.

[72] T.-J. Hsieh, Y.-C. Wu, S.-C. Chen, C.-S. Huang, C.-Y. Chen (2004),

"Chemical constituents from Annona glabra", Journal of the Chinese Chemical

Society 51, pp. 869-876.

[73] M.C. Jaramillo, G.J. Arango, M.C. González, S.M. Robledo, I.D. Velez

(2000), "Cytotoxicity and antileishmanial activity of Annona muricata

pericarp", Fitoterapia 71, pp. 183-186.

[74] Jayendra Y. Kumar (2013), "New compound 6,7-dimethoxy-2-

methylisoquinolinium from Indian medicinal plant Annona squamosa L",

International Journal of Chemical and Analytical Science 4, pp. 161-168.

129

[75] Jayendra, Y. Kumar, S.S. Kumar (2013), "Two new tetrahydroisoquinoline

analogs from Indian medicinal plant Annona squamosa", Journal of Pharmacy

Research 7, pp. 510-515.

[76] R.-W. Jiang, Y. Lu, Z.-D. Min, Q.-T. Zheng (2003), "Molecular structure and

pseudopolymorphism of squamtin a from Annona squamosa", Journal of

Molecular Structure 655, pp. 157-162.

[77] T.E. Joseph, I.G. Alexander, G.W. Peter (1987), "Chemistry in the

annonaceae, XXIV. Kaurane and kaur-16-ene diterpenes from the stem bark of

Annona reticulata", Journal of Natural Products 50, pp. 979-983.

[78] D.H. Kim, E.S. Ma, K.D. Suk, J.K. Son, J.S. Lee, M.H. Woo (2001),

"Annomolin and annocherimolin, new cytotoxic annonaceous acetogenins from

Annona cherimolia seeds", Journal of Natural Products 64, pp. 502-506.

[79] G.-S. Kim, L. Zeng, F. Alali, L.L. Rogers, F.-E. Wu, S. Sastrodihardjo, J.L.

McLaughlin (1998), "Muricoreacin and murihexocin C, mono-tetrahydrofuran

acetogenins, from the leaves of Annona muricata in honour of professor G. H.

Neil Towers 75th birthday", Phytochemistry 49, pp. 565-571.

[80] G.-s. Kim, L. Zeng, F. Alali, L.L. Rogers, F.-E. Wu, J.L. McLaughlin, S.

Sastrodihardjo (1998), "Two New Mono-Tetrahydrofuran Ring Acetogenins,

Annomuricin E and Muricapentocin, from the Leaves of Annona muricata",

Journal of Natural Products 61, pp. 432-436.

[81] C.-M. Li, N.-H. Tan, H.-L. Zheng, Q. Mu, X.-J. Hao, Y.-N. He, J. Zou

(1998), "Cyclopeptide from the seeds of Annona muricata", Phytochemistry 48,

pp. 555-556.

[82] C.-M. Li, N.-H. Tan, Q. Mu, H.-L. Zheng, X.-J. Hao, Y. Wu, J. Zhou (1997),

"Cyclopeptide from the seeds of Annona squamosa", Phytochemistry 45, pp.

521-523.

[83] C.-M. Li, N.-H. Tan, Q. Mu, H.-L. Zheng, X.-J. Hao, H.-L. Liang, J. Zhou

(1998), "Cyclopeptides from the seeds of Annona glabra", Phytochemistry 47,

pp. 1293-1296.

130

[84] C.-M. Li, N.-H. Tan, H.-L. Zheng, Q. Mu, X.-J. Hao, Y.-N. He, J. Zhou

(1999), "Cyclopeptides from the seeds of Annona glabra", Phytochemistry 50,

pp. 1047-1052.

[85] C.-C. Liaw, Y.-L. Yang, M. Chen, F.-R. Chang, S.-L. Chen, S.-H. Wu, Y.-C.

Wu (2008), "Mono-tetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins from Annona

squamosa as Cytotoxic Agents and Calcium Ion Chelators", Journal of Natural

Products 71, pp. 764-771.

