Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai Coxib

gfd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

---------------o0o---------------

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số : 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Ngô Quốc Anh 2. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng

HÀ NỘI - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và các cộng sự. Các kết

quả nghiên cứu không trùng lặp và chưa từng công bố trong tài liệu khác.

Hà Nội, ngày ...... tháng ..... năm 2021

Tác giả

Nguyễn Thị Thúy Hằng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Quốc Anh và PGS.TS.

Vũ Đình Hoàng những người thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo truyền động

lực, niềm đam mê cũng như nhiệt huyết khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực hiện

luận án.

Tôi xin trân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy và hướng dẫn tôi trong suốt

thời gian học tập và làm việc.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Học viện Khoa học và

Công nghệ, các phòng chuyên môn, các cán bộ nghiên cứu phòng Nghiên cứu và phát

triển dược phẩm – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

ủng hộ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn ở bên,

động viên tôi hoàn thành bản luận án này.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... 3

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ 8

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. Khái niệm hợp chất lai ............................................................................................ 3

1.2. Tổng quan về các chất lai chống ung thƣ .............................................................. 3

1.2.1. Các hợp chất lai chống ung thư dựa trên chất ức chế tubulin ........................... 3

1.2.2. Các chất lai chống ung thư dựa trên các hợp chất isatin ................................... 4

1.2.3. Các chất lai chống ung thư dựa trên nhóm chất coumarin ................................ 5

1.2.4. Các chất lai chống ung thư dựa trên nhóm chất steroid ..................................... 5

1.2.5. Các chất lai chống ung thư dựa trên pyrrolo benzodiazepin .............................. 6

1.2.6. Một số chất lai theo cơ chế khác .......................................................................... 7

1.3. Khái niệm và vai trò tubulin .................................................................................. 7

1.4. Các chất lai chống ung thƣ dựa trên chất ức chế tubulin ................................... 8

1.4.1. Hợp chất lai dựa trên cấu trúc combretastatin (1) .............................................. 9

1.4.2. Thuốc lai dựa trên cấu trúc colchicin (2) .......................................................... 10

1.4.3. Thuốc lai dựa trên cấu trúc podophyllotoxin .................................................... 11

1.4.4. Hợp chất lai dựa trên cấu trúc chalcon ............................................................. 12

1.4.5. Thuốc lai dựa trên cấu trúc taxol ....................................................................... 13

1.4.6. Thuốc lai dựa trên cấu trúc vinca alkaloid ........................................................ 14

1.5. Các hợp chất lai combretastatin .......................................................................... 15

1.5.1. Tổng quan hợp chất combretastatin ................................................................... 15

1.5.2. Các chất lai combretastatin ................................................................................ 21

1.6. Tổng quan về cơ chế COX2 và pyrazol ............................................................... 25

1.6.1. Tổng quan về cơ chế COX2 ................................................................................ 25

1.6.2. Các hợp chất pyrazol ........................................................................................... 26

1.6.3. Các hợp chất lai pyrazol ...................................................................................... 27

1.7. Mục tiêu của luận án ............................................................................................ 29

CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ................. 31

2.1. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 31

2.1.1. Hóa chất và dung môi ......................................................................................... 31

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................................. 31

2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 31

2.2.1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ ........................................................................... 31

2.2.2. Tinh chế và xác định cấu trúc ............................................................................ 32

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ................................................................. 32

2.3. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combrestatin ............................................... 32

2.3.1. Tổng hợp các dẫn chất este của chất lai este coxib - combretastatin ............... 32

2.3.1.1. Con đường tổng hợp các dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin ......................................................................................................... 32

2.3.1.2. Phản ứng tổng hợp các dẫn chất este của chất lai coxib- combrestatin33

Phản ứng được tổng hợp theo sơ đồ sau: ........................................................... 33

2.3.1.3. Quy trình tổng hợp các dẫn chất este của chất lai coxib - combrestatin .............................................................................................................................. 33

2.3.1.4. Kết quả của quy trình tổng hợp .............................................................. 34

2.3.2. Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3 ...................... 35

2.3.2.1. Con đường tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 .. 35

2.3.2.2. Phản ứng tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 .... 36

2.3.2.3. Quy trình tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 ..... 36

2.3.2.4. Kết quả của quy trình tổng hợp .............................................................. 36

2.3.3. Tổng hợp các dẫn chất axit của hợp chất lai coxib - combretastatin ............... 37

2.3.3.1. Con đường tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combrestatin .............................................................................................................................. 37

2.3.3.2. Phản ứng tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combrestatin .............................................................................................................................. 38

2.3.3.3. Quy trình tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combretastatin .............................................................................................................................. 39

2.3.3.4. Kết quả của quy trình tổng hợp .............................................................. 40

2.4. Nghiên cứu hoạt tính sinh học.............................................................................. 40

2.4.1. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào (HT-29, Hep-G2, MCF7 ) và khả năng ức chế sản sinh NO ............................................................................................................ 40

2.4.1.1. Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) ................... 40

2.4.1.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide ......................... 40

2.4.2. Nghiên cứu hoạt tính ức chế PGE2 ................................................................... 42

2.4.3. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis .......................................................... 43

2.5.3.1. Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342 ........................................................................................ 43

2.5.3.2. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis qua Flow cytometry .............. 43

2.5.3.3. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis bằng caspase 3 .................... 44

2.4. Nghiên cứu docking phân tử ................................................................................ 44

CHƢƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 47

3.1. Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai ...................................... 47

3.1.1. Thiết kế cấu trúc phân tử lai .............................................................................. 47

3.1.2. Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai ............................................................. 48

3.2. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin ............................................ 49

3.3. Hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin ............................. 72

3.3.1. Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin ............... 73

3.3.2. Nghiên cứu cơ chế kháng viêm và kháng ung thư ............................................ 78

3.3.2.1. Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 ......................................... 78

3.3.2.2. Phân tích chu kỳ tế bào .......................................................................... 79

3.3.2.3. Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hai chất 82 và 102 ................. 81

3.4. Nghiên cứu docking phân tử ................................................................................ 88

3.5. Thảo luận ............................................................................................................... 95

KẾT LUẬN ................................................................................................................... 96

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ............................. 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 99

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ Tiếng Anh Tiếng Việt viết tắt

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

CC Column Chromatography Sắc ký cột

High resolution Mass HRMS Phổ khối lượng phân giải cao Spectroscopy

Electrospray Ionization Mass ESI-MS Phổ khối ion hóa phun điện Spectroscopy

Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại IR

1H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

13C-NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

Resonance Spectroscopy 13

Tín hiệu đơn Singlet s

Tín hiệu đôi Doublet d

Tín hiệu ba Triplet dt

Cụm tín hiệu Multiplet m

dd Doublet doublet Tín hiệu đôi

dt Doublet triplet Tín hiệu đôi ba

MW Microwave Vi sóng

∆ Reflux Hồi lưu

Rt Room temperature Nhiệt độ phòng

THF Tetra hydro furan

Trimetylsilyl azid TMS-N3

MeCN Acetonitril

Trietylamin Et3N

EtOH Ethanol

AcOH Acetic acid Axit Acetic

L-Pro L-Propine

DMF Dimetyl focmamit

t-BuOH tert-Butanol

i-PrOH Iso Propanol

Benzylamin BnNH2

Triphenyl phosphin PPh3

MeOH Methanol

EtOAc Etyl acetate

ALHydroquinin 1,4- (DHQ)2PH phthalazinediyl diete

Trietyl silan Et3SiH

BF3.OEt2 Bo triflo etyl ete

Dietyl ete Et2O

p-TsOH p-Toluen sunfonic acid Axit p-Toluen sunfonic

NaH Natri hydrua Kiềm NaH

Liti aluminium hydride Liti nhôm hydrua LiAlH4

Carbon tetrabromide CBr4

triphenylphosphine)palladium Pd(PPh3)4

Natri cacbonat Kiềm cacbonat NaCO3

DME Dimethyl Ether

tert-Buty (chloro) TBDMSCl dimethylsilane

Acetic anhydrit Ac2O

SRB Sulforhodamine B

DMSO Dimethylsulfoxide

DMSO-d6 Dimethylsulfoxide-d6

UV Ultraviolet Tia cực tím

OD Optical Density Mật độ quang học

SRB Sulforhodamine B

CA4 Combretastatin A4

AND Deoxiribonucleic acid Axit deoxiribonucleic

ARN Ribonucleic acid Axít ribonucleic

The half maximal inhibitory Nồng độ tác dụng ức chế 50% sự IC50 concentration tăng sinh dòng tế bào thử nghiệm

KB Human epidermic carcinoma Dòng tế bào ung thư Biểu mô

Human Hepatocellular HepG2 Dòng tế bào ung thư gan ở người carcinoma

Lung cancer Dòng tế bào ung thư phổi Lu

MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú

HT -29 Human breast carcinoma Ung thư đại tràng ở người

DNA deoxyribonucleic acid các đơn vị nucleotide

NO Nitric oxid oxit nitric

ROS Reactive oxygen species

COX Cyclooxygenase enzyme

PGE2 Prostaglandin E2

PGI2 prostaglandin I2

PS Phosphatidylserine

PI Propidium iodide

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Vị trí nhóm thế của các chất lai dạng este coxib - combretastatin ............... 34

Bảng 2.2. Thống kê các chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 ...................... 37

Bảng 2.3. Vị trí nhóm thế của các chất lai dạng axit coxib - combretastatin ............... 38

Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp các chất este từ chất 79 đến chất 98 .................................. 50

Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp các chất 65, 102 .............................................................. 62

Bảng 3.3. Kết quả tổng hợp các dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122 ....................... 62

Bảng 3.4. Tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng este đối với ba dòng

tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và ức chế sản xuất NO ................................... 73

Bảng 3.5. So sánh tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng axit và dạng

este đối với tế bào ung thư MCF-7 và ức chế sản xuất NO ........................................... 76

Bảng 3.6. Các chất lai có hoạt tính sinh học nổi trội gây độc tế bào MCF7.................. 78

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 trong các

đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS .................................................... 79

Bảng 3.8. Phần trăm tế bào theo pha của các hợp chất được thử nghiệm với MCF7 .... 80

Bảng 3. 9. Phần trăm sự ngưng tụ hoặc phân mảnh của nhân tế bào do hợp chất 102 và

82 gây ra ......................................................................................................................... 82

Bảng 3.10. Hoạt tính caspase - 3 của 102 và 82 ........................................................... 84

Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào apoptosis .................................................................................. 85

Bảng 3.12. Lựa chọn mô hình cấu trúc COX-2 và tubulin tương ứng sử dụng cho

chương trình docking ..................................................................................................... 88

Bảng 3.13. Tập hợp các hợp chất được thiết kế với điểm kết nối tương ứng trên hai mô

hình protein (kcal/mol) ................................................................................................... 90

Bảng 3.14. Tương tác bộ hợp chất, phối tử trên COX-2 (ID: 3LN1) và mô hình protein

tubulin (ID: 1Z2B) ......................................................................................................... 94

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Các chất ức chế tubulin sử dụng trong thuốc lai chống ung thư ...................... 4

Hình 1.2. Isatin và một số hợp chất lai ............................................................................ 5

Hình 1.4. estradiol (13) và một số hợp chất lai ................................................................ 6

Hình 1.5. PBD và một số hợp chất lai .............................................................................. 6

Hình 1.6. Một số hợp chất lai theo cơ chế khác ............................................................... 7

Hình 1.7. a) Các vị trí liên kết với tubulin ....................................................................... 8

b) Cấu trúc và các quá trình trùng hợp, phân rã của microtubule [30] ............................ 8

Hình 1.8. Cấu trúc của một số chất phân lập từ C. caffrum ............................................ 9

Hình 1.9. Cấu trúc của một số chất lai combretastatin ................................................. 10

Hình 1.10. Cấu trúc của một số chất lai ........................................................................ 11

Hình 1.11. Cấu trúc của một số chất lai ........................................................................ 12

Hình 1.12. Cấu trúc của một số chất lai ........................................................................ 13

Hình 1.13. Cấu trúc của một số chất lai taxol ............................................................... 13

Hình 1.14. Cấu trúc của một số chất lai vinca alkaloid ................................................ 15

Hình 1.15. Cấu trúc stilben ............................................................................................ 15

Hình 1.16. Cấu trúc combretastatin A-4 phosphate (42), combretastatin A-1 phosphate

(43) ................................................................................................................................. 16

Hình 1.17. Tổng hợp các hợp chất mô phỏng combretastatin ...................................... 17

Hình 1.18. Các thành viên đại diện của nhóm combretastatin ...................................... 18

Hình 1.19. Cấu trúc khung combretastatin (55) và cấu trúc isocombretastatin (56) .... 18

Hình 1. 20. Combretastatin độc tế bào theo cơ chế tubulin .......................................... 20

Hình 1.21. Mô hình liên kết CA4 (đỏ) và COL (xanh dương) với tubulin ................... 20

Hình 1.22. Lai Combretstatin A-4 – Steroid (21, 22) .................................................... 22

Hình 1.23. Lamellarrin T và combretstatin A-4 ............................................................. 23

Hình 1.24. Lamellarrin D (62) và combretstatin A-4 (1) ............................................... 24

Hình 1.25. Lai Combretastatin-isocombretastatin (30) .................................................. 24

Hình 1.27. các hợp chất lai pyrazole - imidazopyrazole ................................................ 28

Hình 1.28. Tổng hợp KSS-19 (72) ................................................................................. 28

Hình 1.29. Chất lai quinoline–pyrazole (73) .................................................................. 29

Hình 1.30. Chất lai pyrazole–thiadiazole (74) ............................................................... 29

Hình 2.1. Con đường tổng hợp các hợp chất lai ghép dạng este.................................... 33

Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestastatin ........... 33

Hình 2.3. Công thức cấu tạo các hợp chất 79-98 ........................................................... 35

Hình 2.4. Con đường tổng hợp hợp chất lai .................................................................. 36

Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin dang triflo .............................. 36

Hình 2.6. Công thức cấu tạo các hợp chất 43, 102 ....................................................... 37

Hình 2.7. Con đường tổng hợp các hợp chất lai ghép dạng axit ................................... 37

Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép coxib - combretastatin dạng axit ........................... 38

Hình 2.9. Công thức cấu tạo các hợp chất 103-122 ...................................................... 40

Hình 3.1. Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp chất lai coxib -

combretastatin 47

Hình 3.2. Đánh giá mức độ biểu hiện PGE-2 của các hợp chất 102, 96, 81, 82, 94,

Celecoxib ở nồng độ 20 µM trên đại thực bào RAW-264,7 sau 48 giờ xử lý ............... 79

Hình 3.3. Phân tích chu kỳ tế bào của các hợp chất được thử nghiệm bao gồm 102, 96,

81, 82, 94 tại nồng độ 10 µM và Celecoxib (65) tại nồng độ 30 µM trên MCF-7 . ...... 81

Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 được nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của các

mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau ..................................................................... 83

Hình 3.5. Tác động của mẫu nghiên cứu đến quá trình apoptosis tế bào thông qua

Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Các mẫu thử được phân tích

bằng hệ thống flowcytometry. Trục x thể hiện mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V,

trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log. ............................................... 86

Hình 3.6. Các dạng liên kết hydro của các hợp chất với protein COX-2 (PDB ID:

3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B). (A) chất 102 với COX-2; (B) Chất lượng 102 với

tubulin; (C) chất 82 với COX-2; (D) Hợp chất 82 với tubulin. .................................... 91

Hình 3.7. Vị trí gắn kết 2D của các hợp chất được thiết kế với protein COX-2 PDB ID:

3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B). (A) hợp chất 102 với COX-2; (B) hợp chất 102 với

tubulin; (C) hợp chất 82 với COX-2; (D) hợp chất 82 với tubulin ................................ 93

Hinh 3.8. Hình ảnh stereo các mẫu chất ....................................................................... 94

MỞ ĐẦU

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vô

tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển

trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nhiều vị trí khác nhau (di căn). Theo thống

kê của tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm 2018 hiện cả nước có hơn 300.000

người sống chung với ung thư, có 164.671 ca mới, 114.871 người tử vong do bệnh này.

Toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người mắc, trong đó mỗi năm có hơn 14 triệu người

mắc mới và 8 triệu 2 trăm nghìn người tử vong. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp Việt

Nam nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư.

Hiện nay, các thuốc đang sử dụng thường theo cơ chế tác dụng đơn lẻ, còn nhiều

tác dụng phụ và bắt đầu có biểu hiện kháng thuốc, dẫn đến sự cần thiết tiếp tục nghiên

cứu phát triển các loại thuốc ung thư mới. Gần đây việc phát triển các thuốc chống ung

thư có nhiều đích tác dụng đang là vấn đề thời sự nhờ hiệu quả vượt trội hơn so với

một mục tiêu duy nhất [1-2]. Hơn nữa, nghiên cứu lâm sàng cũng chỉ ra, sự kết hợp của

nhiều loại thuốc với nhiều các cơ chế tác dụng khác nhau thu được hiệu quả cao cho

các bệnh nhân kháng thuốc [3]. Do đó, thiết kế các hợp chất lai kháng ung thư với

nhiều hơn một đích tác dụng là một xu hướng mới. Các hợp chất lai có khả năng tác

động đồng thời lên nhiều đích tác dụng nhờ trong cấu trúc của chúng có sự kết hợp

nhiều phân tử thuốc riêng lẻ hoặc các đặc điểm cấu trúc hóa học của các phân tử thuốc

này

Trong số các chất gốc có hoạt tính sinh học nổi trội được chú ý, nhóm chất

kháng ung thư theo cơ chế ức chế tubulin đặc biệt được quan tâm. Các chất ức chế vi

ống như taxol, colchicin, chalcon, combretasatin, phenstatin, podophyllotoxin và vinca

alkaloid được coi là các chất gốc tiềm năng và thu được các hợp chất lai cho kết quả

đầy hứa hẹn. Ngoài ra, celecoxib là một pyrazol kháng viêm điển hình theo cơ chế

COX2 và gần đây cũng được biết đến với một số hoạt tính mới đó là ức chế sự tăng

sinh của tế bào ung thư không liên quan với COX2 [4-5]. Do đó, việc thiết kế và tổng

hợp các hợp chất lai coxib – combretastatin hướng tới mục tiêu tìm ra một phân tử lai

mới có sự tích hợp được hoạt tính nổi trội của hai chất gốc ban đầu. Luận án với tiêu

đề “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thƣ các hợp chất lai

coxib – combretastatin” góp phần tìm ra các loại thuốc mới chống ung thư đa đích

sinh học.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Khái niệm hợp chất lai

Những đặc điểm nổi trội của sự kết hợp đa đích tác dụng trong điều trị lâm sàng

đối với những bệnh nhân không đáp ứng thuốc dẫn đến các hợp chất lai được quan tâm

và nghiên cứu [3]. Sự lai hóa phân tử có thể hiểu theo một nghĩa khái quát là một chiến

lược thiết kế các phối tử một cách hợp lý để làm xuất hiện các cấu trúc của chất mẫu

hoặc dựa trên sự nhận biết các đơn vị dược lý của các chất mẫu phát huy hoặc bảo tồn

nguyên bản dẫn đến các hợp chất lai thu được giữ được những đặc tính tiêu biểu của

các phiên bản gốc theo mục tiêu thiết kế ban đầu [6]. Đây là một khái niệm mới trong

thiết kế và phát triển thuốc nhằm tạo ra một hợp chất lai mới ái lực và hiệu quả hơn so

với các thuốc gốc đơn lẻ. Sự lựa chọn các đối tác lai ghép dựa trên các đặc tính cấu

trúc và hoạt tính sinh học của chất gốc. Phân tử lai thu được là sự kết hợp của hai dược

chất trong một phân tử duy nhất với mục đích khuếch đại tác dụng của nó thông qua sự

tác dụng đồng thời lên các mục tiêu đơn lẻ hoặc đối vận các tác dụng phụ của các chất

gốc dẫn đến làm giảm tác dụng phụ của phân tử lai [7-8].

1.2. Tổng quan về các chất lai chống ung thƣ

Sự không đồng nhất của khối u và khả năng kháng thuốc dẫn đến những hạn chế

trong điều trị hóa xạ trị, do vậy đòi hỏi các phương pháp tiếp cận mới nhằm kích hoạt

nhiều mục tiêu để tăng tính hiệu quả của thuốc điều trị. Chiến lược về các hợp chất lai

đã bước đầu đáp ứng được những hạn chế này trên mô hình in vitro và thể hiện qua

nhiều công trình nghiên cứu. Nhiều cơ chế tác dụng cũng như các cấu trúc mẫu được

sử dụng làm chất gốc. Tuy nhiên có thể phân loại các chất lai dựa trên một số nhóm

chất tiêu biểu được liệt kê sau đây:

1.2.1. Các hợp chất lai chống ung thư dựa trên chất ức chế tubulin

Các hợp chất ức chế tubulin được quan tâm nhiều trong việc thiết kế và tìm

kiếm các hợp chất chống ung thư. Điển hình như combretastatin A-4 (1), colchicine

(2), podophyllotoxin (3), chalcon (4), taxol (5), vinca alkaloid (6) (hình 1.1) có nhiều

nghiên cứu cũng như ứng dụng trong lâm sàng. Tuy nhiên khi hoạt động độc lập chúng

vẫn thể hiện nhiều tác dụng phụ. Do vậy, xoay quanh các cấu trúc của các chất ức chế

tubulin này, có rất nhiều chất lai được thiết kế và phát triển hướng tới nhiều hơn một

đích tác dụng sinh học vốn có của chất gốc.

Hình 1.1. Các chất ức chế tubulin sử dụng trong thuốc lai chống ung thư

1.2.2. Các chất lai chống ung thư dựa trên các hợp chất isatin

Isatin (7) là các hợp chất khung indol, bản thân isatin và các dẫn xuất của nó có

nhiều đặc tính sinh học như kháng u, kháng khuẩn, chống viêm, giảm đau, chống vi

khuẩn [9]. Isatin đã được lai hóa với nhiều các chất khác như uracil [10], triazol [11]

và thu được các chất lai uracil – isatin (8) [12], isatin – triazol (9) [12] và những hợp

chất lai khác có hoạt tính lai của isatin và chất đối tác (Hình 1.2).

Hình 1.2. Isatin và một số hợp chất lai

1.2.3. Các chất lai chống ung thư dựa trên nhóm chất coumarin

Coumarin (10) lần đầu tiên được phân lập từ đậu tonka và cỏ ba lá vào năm

1820 [13]. Coumarin biết đến với khả năng chống ung thư, kháng viêm, kháng virus

[14]. Một số sản phẩm lai của coumarin như coumarin - pyrazolin (11) [15], coumarin-

stilben (12) [16] cũng đã thể hiện mạnh khả năng chống ung thư của hoạt chất

coumarin đồng thời thu nhận thêm được hoạt tính của đối tác lai.

Hình 1.3. Coumarin và một số hợp chất lai

1.2.4. Các chất lai chống ung thư dựa trên nhóm chất steroid

Steroid là các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Một số

steroid có nguồn gốc thiên nhiên như hợp chất digitalis, và các tiền chất của một số loại

vitamine hay cholesterol [17]. Steroid được biết đến với tác dụng chống viêm giảm đau

hiệu quả. Một dạng của steroid đó là estradiol (13), một hormon sinh dục nữ chính, một

số hợp chất lai như estradiol - chlorambucil (14) [18], geldanamycin - estradiol (15)

[19-20] cũng được tổng hợp và khảo sát những hoạt tính chống lại một số dòng ung thư

buồng trứng hay ung thư vú (Hình 1.4).