[86] C.-C. Liaw, F.-R. Chang, Y.-C. Wu, H.-K. Wang, Y. Nakanishi, K.F. Bastow,

K.-H. Lee (2004), "Montacin and cis-montacin, two new cytotoxic

monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins from Annona montana", Journal

of Natural Products 67, pp. 1804-1808.

[87] C.-C. Liaw, F.-R. Chang, C.-Y. Lin, C.-J. Chou, H.-F. Chiu, M.-J. Wu, Y.-C.

Wu (2002), "New cytotoxic monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins

from Annona muricata", Journal of Natural Products 65, pp. 470-475.

[88] C.-C. Liaw, F.-R. Chang, S.-L. Chen, C.-C. Wu, K.-H. Lee, Y.-C. Wu (2005),

"Novel cytotoxic monotetrahydrofuranic Annonaceous acetogenins from

Annona montana", Bioorganic & Medicinal Chemistry 13, pp. 4767-4776.

[89] L.A.R.S. Lima, L.P.S. Pimenta, M.A.D. Boaventura (2010), "Acetogenins

from Annona cornifolia and their antioxidant capacity", Food Chemistry 122,

pp. 1129-1138.

[90] L.A.R.S. Lima, S. Johann, P.S. Cisalpino, L.P.S. Pimenta, M.A.D.

Boaventura (2011), "Antifungal activity of 9-hydroxy-folianin and sucrose

octaacetate from the seeds of Annona cornifolia A. St. -Hil. (Annonaceae)",

Food Research International 44, pp. 2283-2288.

[91] X.-X. Liu, F.Q. Alali, D.C. Hopp, L.L. Rogers, E. Pilarinou, J.L. McLaughlin

(1998), "Glabracins A and B, two new acetogenins from Annona glabra",

Bioorganic & Medicinal Chemistry 6, pp. 959-965.

[92] X.-X. Liu, F.Q. Alali, E. Pilarinou, J.L. McLaughlin (1998), "Glacins A and

B: Two novel bioactive mono-tetrahydrofuran acetogenins from Annona

glabra", Journal of Natural Products 61, pp. 620-624.

131

[93] X.-X. Liu, E. Pilarinou, J.L. McLaughlin (1999), "Pondaplin: A novel cyclic

prenylated phenylpropanoid

from Annona glabra", Tetrahedron Letters 40, pp. 399-402.

[94] X.-X. Liu, F.Q. Alali, E. Pilarinou, J.L. McLaughlin (1999), "Two bioactive

mono-tetrahydrofuran acetogenins, annoglacins A and B, from Annona glabra",

Phytochemistry 50, pp. 815-821.

[95] X.-X. Liu, E. Pilarinou, J.L. McLaughlin (1999), "Two Novel Acetogenins,

Annoglaxin and 27-Hydroxybullatacin, from Annona glabra", Journal of

Natural Products 62, pp. 848-852.

[96] Z. Lu, E.W. Feng, J.L. McLaughlin (1995), "Annohexocin, a novel mono-

THF acetogenin with six hydroxyls, from Annona muricata (Annonaceae)",

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5, pp. 1865-1868.

[97] Mariateresa Maldini, Paola Montoro, Sonia Piacente, C. Pizza (2009),

"Phenolic compounds from Bursera simaruba Sarg. bark: Phytochemical

investigation and quantitative analysis by tandem mass spectrometry",

Phytochemistry 70, pp. 641–649.

[98] M. Martínez-Vázquez, D.G. De la Cueva Lozano, R. Estrada-Reyes, N.M.

González-Lugo, T. Ramírez Apan, G. Heinze (2005), "Bio-guided isolation of

the cytotoxic corytenchine and isocoreximine from roots of Annona

cherimolia", Fitoterapia 76, pp. 733-736.

[99] S. Matsumoto, R.M. Varela, M. Palma, J.M.G. Molinillo, I.S. Lima, C.G.

Barroso, F.A. Macías (2014), "Bio-guided optimization of the ultrasound-

assisted extraction of compounds from Annona glabra L. leaves using the

etiolated wheat coleoptile bioassay", Ultrasonics Sonochemistry 21, pp. 1578-

1584.