Hình 1.4. estradiol (13) và một số hợp chất lai

1.2.5. Các chất lai chống ung thư dựa trên pyrrolo benzodiazepin

Pyrrolo [2,1-c] [1,4]-benzodiazepin (16) (PBD) là một nhóm kháng sinh, kháng

ung thư tự nhiên có hiệu lực mạnh được tạo ra từ các loài Streptomyces khác nhau.

Nhiều hợp chất tương tự PBD đã được tổng hợp nhằm tăng hiệu lực tác dụng chống lại

các tế bào ung thư [21] và một số hợp chất lai như benzothiazol - pyrrolo [2,1-c] [1,4]

benzodiazepin - 5 - one (17) [22], bisindol - pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepin (18)

[23] cũng đều thể hiện những hoạt tính nổi trội trong kháng ung thư của chất đầu PBD

và các chất đối tác.

Hình 1.5. PBD và một số hợp chất lai

1.2.6. Một số chất lai theo cơ chế khác

Một số chất lai chưa được thống kê theo một cơ chế cụ thể như psorospermin/

quinobenzoxazin (19) [24], norindenoisoquinolin - camptothecin [25], benzofuran -

imidazol (20) [26] (Hình 1.6) cũng được quan tâm và thu được nhiều kết quả hoạt tính

thú vị.

Hình 1.6. Một số hợp chất lai theo cơ chế khác

Tuy nhiên, trong định hướng mục tiêu của luận án, nhóm nghiên cứu tâp chung

phát triển các chất lai chống ung thư dựa trên cơ chế ức chế tubulin.

1.3. Khái niệm và vai trò tubulin

Tubulin, là một protein thành phần cấu tạo lên các vi ống và là mục tiêu hấp dẫn

để phát triển các loại thuốc trị liệu ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư. Tác dụng

chống tăng sinh của chúng chủ yếu bằng cách ngăn chặn quá trình nguyên phân và can

thiệp vào quá trình động học vi ống. Các phân tử protein sinh học tubulin được hình

thành thông qua quá trình trùng hợp các dị phân tử của α- và β-tubulin. Sự phá vỡ các

vi ống có thể gây ra sự ngừng chu kỳ tế bào ở pha G2-M và hình thành các thoi phân

bào bất thường. Các hợp chất nhắm mục tiêu tubulin có thể được phân loại thành hai

nhóm chính: 1) ổn định vi ống gồm các tác nhân kích thích sự trùng hợp tubulin bao

gồm paclitaxel, docetaxel và epothilon và 2) làm mất ổn định vi ống gồm các tác nhân

ức chế sự trùng hợp tubulin bao gồm vinca ancaloit (vinblastin, vincristin), colchicin,

combretastatin và các dẫn chất của chúng. Cả hai nhóm này đều có thể can thiệp vào sự

hình thành thoi phân bào trong tế bào khối u, ngừng tăng sinh bởi dừng chu kỳ tế bào

và gây ra cảm ứng chết tế bào theo chương trình apoptosis [27].

Khả năng ức chế polyme hóa tubulin được giải thích theo cơ chế tác động lên

các trung tâm khác nhau trên tubulin. Có 3 trung tâm hoạt động trên tubulin: trung tâm

colchicin, trung tâm vinca - alkaloid, và các trung tâm taxoid. Các hợp chất

combretastatin được cho là tác động lên trung tâm colchicin [28-29]. Colchicin là một

loại thuốc chống phân bào, tác dụng ức chế phân bào ở kì giữa nguyên phân và liên kết

với tubulin để tạo thành phức hợp tubulin - colchicin sau đó liên kết với các đầu của vi

ống để ngăn chặn sự kéo dài của polymer vi ống. Ở nồng độ thấp, colchicine ngăn chặn

sự tăng trưởng vi ống và ở nồng độ cao hơn, colchicin thúc đẩy quá trình phân rã vi

ống. Colchicin được định dạng là một trong các chất gốc dùng để so sánh và đưa ra cơ

chế tác dụng lên một miền liên kết tubulin đối với một chất mới.

a b

Hình 1.7. a) Các vị trí liên kết với tubulin

b) Cấu trúc và các quá trình trùng hợp, phân rã của tubulin [30]

1.4. Các chất lai chống ung thƣ dựa trên chất ức chế tubulin

Theo thống kê phần trước cho thấy phân tử lai thu được hiệu quả và chọn lọc

hơn về hoạt tính sinh học so với các nguyên mẫu. Hơn nữa, phạm vi lai của các phân tử

rất rộng, có thể tùy chỉnh sửa đổi chọn lọc cấu trúc theo mục tiêu thiết kế ban đầu để

lựa chọn ra các đối tác phù hợp. Tuy nhiên trong đó chiến lược tiếp cận mục tiêu

enzym /protein là các chiến lược chính cho các bệnh phức tạp như ung thư, cụ thể trong

khuôn khổ luận án thì mục tiêu protein tubulin được đề cập và nghiên cứu. Trên cơ sở

mục tiêu tubulin thì có nhiều các chất ức chế tubulin được sử dụng để tổng hợp các

phân tử lai như: combretastatin, colchicin, podophyllotoxin, chalcon, taxol, vinca

alkaloid.

1.4.1. Hợp chất lai dựa trên cấu trúc combretastatin (1)

Combretastatin (21) thuộc một nhóm các hợp chất được phân lập từ vỏ rễ hoặc

thân của cây Combretum caffrum Nam Phi. Các phần tử đầu tiên được phân lập vào

năm 1982 (Hình 1.8). Các thực vật họ Combretaceae bao gồm hơn 600 loài và được

phân chia thành 20 chi [31]. Họ cây bụi Combretaceae được phổ biến rộng rãi sử dụng

trong y học cổ truyền ở Châu Phi và Ấn Độ theo nhiều các công dụng khác nhau như

làm thuốc trị tim mạch, băng bó vết thương, điều trị bệnh tâm thần, bọ cạp cắn. Loài

Combretum latifolium được dùng để điều trị ung thư [32-33].

Hình 1.8. Cấu trúc của một số chất phân lập từ C. caffrum

Một số hợp chất tự nhiên được phân lập từ C. caffrum có các hoạt tính sinh học

đáng chú ý như ức chế sự ngưng kết của tubulin, ức chế trên các dòng tế bào ung thư ở

người [34-36]. Trong đó combretastatin A-4 (1), là một trong các chất thể hiện độc tính

tế bào mạnh lại có cấu trúc đơn giản.

Các hợp chất combretastatin với những hoạt tính nổi trội nhờ vậy là nguồn

phong phú tạo tiền đề cho các hợp chất lai. Nhiều nhóm tác giả đã tiến hành thiết kế và

xây dựng các nhóm chất lai như các hợp chất lai Combretastatin A-4 (1) và steroid

[37], các hợp chất lai combretastatin A-4 - Lamellarrin D (27) [38], lai Combretastatin

– amidobenzothiazol (29) [39], lai Combretastatin - Isocombretastatin (30) [40], hay

các dạng lai dẫn chất của combretastatin [41].

Hình 1.9. Cấu trúc của một số chất lai combretastatin

1.4.2. Chất lai dựa trên cấu trúc colchicine (2)

Colchicin (2) một alkaloid tự nhiên được phân lập từ cây Colchicum autumnale

L., là một trong những chất chống phân bào đầu tiên được tiến hành nghiên cứu. Cụ

thể, nó can thiệp vào sự phát triển của vi ống và do đó ảnh hưởng đến quá trình nguyên

phân và các chức năng phụ thuộc vào vi ống khác [42]. Có nhiều chất lai dựa trên cấu

trúc colchicin được các nhà khoa học nghiên cứu như colchicin – caulerpenyn (31) với

hoạt tính ức chế trùng hợp tubulin [43], colchicin - tubulizin (32) [44], Colchicin –

adamantan (33) [45] cũng đều thể hiện hoạt tính vượt trội.

Hình 1.10. Cấu trúc của một số chất lai colchicine

1.4.3. Chất lai dựa trên cấu trúc podophyllotoxin

Podophyllotoxin (3) là một lignan, lần đầu tiên được phân lập bởi Podwyssotzki

vào năm 1880 từ hỗn hợp nhựa được gọi là Podophyllin. Hỗn hợp này thu được từ rễ

khô và thân rễ của cây thân thảo Bắc Mỹ lâu năm của loài Podophyllum như P.

hexandrum và P. peltatum [46]. Một trong những ứng dụng y học đầu tiên của hoạt

chất này được ghi lại vào đầu thế kỷ 19. Các podophyllotoxin (3) được khuyên dùng

cho các bệnh về gan và thận, giang mai và ung thư. Thuốc bôi ngoài da được giới thiệu

vào năm 1942 và vẫn còn được chấp nhận đến ngày nay như là một liệu pháp hiệu quả

cho điều trị mụn cóc hoa liễu. Điều này chứng tỏ các nghiên cứu về podophyllotoxin

vẫn luôn được phát triển với mục tiêu tìm ra được giải pháp điều trị ung thư có nguồn

gốc thực vật. Quanh cấu trúc của podophyllotoxin chẳng hạn như hoạt chất cathartic,

antirheumatic được sử dụng làm thuốc chống vi rút và điều trị ung thư đã được công

nhận [47]. Hơn nữa, các dẫn xuất epipodophyllotoxin (etoposide, tenniposide) [48]

được sử dụng làm thuốc điều trị một số loại ung thư và thu được hiệu quả cao. Tuy

nhiên, bản thân podophyllotoxin đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng, nhưng chưa

được sử dụng do độc tính và tác dụng phụ.

Do vậy, các hơp chất lai podophyllotoxin cũng được phát triển nhằm phát huy

độc tính kháng ung thư và đồng thời làm giảm tác dụng phụ của chất gốc

podophyllotoxin cụ thể như các chất lai bisepipodophyllotoxins (34) [49],

acrylamidopodophyllotoxin (35) [50].

Hình 1.11. Cấu trúc của một số chất lai podophyllotoxin

1.4.4. Hợp chất lai dựa trên cấu trúc chalcone

Chalcone (4) là một loạt các propenon biaryl thuộc họ flavonoid thể hiện một số

đặc tính sinh học thú vị như chống oxy hóa, độc tính mạnh đối với một số dòng tế bào

ung thư, kháng khuẩn. Chalcon thể hiện sự ức chế tăng sinh tế bào thông qua tương tác

với tubulin tại vị trí liên kết colchicin [51]. Xoay quanh cấu trúc chalcon cũng được

nhiều nhóm nhà khoa học trên thế giới tiếp tục tìm kiếm và sàng lọc về hoạt tính [52-

54]. Một lớp các chất lai chalcon – dihydrobenzofuran (36) mới cũng được nghiên cứu

và thu được kết quả nổi trội về hoạt tính trên một số dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

PC -3, ung thư ruột kết HT -29 và ung thư đại tràng B -16 [53], hay chalcon –

biscoumarin (37) thể hiện mạnh hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm

Hình 1.12. Cấu trúc của một số chất lai chalcone

1.4.5. Thuốc lai dựa trên cấu trúc taxol

Các hợp chất taxol (5) bắt nguồn từ cây Taxus brevifolia và các sản phẩm bán

tổng hợp của nó được sử dụng trong lâm sàng để điều trị ung thư vú, ung thư buồng

trứng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ, nó có tác dụng

gây mất ổn định vi ống và bắt giữ chu kỳ tế bào dẫn đến chu trình chết apoptosis [55].

Wittman và cộng sự (2001) với những báo cáo về sự quá mẫn cảm của các dòng tế bào

kháng paclitaxel - cisplatin (38) dẫn tới mục tiêu thiết kế ra các phân tử chất lai là sự

kết hợp tác nhân alkyl hóa với paclitaxel để mở rộng công dụng điều trị của paclitaxel

tới kháng khối u [56], discodermolid - Paclitaxel (39) thể hiện hoạt tính gấp hai đến

tám lần so với phân tử gốc với các dòng tế bào ung thư A549 và MCF-7 [57] và nhiều

chất lai dựa trên cấu trúc này và cũng thu được các kết quả lý thú [58-61].

Hình 1.13. Cấu trúc của một số chất lai taxol

1.4.6. Thuốc lai dựa trên cấu trúc vinca alkaloid

Vinca alkaloid (6) là một họ các hợp chất indol dạng dimer được chiết xuất

hoặc bán tổng hợp từ cây dừa cạn Catharanthus roseus, đại diện cho một trong

những lớp chất chống ung thư quan trọng nhất và đã được thử nghiệm trong lâm

sàng. Vinca alkaloid có tác dụng ức chế vi ống bằng cách liên kết chéo tại giao diện

giữa các dimer, chúng bóp méo một cách mạnh mẽ các sợi protofilament và làm cho

tubulin hình thành các polyme xoắn ốc thay thế [62-63]. Hiện tại có 4 vinca alkaloid

chính được sử dụng trên lâm sàng cho bệnh nhân ung thư như: vinblastin, vinorelbin,

vincristin và vindesin. Nhiều các hợp chất lai của vinca alkaloid cũng đã được nghiên

cứu và phát triển, chất lai vinca alkaloid – phomopsin (40) thu được khả năng độc tính

tế bào tăng đáng kể so với chất gốc vinca alkaloid [61], hay các hợp chất lai vindolin –

thiocolchicin (41) cũng thu được hoạt tính nổi trội với tế bào ung thư phổi A549 [64].

Hình 1.14. Cấu trúc của một số chất lai vinca alkaloid

1.5. Các hợp chất lai combretastatin

1.5.1. Tổng quan hợp chất combretastatin

Combretastatin thuộc lớp chất cis - stilben, một nguồn phong phú của các hợp

chất dẫn đường trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới, các hợp chất điển hình như

resveratrol và combretastatin A-4 phosphate hiện đang được thử nghiệm để điều trị

bệnh Alzheimer và ung thư trên lâm sàng. Các stilbene mới được phân lập gần đây đã

cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm tính chống oxy hóa, kháng

khuẩn, chống sốt rét, gây độc tế bào, bảo vệ gan và chống viêm.

Về mặt cấu trúc, stilben có 2 dạng cấu hình trans-stilben và cis-stilben, dạng

trans-stilben không bị cản trở về không gian, nhưng cis-stilben bị cản trở mạnh. Dạng

cấu hình cis được cho là thường kém ổn định hơn khi tồn tại ở dạng trans. Đối với

stilben dạng cơ bản nhất cho thấy nhiệt độ nóng chảy của 2 cấu hình này cũng chênh lệch rõ rệt, (E) -Stilben có điểm nóng chảy khoảng 1250C, trong khi điểm nóng chảy của (Z) -stilben là 60C.

Hình 1.15. Cấu trúc stilben

Hợp chất combretastatin A-4 (CA4) (1) là một chất chống phân bào mạnh, nó

được xem là đích tác dụng, ức chế trùng hợp tubulin. Tuy nhiên, nó có độc tính nhiều

hơn hoạt tính đối với tubulin, vì những lý do chưa biết rõ, nó nhanh chóng và ưu tiên

phá vỡ các quá trình tế bào trong trong nội mô của chu trình trùng hợp tubulin trên mô

hình in vivo. Hơn nữa có một hạn chế là combretastatin A-4 tan kém trong nước, do

vậy dạng phosphat một dẫn chất đơn giản được tạo ra để làm tăng độ hòa tan trong

nước. Như combretastatin A-4 phosphate (CA4P) và combretastatin A-1 phosphat

(CA1P) đang trong các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III để điều trị ung thư cổ tử

cung, ung thư trực tràng, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư buồng trứng và

ung thư tuyến giáp [65-69].

Hình 1.16. Cấu trúc combretastatin A-4 phosphate (42), combretastatin A-1

phosphat (43)

Nhiều hợp chất (Hình 1.17) đã được tổng hợp mô phỏng cấu trúc của

combretastatin trong đó có CA4 và CA1 [34, 65, 67]. Một loạt các dẫn chất

combretastatin được tổng hợp dựa trên sự thay đổi các nhóm chức trong vòng A và B

đã được thiết kế nhưng vẫn giữ nguyên cầu ethylen. Với sự xuất hiện của các nhóm

như 3-nitro, 3-amino, muối của 3-amino và acid, các chất dẫn xuất thay thế 2-nitơ, 3-

azido, các dẫn xuất 4-methylenedioxy-3-amino, 3-fluoro, 4-methyl, và 3, 4,5-trimethyl

[70-76]. Nhiều dẫn chất combretastatin dựa trên ý tưởng biến đổi cấu trúc từ khung

stilbenoid. Các hợp chất biến đổi cấu trúc khác bao gồm: phenstatin,

hydroxyphenstatin, heterocombretastatin, combretatropone, aza-combretastatin, vicinal

diol, combretadioxolan, các dẫn chất chalcone, dẫn xuất imidazole, pyridone và các

sulfonamid [40, 77]. Các dẫn xuất khác bao gồm 3 aroyl-2-aryl indol, 2,3-diaryl indol,

3-formyl indol, benzo [b] thiophen, benzofuran, dihydronaphthalen, dihydroxyindolo

[2,1-α] isoquinolin [78-79].

Hình 1.17. Tổng hợp các hợp chất mô phỏng combretastatin

Tương quan gữa cấu trúc và hoạt tính sinh học

Các combretastatin được chia thành bốn nhóm chính trên cơ sở đặc điểm cấu

trúc của nó: Dãy A (cis - stilben) cụ thể như các chất combretastatin A ví dụ CA1 (8),

Dãy B (diaryl-ethylen) điển hình như combretastatin B ví dụ CB1 (25), Dãy C –

phenanthren điển hình như combretastatin C ví dụ 7 hydro-2,3,6-

trimethoxylphenantherene -1,4-dion (53) , và Dãy D (lacton vòng lớn) điển hình như

combretastatin D ví dụ như cobretastatin D-2 (CD2) (54). Các thành viên đại diện của

mỗi nhóm này được thể hiện trong Hình 1.18.

Hình 1.18. Các thành viên đại diện của nhóm combretastatin

Hình 1.19. Cấu trúc khung combretastatin (55) và cấu trúc isocombretastatin (56)

Theo cấu trúc mô phỏng trên hình 1.19, những thay đổi cấu trúc và vị trí cũng

như các nhóm thế trên các vòng A, B hay cầu C sẽ làm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh

học của hợp chất:

Vòng A: Các thay đổi trên vòng A nhìn chung đều làm giảm hoạt tính kháng

ung thư, nhóm trimethoxybenzen là cần thiết cho tác dụng độc tế bào. Khi thay thế 4-

metoxy bằng một phenol dẫn đến làm giảm hoạt tính, mặc dù sự ức chế trùng hợp

tubulin không thay đổi. Thậm chí khi tăng kích thước của ether ở vị trí này dẫn đến phá

hủy khả năng độc tế bào và giảm khả năng ức chế trùng hợp tubulin. Có thể thấy nhóm

5 - methoxy dường như rất quan trọng đối với khả năng thể hiện hoạt tính của chất, cụ

thể được giải thích nó ảnh hưởng mạnh mẽ đến tương tác với đầu colchicin tubulin.

Vòng B: Vòng B có thể là nhân phenyl mang các nhóm thế OH, NH2, NO2,

NHCOR, F, Cl, Br, OCH3, N3 hoặc các dị vòng pyridin, indol, quinolin, naphtalen,…

hoặc chứa gốc muối photphat để tăng sinh khả dụng cho thuốc. Việc loại bỏ 3-

hydroxyl trên vòng cũng làm giảm hoạt tính của khung chất. Tuy nhiên, khi di chuyển

methoxy này xung quanh vòng hoặc thay thế nó bằng một nhóm halogenua, alkyl- hoặc

chứa nitơ thì làm giảm hoạt tính nghiêm trọng khung chất. Việc đảo ngược các nhóm

methoxy và hydroxy tạo ra isocombretastatin (56) cũng làm cho nhóm chất thay đổi

tương tác tại vị trí colchicin [80]. Các isocombretastatin thể hiện khả năng hòa tan

trong nước tăng gấp 30 lần khi so sánh với CA4 (1), sự ức chế mạnh quá trình trùng

hợp tubulin và gây độc tế bào chống lại một số dòng tế bào ung thư ở người không phụ

thuộc vào kích thước của vòng B. Mặt khác, sự thay thế ortho thành nitơ gây ra sự

giảm hiệu lực quan trọng. Những kết quả này cho thấy việc thay đổi cấu trúc cũng như

thiết kế các phối tử vị trí colchicin mới glycosyl hóa của vị trí này dẫn đến làm tăng

hoặc giảm rõ rệt và chọn lọc hoạt tính của hợp chất [81].

Cầu C: liên kết đôi có cấu dạng hình học E là cần thiết cho hoạt tính kháng ung

thư, liên kết đôi này có thể mang các nhóm thế khác nhau hoặc được thay thế bởi các

nhóm carbonyl, amit, sulfonat, .. hoặc bởi các dị vòng như pyrazol, thiazol, triazol,

tetrazol, imidazol, furanzan, arylcourmarin, …

Cơ chế tác dụng của combretastatin

Combretastatin là một chất chống phân bào mạnh vì nó kích thích tế bào

apoptotic chết thông qua sự phá vỡ các vi ống và gây ra sự ngừng chu kỳ tế bào khi

chuyển đổi giai đoạn chuyển tiếp sang anaphase bằng cách liên kết có chọn lọc với tiểu

đơn vị của tubulin tại vị trí gắn colchicin [27]. Bên cạnh combretastatin, tiền chất của

nó (natri phosphat của combretastatin) đang được thử nghiệm trong điều trị lâm sàng

cho thấy chúng được chuyển hóa nhanh chóng thành combretastatin sau khi dùng bởi

các phosphat không đặc hiệu nội sinh.

Hình 1. 20. Combretastatin độc tế bào theo cơ chế tubulin

Cơ chế gây độc tế bào của combretastatin dãy A (cis-stilben) và dãy B (diaryl-

ethylen) liên quan đến cấu hình cis. Hoạt tính của các dãy C (quinon) và dãy D (lacton

vòng lớn) mà không còn cấu hình cis đều yếu hơn nhiều lần so với dãy A và B. Cấu

trúc biến đổi combretastatin trong vòng benzen thế khác ảnh hưởng không đáng kế đến

hoạt tính.

Hình 1.21. Mô hình liên kết CA4 (đỏ) và COL (xanh dương) với tubulin

Một số hợp chất Combretastatin đang được thử nghiệm lâm sàng

Các nghiên cứu tiền lâm sàng của Combretastatin A-4 phosphate (CA4),

Combretastatin A-1 phosphat (CA1P) đã hoàn thành. Tuy nhiên, các kết quả cho thấy

rằng hoạt lực mạnh hơn nhiều so với CA4P, nó cũng có thể ngăn chặn khối u phát triển

và phục hồi mà không quan sát thấy ở CA4P. Hoạt tính lý thú này dựa trên cơ chế ức

chế tubulin và ức chế sự tăng sinh tế bào [76, 78-79, 82-83]. Các thử nghiệm lâm sàng

pha I/II của CA4P đã thực hiện trên các khối u rắn; kết hợp với carboplatin; khối u não,

ung thư tuyến giáp, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt; ung thư buồng trứng; kết hợp

với carboplatin và paclitaxel; ung thư đại trực tràng, kết hợp với iodine - kháng thể

A5B7 [84-89].