[100] E.L. Meneses da Silva, F. Roblot, J. Mahuteau, A. Cavé (1996),

"Coriadienin, the first annonaceous acetogenin with two double bonds isolated

from Annona coriaceae", Journal of Natural Products 59, pp. 528-530.

132

[101] B.S. Mootoo, A. Ali, A. Khan, W.F. Reynolds, S. McLean (2000), "Three

novel monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins from Annona montana",

Journal of Natural Products 63, pp. 807-811.

[102] H. Morita, Y. Sato, J.i. Kobayashi (1999), "Cyclosquamosins A – G, cyclic

peptides from the seeds of Annona squamosa", Tetrahedron 55, pp. 7509-7518.

[103] H. Morita, Y. Sato, K.-L. Chan, C.-Y. Choo, H. Itokawa, K. Takeya, J.i.

Kobayashi (2000), "Samoquasine A, a benzoquinazoline alkaloid from the seeds

of Annona squamosa", Journal of Natural Products 63, pp. 1707-1708.

[104] E. Nandhakumar P. Indumathi (2013), "In vitro antioxidant activities of

methanol and aqueous extract of Annona squamosa (L.) fruit pulp", Journal of

Acupuncture and Meridian Studies 6, pp. 142-148.

[105] L.P. Padhi, S.K. Panda, S.N. Satapathy, S.K. Dutta (2011), "In vitro

evalution of antibacterial potential of Annona squamosa Linn and Annona

reticulata L. from similipal biosphere reserve, orissa, India", Journal of

agricultural Technology 7, pp. 133-142.

[106] P. Padma, N.P. Pramod, S.P. Thyagarajan, R.L. Khosa (1998), "Effect of the

extract of Annona muricata and Petunia nyctaginiflora on Herpes simplex

virus", Journal of Ethnopharmacology 61, pp. 81-83.

[107] V. Padmaja, V. Thankamany, N. Hara, Y. Fujimoto, A. Hisham (1995),

"Biological activities of Annona glabra", Journal of Ethnopharmacology 48, pp.

21-24.

[108] H.-J. Park, I.-T. Kim, J.-H. Won, S.-H. Jeong, E.-Y. Park, J.-H. Nam, J.

Choi, K.-T. Lee (2007), "Anti-inflammatory activities of ent-16αH,17-hydroxy-

kauran-19-oic acid isolated from the roots of Siegesbeckia pubescens are due to

the inhibition of iNOS and COX-2 expression in RAW 264.7 macrophages via

NF-κB inactivation", European Journal of Pharmacology 558, pp. 185-193.

[109] E.F. Queiroz, F. Roblot, A. Cavé, R. Hocquemiller, L. Serani, O. Laprévote,

M.d.Q. Paulo (1999), "A new bistetrahydrofuran acetogenin from the roots of

Annona salzmanii", Journal of Natural Products 62, pp. 710-713.

133

[110] E.F. Queiroz, F. Roblot, A. Cavé, M. de Q. Paulo, A. Fournet (1996),

"Pessoine and spinosine, two catecholic berbines from Annona spinescens",

Journal of Natural Products 59, pp. 438-440.

[111] E.F. Queiroz, F. Roblot, O. Laprévote, L. Serani, A. Cavé (1997),

"Spinencin, a New Bis-tetrahydrofuran Acetogenin from the Seeds of Annona

spinescens", Journal of Natural Products 60, pp. 760-765.

[112] E.F. Queiroz, F. Roblot, B. Figadère, A. Laurens, P. Duret, R. Hocquemiller,

A. Cavé, L. Serani, O. Laprévote, J. Cotte-Laffitte, A.-M. Quéro (1998), "Three

new bistetrahydrofuran acetogenins from the seeds of Annona spinescens",

Journal of Natural Products 61, pp. 34-39.

[113] E.F. Queiroz, F. Roblot, O. Laprévote, M.d.Q. Paulo, R. Hocquemiller

(2003), "Two unusual acetogenins from the roots of Annona salzmanii", Journal

of Natural Products 66, pp. 755-758.