Combretastatin A-4 (CA4) cũng được xem là tác nhân gây độc tế bào tiềm năng

do ức chế mạnh sự trùng hợp vi ống bằng cách gắn vào điểm gắn kết của colchicin trên

tubulin. CA-4 có độc tính cao trên nhiều mô hình tế bào ung thư, do vậy nó là một cấu

trúc mục tiêu hiện đang rất được quan tâm. Từ những kết quả nghiên cứu in vitro ban

đầu, CA4 (được đặt tên hoạt chất là fosbretabulin, biệt dược ZYBRESTAT) hiện đang

được phát triển [90] và thử nghiệm lâm sàng bởi Công ty Oxigene trong việc điều trị

một số bệnh ung thư như ung thư tuyến giáp, ung thư buồng trứng kháng Platinum và

ung thư phổi không tế bào nhỏ.

1.5.2. Các chất lai combretastatin

Nhiều chất lai combretastatin đã được nghiên cứu với mục tiêu giữ lại độc tính

tế bào nổi trội của combretastatin và thu nhận thêm được hoạt tính của các đối tác lai

đồng thời giảm những tác dụng phụ của chất gốc.

Cụ thể như với cấu trúc lai combretastatin với steroid ngoài độc tính mạnh với tế

bào ung thư được thể hiện thì chất lai có cả tác dụng kháng viêm của các hợp chất

steroid. Parihar và cộng sự đã tổng hợp thành công chất lai combretastatin – estradiol

(28), trong đó estradiol (57) như một nhóm aryl thứ hai của combretastatin (Hình 1.22)

[91-92]. Các chất lai được đánh giá về độc tính tế bào chống lại dòng tế bào ung thư vú

ở người (MCF-7 & MDA-MB 231). Các hợp chất cũng thể hiện hoạt động chống ung

thư đáng kể chống lại cả tế bào ung thư vú ER dương tính và ER âm tính hiển thị giá trị

IC50 là 7.5µM và 5.5 µM với MCF-7 và MDA-MB-231 và cũng cho thấy tác dụng ức

chế tubulin mạnh (ICµ = 0.96 µM).

Hình 1.22. Lai Combretstatin A-4 – Steroid (21, 22)

Các alkaloid lamellarin có tác dụng kháng virus và kháng ung thư được cho là

theo cơ chế topoisomerase I [93]. Banwellet và cộng sự (2006) đã thiết kế một loạt các

hợp chất lai combretastatin với alkaloid lamellarin (59). Sản phẩm thu được là 4, 5 –

diaryl-1H-pyrrole-2-carboxylate thể hiện mạnh hoạt tính chống phân bào của

combretastatin A-4 (1) và alkaloid lamellarin (Hình 1.23) [94]. Nhóm tác giả cũng giải

thích đặc tính chống phân bào và độc tế bào của lớp chất lai này thể hiện mạnh là do

các cấu trúc lai có sự liên kết tại miền colchicin trên tubulin. Nhóm tác giả cũng chỉ ra

với các cấu trúc lai thu được vẫn giữ nhóm -trimethoxyaryl (các dẫn xuất 29, 60) tương

tự của combretastatin thì đều có hoạt tính độc tế bào mạnh hoặc tương đương

combretastatin. Riêng các dẫn xuất không còn chứa –trimethoxyaryl (như chất 61)

trong cấu trúc cho thấy hoạt tính ức chế tubulin giảm đi 3-5 lần. Nghiên cứu này cũng

phù hợp với nhiều báo cáo về tác dụng của nhóm trimethoxyl trong khung cấu trúc

combretastatin.

Hình 1.23. Lamellarrin T và combretstatin A-4

Lamellarrin D (62) được biết đến là chất ức chế topoisomerase I mạnh và gây

apoptosis thông qua con đường ty thể [93]. Các chất lai combretstatin A-4 với

Lamellarrin D với mong muốn lai ghép ra một hợp chất mới đem đầy đủ các đặc tính

của chất gốc này, nhóm nhà khoa học Shen cùng cộng sự (2010) cũng đã lai hóa thành

công hợp chất lai combretstatin A-4 (1) - Lamellarrin D (62). Sản phẩm chất lai thu

được (chất 63) thể hiện hoạt tính chống lại các dòng tế bào ung thư ở người như ung

thư bạch cầu K-562, ung thư phổi A-549, ung thư gan SMMC-7721, ung thư dạ dày

SGC-7901 và ung thư ruột kết HCT-116 [38].

Hình 1.24. Lamellarrin D (62) và combretstatin A-4 (1)

. Rasolofonjatovo và cộng sự (2010) cũng đã tổng hợp một loạt các giống lai

triarylolefin mang cấu trúc của CA4 - isoCA4 (30) (Hình 1. 25) với mục đích kết hợp

tác dụng chống ung thư của CA4 (1) và isocombretastatin A-4 (isoCA4) (56) trong một

cấu trúc đơn lẻ [40]. Các chất thu được thể hiện hoạt tính gây độc tế bào chống lại

dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người (HCT-116). Việc sử dụng isoCA4 (56)

và CA4 (1) như các hợp chất tham chiếu cũng cho thấy hoạt tính kháng tubulin của sản

phẩm thu được.

Hình 1.25. Lai Combretastatin - isocombretastatin (30)

Có thể thấy nhiều nghiên cứu về các hợp chất lai bước đầu thu được những kết

quả hoạt tính phong phú khẳng định xu hướng lai hóa phân tử là một lựa chọn cho tiền

đề phát triển thuốc kháng ung thư hiệu quả.

1.6. Tổng quan về COX2 và pyrazol

1.6.1. Tổng quan về cơ chế COX2

Cyclooxygenase-2 là một enzym đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng

sinh học khác nhau, đặc biệt là trong cơ chế giảm đau, viêm và nhiều các vai trò khác

làm cho nó trở thành một phân tử được quan tâm như một mục tiêu. Enzyme COX2

được tạo ra trong quá trình viêm hoặc ung thư mà hầu như không có mặt trong các tổ

chức bình thường. Do đó, ức chế chọn lọc COX2 có thể làm giảm đáng kể các tác dụng

phụ bao gồm tổn thương đường tiêu hóa và tác dụng độc gan của các NSAID truyền

thống như aspirin, ibuprofen, v.v. Những phát triển gần đây về chất ức chế COX2 chủ

yếu tập trung vào việc cải thiện chỉ số chọn lọc của thuốc đối với cơ chế ức chế COX2

cùng với việc nâng cao hiệu lực của thuốc bằng cách sửa đổi các thành phần [95].

Các nghiên cứu dịch tễ học và thực nghiệm đã chứng minh tác dụng của thuốc

chống viêm không steroid (NSAID) trong việc ngăn ngừa ung thư ở người. NSAID

ngăn chặn sự tổng hợp prostaglandin nội sinh thông qua việc ức chế hoạt động của

enzym cyclooxygenase (COX). COX2, một isoenzym quan trọng trong việc chuyển đổi

axit arachidonic thành prostaglandin, được cảm ứng bởi nhiều tác nhân khác nhau như

các yếu tố tăng trưởng, chất kích thích khối u, và thường được biểu hiện quá mức trong

các khối u ác tính. Sự có mặt của COX2 trong các tế bào khối u ác tính được cho là có

liên quan đến: (i) tăng sản xuất prostaglandin, (ii) chuyển đổi procarcinogens thành

chất gây ung thư, (iii) ức chế apoptosis, (iv) thúc đẩy hình thành mạch, (v) điều chỉnh

tình trạng viêm và chức năng miễn dịch, và (vi) tăng khả năng xâm lấn của tế bào khối

u, mặc dù một số nghiên cứu chỉ ra rằng NSAID có tác dụng độc lập với COX2. Một

số thử nghiệm lâm sàng sử dụng chất ức chế COX2 đang được tiến hành và kết quả từ

những nghiên cứu này sẽ giúp chúng ta hiểu hơn về sự ức chế COX2 trong cả điều trị

và phòng ngừa ung thư. Sự kết hợp của chất ức chế COX2 với các loại thuốc chống

ung thư hoặc phòng ngừa ung thư khác có thể làm giảm tác dụng phụ của chúng trong

việc phòng ngừa và điều trị ung thư trong tương lai [96].

1.6.2. Các hợp chất pyrazol

Pyrazol là các dị vòng có năm cạnh tạo thành một nhóm các hợp chất đặc biệt

hữu ích trong tổng hợp hữu cơ. Chúng là một trong những nhóm hợp chất được nghiên

cứu nhiều nhất trong họ azol. Rất nhiều phương pháp tổng hợp đã được báo cáo trong

nhiều năm, sự hiện diện của nhân pyrazole trong các cấu trúc khác nhau dẫn đến các

ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ, y học và nông nghiệp. Đặc biệt,

chúng được mô tả là chất ức chế quá trình glycation, kháng khuẩn, kháng nấm, chống

ung thư, chống trầm cảm, chống viêm, chống lao, chống oxy hóa cũng như là chất

kháng virus [97-98].

Hình 1.26. Phương pháp tiếp cận thiết kế pyrazol như một chất ức chế

chọn lọc COX2.

Pyrazole được báo cáo qua các tài liệu hiện có và SAR cho thấy, nó là cần thiết

cho việc thiết kế các chất ức chế chọn lọc COX2. Celecoxib (65) và SC-558 (64) đã

được sử dụng như các chất khung nền để thiết kế các phân tử với mục tiêu điều trị

viêm. Trong đó celecoxib là một chất thương mại được bán rộng rãi trên thị trường

chứa nhóm pyrazol và là chất ức chế mạnh chọn lọc COX2 [99].

Celecoxib

Celecoxib (65) (Celebrex®, Onsenal®), đã được chứng minh với tác dụng

chống viêm giảm đau. Đây là tác dụng chính và được nghiên cứu ứng dụng trong lâm

sàng nhờ đặc tính an toàn và ít tác dụng phụ.

Cơ chế tác dụng Celecoxib

Celecoxib (65) là thuốc ức chế chọn lọc COX2 thông qua hoạt động của

prostaglandin gây ra trong quá trình viêm và đau mà không tác dụng lên các

prostaglandin COX1 có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa.

Thử nghiệm tiền lâm sàng đã chứng minh hoạt tính chống khối u của celecoxib

trên người. Celecoxib ức chế cả sự tăng sinh trên mô hình in vitro tế bào ung thư vú ở

người như MCF-7 và MDAMB-231. Ngoài ra, celecoxib và các hợp chất liên quan có

thể gây ra sự bắt giữ chu kỳ tế bào ở giai đoạn G0 /G1 dẫn đến tế bào chết theo chu

trình apotosis, ức chế sự phát triển của khối u và ngăn chặn sự hình thành mạch của

khối u khi không có sự hiện diện của COX2 [4-5].

Hai tác dụng dược lý, ức chế COX2 và ức chế sự phát triển của khối u đồng thời

được tìm thấy ở các khía cạnh cấu trúc khác nhau của phân tử celecoxib. Những phát

hiện này làm cho celecoxib trở thành một hợp chất hàng đầu hấp dẫn để phát triển các

chất chống ung thư mới.

1.6.3. Các hợp chất lai pyrazol

Các hợp chất pyrazol được biết đến với hoạt tính kháng viêm tiêu biểu và được

coi là mục tiêu kháng viêm. Một số chất có vòng pyrazol cũng được sử dụng như

những chất đầu hoặc chất gốc cho các hợp chất lai và thu được kết quả khả quan.

Chiara Brullo và các cộng sự (năm 2020) cũng đã quan tâm và tổng hợp thành công

các hợp chất lai pyrazol - imidazopyrazol (67, 68, 69), hầu hết các chất thử nghiệm cho

kết quả ức chế sản sinh ROS, một số trong đó cho kết quả IC50 trong khoảng 10 µM

[100].

Hình 1.27. các hợp chất lai pyrazol - imidazopyrazol

Surendra R và cộng sự (2018) đã tổng hợp thành công chất KSS-19 (72) (Hình

1.28), một dạng lai hóa celecoxib - combretastatin thể hiện liên kết chặt chẽ với vị trí

hoạt động COX2 và ức chế tubulin tại miền colchicin. Nhóm chất KSS-19 (72) cũng

cho thấy hoạt động chống tăng sinh mạnh mẽ chống lại dòng tế bào ung thư HT29

[101].

Hình 1.28. Tổng hợp KSS-19 (72)

Chất lai quinolin – pyrazol (73) cũng được Nagabhushana Nayak (2016) và các

cộng sự tổng hợp thành công [102]. Các sản phẩm lai thu được thể hiện hoạt tính độc tế

bào đáng kể với MIC là 12,5 μg / mL, các chất lai cũng được chứng minh có liên kết

mạnh mẽ với các enzym đích thông qua phân tích docking phân tử.

Hình 1.29. Chất lai quinolin – pyrazol (73)

Hợp chất lai pyrazol – thiadiazol (73) được biết đến với hoạt động chống viêm

mạnh mẽ thông qua cơ chế chọn lọc COX2 [103]. Các sản phẩm lai thể hiện tốt sự ức

chế COX2 với giá trị IC50 tương ứng là 1.33-17.5 μM

Hình 1.30. Chất lai pyrazol – thiadiazol (74)

1.7. Mục tiêu của luận án

Luận án có các mục tiêu cụ thể sau:

1. Thiết kế được cấu trúc các hợp chất lai coxib - combretastatin

2. Tổng hợp được các hợp chất lai coxib - combretastatin

3. Sàng lọc được các hoạt tính kháng ung và kháng viêm của các hợp chất lai

4. Xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các hợp chất lai

5. Tiến hành docking phân tử hợp chất lai coxib - combretastatin với hai đích tác dụng

COX2 và tubulin

Hình 31: Mô phỏng hợp chất lai coxib – combretastatin theo mục tiêu đặt ra

CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất và thiết bị

2.1.1. Hóa chất và dung môi

Các hóa chất được cung cấp bởi các công ty hóa chất thương mại như (Merck,

Sigma Aldrich, Chemleader Biomedical, Xilong Scientific). Các hóa chất chính được

sử dụng: Deoxybenzoin (2-Phenylacetophenone), 4′-Chloro-2-phenylacetophenone,

Desoxyanisoin, Benzyl 4-bromophenyl ketone, Benzyl 4-hydroxyphenyl ketone,

Benzyl 2,4-dihydroxyphenyl ketone, 1-(4-Fluorophenyl)-2-phenyl-ethanone, Diethyl

oxalate, Ethyl chlorooxoacetate, 4-Methoxyphenylhydrazine hydrochloride, 2′-

Hydroxy-2-phenylacetophenone, 4-Methoxyphenylhydrazine hydrochloride, 2-

Fluorophenylhydrazine hydrochlorid, 4-Chloro-3-nitroaniline, acid tetroic….. của hãng

Chemleader Biomedical. Các aldehyde , benzadehy,…., NaH, LiAlH4, NaBH4, 3,5-

imethoxyaniline từ Sigma Aldrich. THF của Merck được làm khan bằng phương pháp

cất lại sử dụng Na/Benzophenone, Dioxane xuất xứ Trung Quốc.

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu

Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân Avance 500 (Bruker, CHLB Đức) đo 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), HSQC, HMBC. Thiết bị phân tích phổ khối lượng

MS và HRMS X500R-QTOF MS của hãng SCIEX. Các phép đo được thực hiện tại

Viện hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt nam Viện Hóa học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ

Sử dụng các phản ứng tổng hợp hữu cơ và các phương pháp khử hợp chất hữu

cơ sử dụng: LiAlH4, Pd/C/HCOOH-NEt3, CoCl2/NaBH4, Ni2B/NaBH3CN, .... Khử

alkyl hóa amin, phản ứng ngưng tụ Claisen, phản ứng Suzuki coupling, ngưng tụ

Perkin..…được thực hiện tại Phòng nghiên cứu và phát triển dược phẩm, Viện Hóa

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.2. Tinh chế và xác định cấu trúc

Sắc ký lớp mỏng: Silica gel 60 F254 trên tấm nhôm từ hãng Meck. Các chất

được phát hiện dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Sắc ký cột:

Sắc ký cột được thực hiện với silica gel 60 cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm/70 – 230 mesh

ASTM từ MACHEREY – NAGEL. Chiều dài và đường kính của cột silica gel phụ

thuộc vào số lượng các chất cũng như độ khó của sự tách biệt. Phương pháp xác định

cấu trúc: Sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, phương pháp

khối phổ MS, HR-MS.

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của các hợp chất được nghiên cứu theo phương pháp gây độc

tế bào của Monks (1991) [169] trên ba dòng tế bào ung thư vú MCF7, ung thư đại trực

tràng HT29 và ung thư gan HepG2 và phép thử ức chế sản sinh NO tại phòng thử hoạt

tính Sinh học, Viện Hóa học và Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam. Phép thử thử nghiệm apoptosis được thực hiện tại Viện Công

nghệ sinh học Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam và Tại Khoa Dược tại Trường Đại học

Perugia, Italy, Cộng Hòa Liên Bang Đức [104]. Phương pháp mô hình mô phỏng phân

tử docking được thực hiện tại Viện Hợp chất thiên nhiên, viên Hàn Lâm KHCN Việt

Nam

2.3. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin -

2.3.1. Tổng hợp các dẫn chất este của chất lai este coxib - combretastatin

2.3.1.1. Con đường tổng hợp các dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib -

combretastatin

Hình 2.1. Con đường tổng hợp các hợp chất lai ghép dạng este

2.3.1.2. Phản ứng tổng hợp các dẫn chất este của chất lai coxib- combrestatin

Phản ứng được tổng hợp theo sơ đồ sau:

Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestastatin

(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetat (1 mmol,

1 eq) (77), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan;

phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78).

2.3.1.3. Quy trình tổng hợp các dẫn chất este của chất lai coxib - combretastatin

Mô tả quy trình chung:

Sản phẩm thu được qua hai giai đoạn phản ứng

Giai đoạn 1: Tổng hợp muối lithium hợp chất trung gian

Cho vào bình phản ứng chất đầu 76 (1 mmol), thêm Ethyl chlorooxoacetat (1,2

mmol), 240 mg t-BuOLi (3 mmol) (77), 5 ml THF. Phản ứng được đun hồi lưu trong 6

giờ. Kiểm tra phản ứng bằng sắc ký bản mỏng. Hỗn hợp phản ứng thu được loại bỏ

dung môi để thực hiện cho phản ứng tiếp theo.

Giai đoạn 2: Phản ứng tổng hợp các hợp chất khung lai ghép dạng este

Cho sản phẩm trung gian muối lithium sau khi đã được loại bỏ dung môi của

giai đoạn 1 (1 mmol, 1 đương lượng) vào bình phản ứng chứa 5 ml C2H5OH khan, dung

dịch phản ứng được thêm vào 0,34 ml dung dịch HCl (4 mmol, 4 đương lượng) khuấy ở

nhiệt độ thường trong 10 phút. Thực hiện các phản ứng với lần lượt các hydrazin (1

mmol, 1 đương lượng) (78): 4-Methoxyphenylhydrazine hydrochlorid, 4-

(Trifluoromethyl) phenylhydrazin, 4-Cyanophenylhydrazin hydrochloride, 4-

Nitrophenylhydrazin, 4-sulfonamidophenylhydrazin hydrochlorid vào hỗn hợp tiếp tục

khuấy trong 10 phút ở cùng nhiệt độ. Sau đó phản ứng được đun hồi lưu trong 6 giờ.

Hỗn hợp phản ứng sau đó được chiết bằng CH2Cl2, làm khan, phần hữu cơ đem lọc qua bột celite và cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp ở 200C thu được sản phẩm rắn thô.

Sản phẩm (79-98) này được tinh chế bằng sắc ký cột hệ dung môi ethyl acetate : n-

hexan.

2.3.1.4. Kết quả của quy trình tổng hợp

Sản phẩm thu được 20 các hợp chất lai với các vị trí nhóm thế cụ thể được thống kê

trong bảng 2.1.

STT

Ký hiệu chất

R’

R’’

OCH3

Bảng 2.1. Vị trí nhóm thế của các chất lai dạng este coxib - combretastatin

79

CF3

80

81

NO2

82

NH2SO2

83

OCH3

84

OCH3

CF3

85

OCH3

86

OCH3

NO2

87

OCH3

NH2SO2

88

OCH3

89

CF3

90

91

NO2

92

NH2SO2

93

NH2SO2

94

2OH

NH2SO2

95

NH2SO2

96

NH2SO2

97

2 OCH3

NH2SO2

98

Hình 2.3. Công thức cấu tạo các hợp chất 79-98

2.3.2. Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3

2.3.2.1. Con đường tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

Con đường tổng hợp được thiết kế theo sơ đồ sau:

Hình 2.4. Con đường tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

2.3.2.2. Phản ứng tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

(a) 100 (1.0 mmol), 99 etyl trifluoroacetat (1,2 eq) và NaH (2,5 eq) trong THF (5 mL),

6 h. (b), EtOH (5 mL), axit (1.0 eq); arylhydrazin hydrochlorid 78 (1.0 mmol) được

thêm liên tiếp vào cặn và hồi lưu trong 6 giờ. Chất 102 được phân lập qua sắc ký cột.

2.3.2.3. Quy trình tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

Mô tả quy trình chung:

Trong thí nghiệm tiến hành với chất 100 (1,0 mmol), etyl trifluoroacetat (99) (1,2

đương lượng) và NaH (2,5 đương lượng) trong THF khan (5 mL) trong 6 giờ. (b) 8,

EtOH (5 mL), axit (1,0 đương lượng) và arylhydrazin hydroclorid 78 (1,0 mmol) được

thêm liên tiếp vào cặn và hồi lưu trong 6 giờ. Sản phẩm 102 được phân lập qua sắc ký

cột.

2.3.2.4. Kết quả của quy trình tổng hợp

Hình 2.6. Công thức cấu tạo các hợp chất 65, 102

STT

Ký hiệu chất

CH3

SO2NH2

Celecoxib (65)

OCH3

SO2NH2

Bảng 2.2. Thống kê các chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

102

2.3.3. Tổng hợp các dẫn chất axit của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin

2.3.3.1. Con đường tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combrestatin

Con đường tổng hợp được thiết kế theo sơ đồ sau:

Hình 2.7. Con đường tổng hợp các hợp chất lai ghép dạng axit

2.3.3.2. Phản ứng tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combrestatin

Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép coxib - combretastatin dạng axit

(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetat (1 mmol, 1

eq), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan; phenylhydrazin (1

mmol, 1 eq) (78). Sản phẩm thu được sau phân lập qua sắc ký cột được hòa tan trong

hệ dung môi THF/MeOH/H2O = 3:1:1, sau đó NaH (1,2 eq) được thêm vào hỗn hợp.

Thực hiện phản ứng trong 3h thu được chất lai hóa dạng axit 103-122.