[114] C.Y. Ragasa, G. Soriano, O.B. Torres, M.-J. Don, C.-C. Shen (2012),

"Acetogenins from Annona muricata", Pharmacognosy Journal 4, pp. 32-37.

[115] M.J. Rieser, Z.-M. Gu, X.-P. Fang, L. Zeng, K.V. Wood, J.L. McLaughlin

(1996), "Five novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins from the seeds of

Annona muricata", Journal of Natural Products 59, pp. 100-108.

[116] F. Roblot, T. Laugel, M. Lebœuf, A. Cavé, O. Laprévote (1993), "Two

acetogenins from Annona muricata seeds", Phytochemistry 34, pp. 281-285.

[117] S. Sahpaz, Carmen, M. González, R. Hocquemiller, M.C. Zafra-Polo, D.

Cortes (1996), "Annosenegalin and annogalene: Two cytotoxic mono-

tetrahydrofuran acetogenins from Annona senegalensis and Annona

cherimolia", Phytochemistry 42, pp. 103-107.

[118] L.A.R.D. Santos, M.A.D. Boaventura, L.P.S. Pimenta (2006), "Cornifolin, a

new bis-tetrahydrofuran Annonaceous acetogenin from Annona cornifolia",

Biochemical Systematics and Ecology 34, pp. 78-82.

[119] L.P. Santos, M.A.D. Boaventura, N.J. Sun, J.M. Cassady, A.B. De Oliveira

(1996), "Araticulin, a bis-tetrahydrofuran polyketide from Annona itcrassiflora

seeds", Phytochemistry 42, pp. 705-707.

134

[120] A. Shirwaikar, K. Rajendran, C. Dinesh Kumar, R. Bodla (2004),

"Antidiabetic activity of aqueous leaf extract of Annona squamosa in

streptozotocin–nicotinamide type 2 diabetic rats", Journal of

Ethnopharmacology 91, pp. 171-175.

[121] V.K. Soni, D.K. Yadav, N. Bano, P. Dixit, M. Pathak, R. Maurya, M. Sahai,

S.K. Jain, S. Misra-Bhattacharya (2012), "N-methyl-6, 7-

dimethoxyisoquinolone in Annona squamosa twigs is the major immune

modifier to elicit polarized Th1 immune response in BALB/c mice", Fitoterapia

83, pp. 110-116.

[122] V.T. Tam, C. Chaboche, B. Figadère, B. Chappe, B.C. Hieu, A. Cavé

(1994), "First synthesis of a new acetogenin of annonaceae, reticulatamol:

Activated tin hydride with enhanced reducing ability", Tetrahedron Letters 35,

pp. 883-886.

[123] S.-F. Tsai S.-S. Lee (2010), "Characterization of acetylcholinesterase

inhibitory constituents from Annona glabra assisted by HPLC

microfractionation", Journal of Natural Products 73, pp. 1632-1635.

[124] M.E. Vendramin, E.V. Costa, É. Pereira dos Santos, M.L. Belém Pinheiro,

A. Barison, F.R. Campos (2013), "Chemical constituents from the leaves of

Annona rugulosa (Annonaceae)", Biochemical Systematics and Ecology 49, pp.

152-155.

[125] A.-I. Waechter, M. Szlosek, R. Hocquemiller, A. Laurens, A. Cavé (1998),

"Glaucabellin and glaucaflorin, two acetogenins from Annona glauca",

Phytochemistry 48, pp. 141-145.

[126] A.-I. Waechter, R. Hocquemiller, A. Laurens, A. Cavé (1997), "Glaucafilin,

an acetogenin from Annona glauca", Phytochemistry 44, pp. 1537-1540.

[127] L.-Q. Wang, B.-S. Min, Y. Li, N. Nakamura, G.-W. Qin, C.-J. Li, M. Hattori

(2002), "Annonaceous acetogenins from the Leaves of Annona montana",

Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, pp. 561-565.

135

[128] A. Wélé, C. Mayer, D. Quentin, Y. Zhang, A. Blond, B. Bodo (2009), "3D-

structure of cycloreticulin C and glabrin A, cyclopeptides from the seeds

of Annona reticulata", Tetrahedron 65, pp. 275-281.