STT

Ký hiệu chất

R’

R’’

OCH3

Bảng 2.3. Vị trí nhóm thế của các chất lai dạng axit coxib - combretastatin

103

CF3

104

105

NO2

106

NH2SO2

107

OCH3

108

OCH3

CF3

109

OCH3

110

OCH3

NO2

111

OCH3

NH2SO2

112

OCH3

113

CF3

114

115

NO2

116

NH2SO2

117

NH2SO2

118

2OH

NH2SO2

119

NH2SO2

120

NH2SO2

121

2 OCH3

NH2SO2

122

2.3.3.3. Quy trình tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combretastatin

Mô tả quy trình chung:

Sản phẩm thu được qua ba giai đoạn phản ứng:

Giai đoạn 1: Cho vào bình phản ứng chất đầu 76 (1 mmol), thêm chất Ethyl

chlorooxoacetat (1,2 mmol), 240 mg t-BuOLi (3 mmol), 5 ml THF. Phản ứng được đun

hồi lưu trong 6 giờ. Kiểm tra phản ứng bằng sắc ký bản mỏng. Hỗn hợp phản ứng thu

được loại bỏ dung môi để thực hiện cho phản ứng tiếp theo.

Giai đoạn 2: Cho sản phẩm trung gian muối lithium (1 mmol, 1 đương lượng) vào

bình phản ứng chứa 5 ml C2H5OH khan, dung dịch phản ứng được thêm vào 0,34 ml

dung dịch HCl (4 mmol, 4 đương lượng) khuấy ở nhiệt độ thường trong 10 phút. Thực

hiện các phản ứng với lần lượt các hydrazin (1 mmol, 1 đương lượng): 4-

Methoxyphenylhydrazin hydrochlorid, 4-(Trifluoromethyl) phenylhydrazin, 4-

Cyanophenylhydrazin

hydrochlorid, 4-Nitrophenylhydrazin, 4-

sulfonamidophenylhydrazin hydrochlorid vào hỗn hợp tiếp tục khuấy trong 10 phút ở

cùng nhiệt độ. Sau đó phản ứng được đun hồi lưu trong 6 giờ. Hỗn hợp phản ứng sau

đó được chiết bằng CH2Cl2, làm khan, phần hữu cơ đem lọc qua bột celite và cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp ở 200C thu được sản phẩm rắn thô. Sản phẩm (79-98) này

được tinh chế bằng sắc ký cột hệ dung môi ethyl acetat : n-hexan.

Giai đoạn 3: Sản phẩm 79-98 được hòa tan trong hệ dung môi THF / MeOH /

H2O = 3: 1: 1 , sau đó NaH (2,5 đương lượng) lần lượt được thêm vào. Hỗn hợp phản

ứng tiếp tục được khuấy trong 3 giờ nữa, sản phẩm được trung hòa bằng axit HCl 3N .

Hiệu suất thu được qua sắc ký cột là chất rắn, đem xác định cấu trúc.

2.3.3.4. Kết quả của quy trình tổng hợp

Hình 2.9. Công thức cấu tạo các hợp chất 103-122

2.4. Nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.4.1. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào (HT-29, Hep-G2, MCF7 ) và khả năng ức

chế sản sinh NO

2.4.1.1. Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được thực hiện theo phương

pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số

dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của

tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận

với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein

càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như

 Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp

 Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để

điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

 Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã

điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử

trong giếng là 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml và 0.8 g/ml.

 Ủ đĩa thí nghiệm trong tủ ấm 48 giờ ở 370C. Giếng không có chất thử nhưng có

TBUT (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối

chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA.

 Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 370C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.

 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút.

Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).

 Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định

thông qua công thức sau:

[OD (chất thử) - OD (ngày 0)] x 100

% ức chế = 100% -

OD (đối chứng âm) - OD (ngày 0)

 Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồngđộ

10 g/ml; 2 g/ml; 0.4 g/ml; 0.08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng

dương;

 DMSO 10% được sử dụng là đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%

sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

2.4.1.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide (nos inhibition)

 Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 370C và 5% CO2 trong 24h. Tiếp theo, môi trường nuôi cấy

được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h. Tế bào sau

đó được ủ với mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được

kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h. Một số giếng

không được ủ mẫu chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm.

Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L-

NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/ml.

 Nitrite (NO2-), được xem là tiêu chí đánh giá NO và được xác định nhờ bộ thử

Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể, 100 μL môi

trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 giếng và được thêm vào

100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v)

phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine

dihydrochloride pha trong nước.

 Hỗn hợp này được ủ tiếp tại nhiệt độ phòng trong 10 phút, hàm lượng nitrite

được đo bằng máy microplate reader ở bước song 540 nm. Môi trường DMEM

không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank). Hàm lượng nitrite của từng

mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và

được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).

 Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

% ức chế =100%- [hàm lượng NO sample/hàm lượng NOLPS]*100

 Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức

chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính

TableCurve 2Dv4

2.4.2. Nghiên cứu hoạt tính ức chế PGE2

Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 370C và 5% CO2 trong 24h sau đó được ủ với mẫu thí nghiệm ở các

nồng độ khác nhau với sự có mặt của LPS (1µg/mL) trong 48 giờ. Hàm lượng PGE2

trong dịch nuôi cấy tế bào sau đó được xác định bằng bộ kit chuẩn PGE-2 của R&D.

Theo đó dịch nuôi cấy hoạt chất và 50 μl được đưa vào các giếng và ủ trong 1h ở nhiệt

độ phòng. Tiếp theo 50 µl PGE2 được đưa vào các giếng và ủ tiếp 2 h trước khi các

giếng được rửa 4 lần bằng dung dịch đệm. Sau đó, 200 μl dung dịch nền được đưa vào

từng giếng và ủ tiếp 30 phút. Sau khi dừng phản ứng bằng 100 μl dung dịch dừng, giá

trị OD của các giếng được xác định thông qua máy đọc microplate reader ở bước sóng

450/540 nm.

2.4.3. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis

2.4.3.1. Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế

bào với Hoechst 33342

Khả năng gây apoptosis của hoạt chất được xác định thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 như sau: Tế bào MCF-7 được nuôi trong đĩa petri 24 giờ ở 370C

sau đó được ủ với mẫu thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Camptothecin được dùng

làm đối chứng tham khảo, DMSO 10% được sử dụng làm đối chứng âm. Sau 24 h ủ

mẫu, tế bào được cố định bằng formandehyde 4%. Sau 30 phút, tế bào được rửa lại

bằng PBS và nhuộm bằng thuốc nhuộm Hoechst 33342 (0,5µg/ml) trong 10 phút. Tế

bào được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng Excitation⁄Emission

(nm) là 350⁄461. Xác định số lượng tế bào apoptosis trong ít nhất 200 tế bào quan sát

được qua kính hiển vi. Apoptosis được xác định là những tế bào có nhân sáng hơn (do

nhiễm sắc chất bị cô đặc) hay nhân bị phân chia thành mảnh nhỏ.

2.4.3.2. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis qua trắc lưu tế bào

Thí nghiệm được thực hiện theo Kit Anexin V/cell dead apoptosis của Invitrogen như sau: 1x106 tế bào được ủ với mẫu thử hoặc dung môi pha mẫu 24h được

thu vào ống falcon. Sau khi ly tâm loại bỏ môi trường, tế bào được rửa lại bằng PBS.

Cặn tế bào được hòa lại trong 100 µl dung dịch đệm liên kết và bổ sung thêm 5µl Anexin V và 1µl PI (100 µg/ml). Tiếp tục ủ tế bào trong 15 phút ở 370C sau đó thêm

vào các ống tế bào 400µl dung dịch đệm liên kết. Tổng số 10.000 tế bào thuộc mỗi

mẫu được phân tích bằng hệ thống flowcytometry Novocyte để xác định tỉ lệ tế bào

biểu hiện apoptosis.

2.4.3.3. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis bằng caspase 3

Cụ thể như sau:

Tế bào đã được cảm ứng với mẫu thử trong 24h, sẽ được ly giải với 50 μl dung

dịch đệm ly giải trong 10 phút. Sau đó dịch tế bào được ly tâm và xác định hàm lượng

protein trong dịch tế bào. Protein được pha loãng với nồng độ 50 μg trong 50μl dung

dịch đệm ly giải, cho 50 μl dung dịch đệm phản ứng và 5 μl cơ chất DEVD-pNA (nồng độ 200 μM) và ủ 370C trong 1 h. Tiến hành đọc kết quả trên máy microplate reader ở

bước sóng 405 nm

2.5. Nghiên cứu docking phân tử

Docking là một phương pháp tính toán dựa trên các phần mềm dùng để nghiên

cứu khả năng gắn kết của một hay nhiều phân tử (hay cấu tử, ligand) lên điểm tác

động của cấu trúc không gian 3 chiều các đại phân tử như protein (receptor, enzym,

…) ADN…Các nghiên cứu docking phân tử được sử dụng để xác định sự tương tác

giữa hai phân tử và tìm định hướng tốt nhất của phối tử có thể hình thành phức hợp

với năng lượng tối thiểu. Các phân tử nhỏ được gọi là phối tử thường phù hợp trong

hốc của protein được dự đoán bởi các thuật toán tìm kiếm. Các hốc protein này trở nên

hoạt động khi tiếp xúc với bất kỳ các hợp chất bên ngoài và do đó được gọi là điểm

tác động.

Các kết quả được phân tích bằng một chức năng tính điểm thống kê chuyển

năng lượng tương tác sang các giá trị số gọi là điểm docking và cũng là năng lượng

tương tác được tính toán. Hình dạng 3D của các phối tử bị liên kết có thể được hình

dung bằng cách sử dụng các công cụ khác nhau như Pymol, Rasmol… có thể giúp suy

luận sự phù hợp nhất của phối tử. Dự đoán chế độ tương tác protein-ligand có thể giả

thiết vị trí hoạt động của phân tử protein và giúp chú thích protein tốt hơn [107]. Hơn

nữa, việc gắn kết phân tử có ứng dụng chính trong việc phát minh và thiết kế dược

phẩm.

Docking phân tử.

Phân tử docking có thể được chia thành hai phần riêng biệt.

a) Thuật toán tìm kiếm - Các thuật toán này xác định tất cả các cấu hình tối ưu có thể

cho một phức hợp nhất định (protein-protein, protein-ligand) trong môi trường, tức là

vị trí và hướng của cả hai phân tử tương ứng với nhau. Chúng cũng có thể tính toán

năng lượng của phức hợp và của từng tương tác riêng lẻ [107-108].

Các loại thuật toán khác nhau có thể được sử dụng để phân tích docking được đưa ra

dưới đây:

- Động lực học phân tử,

- Phương pháp Monte Carlo.

- Thuật toán di truyền

- Các phương pháp phân mảnh.

- Các phương pháp bổ sung điểm.

- Phương pháp hình học khoảng cách.

- Tìm kiếm có hệ thống.

b) Điểm số chức năng - Đây là phương pháp toán học được sử dụng để dự đoán cường

độ của tương tác không cộng hóa trị được gọi là liên kết ràng buộc giữa hai phân tử sau

khi chúng đã được docking. Điểm số chức năng cũng đã được phát triển để dự đoán

cường độ của các kiểu tương tác liên phân tử khác, ví dụ giữa hai protein hoặc giữa

protein và DNA hoặc protein và thuốc. Các cấu hình này được đánh giá bằng cách sử

dụng điểm số chức năng để phân biệt các chế độ liên kết thử nghiệm từ tất cả các chế

độ khác được khám phá thông qua thuật toán tìm kiếm.

d) Các bước chính trong docking phân tử:

Bước 1 – chuẩn bị protein: Trong bước này, cấu trúc 3D của thụ thể sẽ được tải xuống

từ ngân hàng dữ liệu protein PDB (Protein data bank). Sau đó cấu trúc thu được nên

được xử lý trước. Điều này phải chấp nhận loại bỏ phân tử nước, ion, ổn định điện

tích,…theo các thông số có sẵn.