[129] A. Wélé, Y. Zhang, C. Caux, J.-P. Brouard, J.-L. Pousset, B. Bodo (2004),

"Annomuricatin C, a novel cyclohexapeptide from the seeds of Annona

muricata", Comptes Rendus Chimie 7, pp. 981-988.

[130] A. Wélé, I. Ndoye, Y. Zhang, J.-P. Brouard, B. Bodo (2005),

"Cherimolacyclopeptide D, a novel cycloheptapeptide from the seeds of Annona

cherimola", Phytochemistry 66, pp. 693-696.

[131] A. Wélé, Y. Zhang, I. Ndoye, J.-P. Brouard, J.-L. Pousset, B. Bodo (2004),

"A Cytotoxic Cyclic Heptapeptide from the Seeds of Annona cherimola",

Journal of Natural Products 67, pp. 1577-1579.

[132] A. Wélé, I. Ndoye, Y. Zhang, J.-P. Brouard, J.-L. Pousset, B. Bodo (2005),

"Glaucacyclopeptide A from the seeds of Annona glauca", Phytochemistry 66,

pp. 1154-1157.

[133] A. Wélé, C. Landon, H. Labbé, F. Vovelle, Y. Zhang, B. Bodo (2004),

"Sequence and solution structure of cherimolacyclopeptides A and B, novel

cyclooctapeptides from the seeds of Annona cherimola", Tetrahedron 60, pp.

405-414.

[134] A. Wélé, C. Mayer, Q. Dermigny, Y. Zhang, A. Blond, B. Bodo (2008),

"Sequence and three-dimensional structure of cycloreticulins A and B, new

cyclooctapeptides from the seeds of Annona reticulata", Tetrahedron 64, pp.

154-162.

[135] A. Wélé, Y. Zhang, J.-P. Brouard, J.-L. Pousset, B. Bodo (2005), "Two

cyclopeptides from the seeds of Annona cherimola", Phytochemistry 66, pp.

2376-2380.

[136] P. Wu, M. Wu, L. Xu, H. Xie, X. Wei (2014), "Anti-inflammatory

cyclopeptides from exocarps of sugar-apples", Food Chemistry 152, pp. 23-28.

[137] T.-Y. Wu, I.H. Yang, Y.-T. Tsai, J.-Y. Wang, R. Shiurba, T.-J. Hsieh, F.-R.

Chang, W.-C. Chang (2012), "Isodesacetyluvaricin, an annonaceous acetogenin,

136

specifically inhibits gene expression of cyclooxygenase-2", Journal of Natural

Products 75, pp. 572-576.

[138] Y.-C. Wu, Y.-C. Hung, F.-R. Chang, M. Cosentino, H.-K. Wang, K.-H. Lee

(1996), "Identification of ent-16β,17-dihydroxykauran-19-oic Acid as an anti-

HIV principle and isolation of the new diterpenoids annosquamosins A and B

from Annona squamosa", Journal of Natural Products 59, pp. 635-637.

[139] Y.-C. Wu, F.-R. Chang, C.-Y. Chen (2005), "Tryptamine-Derived Amides

and Alkaloids from the Seeds of Annona atemoya", Journal of Natural Products

68, pp. 406-408.

[140] L. Xu, C.J. Chang, J.G. Yu, J.M. Cassady (1989), "Chemistry and selective

cytotoxicity of annonacin-10-one, isoannonacin, and isoannonacin-10-one.

Novel polyketides from Annona densicoma (Annonaceae)", The Journal of

Organic Chemistry 54, pp. 5418-5421.

[141] D.K. Yadav, N. Singh, K. Dev, R. Sharma, M. Sahai, G. Palit, R. Maurya

(2011), "Anti-ulcer constituents of Annona squamosa twigs", Fitoterapia 82, pp.

666-675.

[142] H. Yang, N. Zhang, X. Li, L. He, J. Chen (2009), "New nonadjacent bis-

THF ring acetogenins from the seeds of Annona squamosa", Fitoterapia 80, pp.

177-181.

[143] Y.-l. Yang, K.-f. Hua, P.-H. Chuang, S.-h. Wu, K.-y. Wu, F.-R. Chang, Y.-c.

Wu (2007), "New Cyclic Peptides from the Seeds of Annona squamosa L. and

Their Anti-inflammatory Activities", Journal of Agricultural and Food

Chemistry 56, pp. 386-392.

[144] Y.-L. Yang, F.-R. Chang, C.-C. Wu, W.-Y. Wang, Y.-C. Wu (2002), "New

ent-kaurane diterpenoids with anti-platelet aggregation activity from Annona

squamosa", Journal of Natural Products 65, pp. 1462-1467.

[145] J.-G. Yu, H.-Q. Gui, X.-Z. Luo, L. Sun (1998), "Murihexol, a linear

acetogenin from Annona muricata", Phytochemistry 49, pp. 1689-1692.

137

[146] L. Zeng, F.-E. Wu, N.H. Oberlies, J.L. McLaughlin, S. Sastrodihadjo (1996),

"Five new monotetrahydrofuran ring acetogenins from the leaves of Annona

muricata", Journal of Natural Products 59, pp. 1035-1042.

[147] L. Zeng, F.-E. Wu, Z.-m. Gu, J.L. McLaughlin (1995), "Murihexocins A and

B, two novel mono-THF acetogenins with six hydroxyls, from Annona muricata

(Annonaceae)", Tetrahedron Letters 36, pp. 5291-5294.

138

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 1 (AGQ30)

H COOH

Công thức phân tử C20H32O5, M = 352. - Phổ HR-ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 1H-NMR giãn - Phổ 13C-NMR - Phổ 13C-NMR giãn

- Phổ DEPT

- Phổ DEPT giãn

- Phổ HSQC

- Phổ HSQC giãn

- Phổ HMBC

- Phổ HMBC giãn

- Phổ COSY

- Phổ COSY giãn

- Phổ NOESY

- Phổ NOESY giãn

III

VII

VIII

XII

XIII

XIV

XVI

XVII

XVIII

XIX

XXI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 2 (AGQ32)

1' OH

HOHO

Công thức phân tử C26H42O9, M = 498. - Phổ HR-ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 1H-NMR giãn - Phổ 13C-NMR - Phổ 13C-NMR giãn

- Phổ HSQC

- Phổ HSQC giãn

- Phổ HMBC

- Phổ HMBC giãn

XXII

XXIII

XXIV

XXV

XXVI

XXVII

XXVIII

XXIX

XXX

XXXI

XXXII

XXXIII

XXXIV

XXXV

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 3 (AGQ31)

1' OH

HOHO

Công thức phân tử C26H40O9, M = 496. - Phổ HR-ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 1H-NMR giãn - Phổ 13C-NMR - Phổ 13C-NMR giãn

- Phổ DEPT

- Phổ DEPT giãn

- Phổ HSQC

- Phổ HSQC giãn

- Phổ HMBC

- Phổ HMBC giãn

XXXVI

XXXVII

XXXVIII

XXXIX

XLI

XLII

XLIII

XLIV

XLV

XLVI

XLVII

XLVIII

XLIX

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 4 (AGQ29)

1' OH

18 O

Công thức phân tử C32H50O14, M = 658. - Phổ HR-ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 1H-NMR giãn - Phổ 13C-NMR - Phổ 13C-NMR giãn

- Phổ DEPT

- Phổ DEPT giãn

- Phổ HSQC

- Phổ HSQC giãn

- Phổ HMBC

- Phổ HMBC giãn

- Phổ COSY

- Phổ COSY giãn

- Phổ NOESY

- Phổ NOESY giãn

LII

LIII

LIV

LVI

LVII

LVIII

LIX

LXI

LXII

LXIII

LXIV

LXV

LXVI

LXVII

LXVIII

LXIX

LXX

LXXI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 5 (AGQ26)

Công thức phân tử C26H42O9, M = 498. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

LXXII

LXXIII

LXXIV

LXXV

LXXVI

LXXVII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 6 (AGQ6)

Công thức phân tử C20H34O2, M = 306. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

LXXVIII

LXXIX

LXXX

LXXXI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 7 (AGQ2)

Công thức phân tử C20H34O2, M = 306. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ ESI-MS

LXXXII

LXXXIII

LXXXIV

LXXXV

LXXXVI

LXXXVII

LXXXVIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 8 (AGQ8)

CHO

Công thức phân tử C20H32O3, M = 320. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ ESI-MS

LXXXIX

XCI

XCII

XCIII

XCIV

XCV

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 9 (AGQ11)

COOH

Công thức phân tử C20H32O4, M = 336. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ ESI-MS

XCVI

XCVII

XCVIII

XCIX

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 10 (AGQ7)

17 COOH

Công thức phân tử C20H32O3, M = 320. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ ESI-MS

CII

CIII

CIV

CVI

CVII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 11 (AGQ4)

17 COOH

Công thức phân tử C22H34O4, M = 362. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ ESI-MS

CVIII

CIX

CXI

CXII

CXIII

CXIV

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 12 (AGQ9)

17 COOH

Công thức phân tử C19H30O3, ,M = 306. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

CXV

CXVI

CXVII

CXVIII

CXIX

CXX

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 13 (AGQ19)

6'''

1" OH

1'''

3'''

Công thức phân tử C27H42O15, M = 606. - Phổ HR-ESI-MS - Phổ 1H-NMR - Phổ 1H-NMR giãn - Phổ 13C-NMR - Phổ 13C-NMR giãn

- Phổ DEPT

- Phổ DEPT giãn

- Phổ HSQC

- Phổ HSQC giãn

- Phổ HMBC

- Phổ HMBC giãn

- Phổ NOESY

- Phổ NOESY giãn

CXXI

CXXII

CXXIII

CXXIV

CXXV

CXXVI

CXXVII

CXXVIII

CXXIX

CXXX

CXXXI

CXXXII

CXXXIII

CXXXIV

CXXXV

CXXXVI

CXXXVII

CXXXVIII

CXXXIX

CXL

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 14 (AG3)

COOH 1

6''

1''

3''

Công thức phân tử C37H60O8, M = 632. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

CXLI

CXLII

CXLIII

CXLIV

CXLV

CXLVI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 15 (AG1)

Công thức phân tử C13H20O4, M = 240. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

CXLVII

CXLVIII

CXLIX

CLI

CLII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 16 (AG15)

Công thức phân tử C13H20O3, M = 224. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

CLIII

CLIV

CLV

CLVI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 17 (AG2)

C 7

1' OH

Công thức phân tử C19H30O8, M = 386. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

CLVII

CLVIII

CLIX

CLX

CLXI

CLXII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 18 (AGQ20)

Công thức phân tử C14H20O7, M = 300. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

CLXIII

CLXIV

CLXV

CLXVI

CLXVII

CLXVIII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 19 (AGQ18)

HOHO

Công thức phân tử C18H26O11, M = 418. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

CLXIX

CLXX

CLXXI

CLXXII

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 20 (AGQ25)

OCH3

HOHO

OCH3

Công thức phân tử C14H20O8, M = 316. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

CLXXIII

CLXXIV

CLXXV

CLXXVI

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 21 (AGQ17)

HOOC

Công thức phân tử C7H6O4, M = 154. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

CLXXVII

CLXXVIII

CLXXIX

CLXXX

PHỤ LỤC HỢP CHẤT 22 (AGQ1)

22

Công thức phân tử C37H66O6, M = 606. - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR

- Phổ DEPT

CLXXXI

CLXXXII

CLXXXIII

CLXXXIV

PHỤ LỤC 23: Sắc ký đồ của các dẫn xuất TMS của D-glucose, L-

glucose và các hợp chất

TR(L-Glc) 14.25 min

TR(D-Glc) 14.12

TR 14.11 min

PHỤ LỤC 24: Phổ CD của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo

)

(

Phổ CD của hợp chất Phổ CD của hợp chất

(2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic

acid 3′-O-β-D-glucopyranoside acid 1,3′-di-O-β-D-glucopyranoside (13)

CLXXXV

PHỤ LỤC 25: Phiếu giám định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu

CLXXXVI