Bước 2 – dự đoán điểm tác động: Sau khi chuẩn bị protein, cần dự đoán điểm tác động

của protein. Các thụ thể (receptor) có thể có nhiều điểm tác động nhưng cần lựa chọn

một trong những điểm ưa thích nhất. Hầu hết các phân tử nước và các dị tố cần được

loại bỏ nếu có [105-106].

Bước 3 – chuẩn bị phối tử: Phối tử có thể được lấy từ nhiều cơ sở dữ liệu như ZINC,

Pub chem hoặc có thể phác họa bằng công cụ Chem sketch.

Bước 4 – Docking: Ligand được gắn với protein và các tương tác được phân tích.

Điểm số chức năng là điểm dựa trên cơ sở phức ligand tốt nhất được chọn.

CHƢƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

Những ưu điểm của việc sử dụng một phân tử lai so với việc đồng thời kết hợp

nhiều loại thuốc riêng lẻ có thể cải thiện các hạn chế về phản ứng phụ và sự kháng

thuốc [107]. Tuy có hoạt tính nổi trội, nhưng combretastatin vẫn còn nhiều những tác

dụng không mong muốn. Đây là lý do nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp

combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và celecoxib, một chất kháng viêm theo

cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn cho các hợp chất lai mới với hy vọng tìm ra

những chất mang các đặc điểm hoạt tính sinh học lý thú như kháng ung thư và kháng

viêm của chất gốc đồng thời ít gây tác dụng phụ.

3.1. Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai

3.1.1. Thiết kế cấu trúc phân tử lai

Hình 3.1. Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp

chất lai coxib - combretastatin

Nghiên cứu đã áp dụng chiến lược lai ghép để lai hóa các nhóm dược lý quan

trọng của hai hợp chất gốc celecoxib và CA4 trong một phân tử duy nhất. Vòng

pyrazole được thay thế bởi 1,2-diphenyl của khung celecoxib như một cấu trúc tương

tự như cis-1,2-diphenylethylene trong CA4. Sự thay thế liên kết đôi bằng vòng 5 đã

được khẳng định về mặt hoạt tính gây độc tế bào và ức chế tubulin [108]. Các hợp chất

bị khóa dạng cấu hình cis này thể hiện một số lợi ích như ngăn chặn quá trình đồng

phân hóa từ dạng cis thành trans, giúp tăng độ đặc hiệu của hoạt chất này với các mục

tiêu tế bào và cải thiện tiềm năng điều trị của nó. Sự hiện diện của các nhóm

trimethoxybenzene của CA4 cũng là cần thiết cho hoạt tính độc tế bào [76]. Chúng tôi

đặc biệt quan tâm đến việc duy trì nhóm sulfonamid hoặc các đặc điểm liên quan đến

celecoxib vì điều này dường như dẫn đến việc bảo tồn được tính chọn lọc COX-2 của

chất lai thu được [109]. Tác dụng ức chế COX2 nếu có sẽ góp phần vào tổng thể hoạt

động chống khối u của các phân tử lai mới.

3.1.2. Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai

Tác dụng gây độc tế bào của những hợp chất này chống lại ba dòng thế bào ung

thư ở người HT-29, Hep-G2, MCF-7 cũng như ức chế sản sinh NO bằng cách kích hoạt

lipopolysaccharide (LPS) tế bào đại thực bào RAW 264.7. Vai trò của NO trong khối u

rất phức tạp, nó có vai trò kích thích hoặc ức chế quá trình tế bào tùy thuộc vào điều

kiện, vì vậy sự ức chế sản sinh NO không liên quan trực tiếp đến độc tính tế bào.

Nhưng NO thể hiện một loạt các đặc tính dược lý có ích tương tự như prostaglandin

trên hệ tim mạch bao gồm sự giãn mạch, sự ức chế kết tập tiểu cầu và sự điều hòa các

mảng bám của bạch cầu vào thành mạch [110]. Hơn nữa, việc sử dụng celecoxib trong

phòng chống ung thư vú và các khối u ác tính đã bị hạn chế bởi các tác dụng phụ của

nó, đặc biệt là nguy cơ biến chứng của tim mạch liên quan chủ yếu đến khả năng giảm

sản sinh prostacyclin PGI2 [111]. Nhờ đó có thể thấy sự duy trì sản sinh NO cùng với

những đặc tính ức chế COX2 của celecoxib có thể giúp tránh nguy cơ biến chứng tim

mạch, do vậy một chiến lược nhằm thiết kế một loạt phân tử đa đích bằng cách kết hợp

ức chế chọn lọc COX2 với các hoạt động phụ thuộc nitric oxide (NO) đã được triển

khai [112-114].

Trong quá trình viêm nhiễm, các tế bào miễn dịch được kích hoạt như đại thực

bào tiết ra một số chất trung gian gây viêm như cytokine tiền viêm, oxit nitric (NO) và

prostaglandin E2 (PGE2). Hơn nữa, có một mối liên quan rõ ràng giữa mức độ

prostaglandin trong các khối u vú ở người với sự phát triển của di căn và khả năng

sống sót [115]. Prostaglandin E2 tồn tại với nồng độ cao trong các khối u vú và ở

những thể trạng ung thư di căn, khi thiếu thụ thể estrogen và progesterone [116-117].

Do đó, khả năng ức chế sản xuất PGE2 có thể được coi là một chiến lược tốt trong việc

thiết kế các chất chống ung thư. Tuy nhiên, các tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức

PGE2 rất thấp theo báo cáo khác [109]. Do đó, hiệu lực hoạt tính của các hợp chất lai

đã được thử nghiệm đáp ứng viêm gây ra bởi LPS thay bằng ức chế PGE2 trên MCF7

[118].

Do vậy, các dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và khả năng ức chế

sản sinh NO được lựa chọn là các công cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính kháng viêm của

lớp chất nghiên cứu. Và để xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các

chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2, các phương pháp phân tích chu kỳ

tế bào, các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào

với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3, nghiên

cứu cảm ứng apoptosis bằng phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI.

Sau cùng, các chất đã được chọn lọc và nghiên cứu cơ chế sinh học sẽ được thử

nghiệm tương tác với các đích tác dụng tubulin và COX2 bằng phương pháp docking

phân tử để khẳng định độ chính xác hoạt tính sinh học của mô hình in vitro.

3.2. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin

Phương pháp một bình phản ứng đã được áp dụng để điều chế các dẫn chất etyl

1,4,5-triaryl-1H pyrazol-3-cacboxylat từ ethyl oxalyl chlorid, 1,2-diarylethanon và

ethyl oxalyl chloride arylhydrazin hydrochlorid (Hình 2.1, Hình 2.2, Hình 2.7, Hình

2.8) [119]. Phản ứng ngưng tụ Claisen giữa hai thành phần 1,2-diarylethanon và ethyl

oxalyl chlorid với tác nhân kiềm sử dụng là tert-BuOLi, thu được sản phẩm trung gian

muối lithium của ethyl 2,4-dioxo-3,4-diarylbutanoat, phản ứng được tiếp tục với

arylhydrazin hydrochlorid thông qua phản ứng Knorr được xúc tác bởi axit clohydric

để tạo ra triarylpyrazol - 3 - cacboxylat (hợp chất lai 79 đến 98) và (hợp chất lai 103

đến 122). Một chu trình điều chế dạng dẫn chất của celecoxib cũng được áp dụng

(Hình 2.4, Hình 2.5) 3,4,5-trimethoxyphenyl - 1,1,1-trifluoro-2,4-butanedion (65, 102)

thu được từ sự ngưng tụ Claisen giữa các dẫn xuất acetophenon và etyl trifluoroacetat

sau đó tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo thành

3,4,5-trimethoxyphenyl, một chất có cấu trúc tương tự celecoxib.

Theo các quy trình phản ứng được mô tả trong Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp chất

lai coxib - combretastatin đã được tổng hợp thành công, phản ứng được thực hiện 3 lần

độc lập để đưa ra hiệu suất trung bình. Sản phẩm thu được đạt hiệu suất từ 64 – 83%

với các sản phẩm lai coxib – combretastatin dạng este (Bảng 3.1), 02 hợp chất chứa

nhóm CF3 với hiệu suất lần lượt là 95%. 78% (bảng 3.2), 20 hợp chất dạng axit của

chất lai coxib - combretastatin với hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); Qua đó có thể

thấy hiệu xuất các sản phẩm lai thu được qua 2 giai đoạn phản ứng là cao. Các chất

được tiến hành xác định cấu trúc bằng các phương pháp tinh chế và phương pháp phổ

cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D, 2D.

Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp các chất este từ chất 79 đến chất 98

Chất

76(khối

(ii)

Chất 78

Sản phẩm

Lƣợng

Hiệu suất

TT

lƣợng)

(mg)

(ký hiệu)

(mg)

(%)

76

83%

196 mg

136

174 mg

330

79

136

76%

176 mg

196 mg

331

80

136

196 mg

270 69%

169 mg

81

136

73%

189 mg

196 mg

268

82

136

223 mg

196 mg

330 75%

83

136

256 mg

174 mg

380 83%

84

136

176 mg

256 mg

386 78%

85

136

256 mg

316 70%

169 mg

86

136

189 mg

256 mg

283 60%

87

136

395 78%

223 mg

256 mg

88

136

174 mg

275 mg

367 77%

89 275 mg

136

176 mg

355 69%

90 275 mg

136

169 mg

306 65%

91 275 mg

136

189 mg

329 67%

92 275 mg

136

223 mg

393 75%

93 223 mg

136

215 mg

338 73%

94 223 mg

136

228 mg

204 66%

95 223 mg

136

214 mg

312 67%

96 223 mg

136

230 mg

360 75%

97 223 mg

136

256 mg

324 64%

98

Hình 2.3. Công thức cấu tạo các hợp chất 79-98

Ethyl 1-(4-methoxyphenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (79; 83% )

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 4.33 (q, J

＝7.1, 2H, CH2); 6.81 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 6.98 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.25 (m, 10H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.5; 55.5; 60.8; 113.9 (2C); 124.5; 127.0

(2C); 127.1; 127.6 (2C); 128.3 (2C); 128.4; 129.1; 130.4 (2C); 130.7 (2C); 131.9; +; 132.6; 141.2; 142.2; 159.2; 162.5. HRMS, m/z = 399.1710 ([M+H]+, C25H23N2O3

calc. 399.1703).

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

Ethyl 4,5-diphenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (80; 76%)

7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.20－7.27 (m, 8H, Ph); 7.45 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.58 (d, J

＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.1; 125.4; 125.5 (2C); 126.1;

127.0 (2C); 127.3 (2C); 127.7 (2C); 128.6 (3C); 128.9; 130.3 (2C); 130.6 (2C); 131.4; +; calc. 142.1; 142.3; 142.5; 162.2. HRMS, m/z = 437.1476 ([M+H]+, C25H20F3N2O2

437.1471).

Ethyl 1-(4-cyanophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (81; 69%)

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.30 (m, 8H, Ph); 7.45 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.61 (d, J

＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 111.6; 117.9; 125.6 (2C);

+; calc. 394.1550).

125.7; 127.4; 127.7 (2C); 128.4;128.7 (2C); 129.1; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.1; 132.8 (2C); 142.3; 142.7; 142.9; 162.1. HRMS, m/z = 394.1551 ([M+H]+,

C25H20N3O2

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2),

Ethyl 1-(4-nitrophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (82; 65%)

7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.19－7.33 (m, 8H, Ph); 7.50 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 8.18 (d, J

＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.5; 61.2; 121.3 (2C); 125.5 (2C);

125.8; 127.4; 127.7 (2C); 128.4; 128.8 (2C); 129.2; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.0; 142.5; 143.1; 144.2; 146.6; 162.0. HRMS, m/z = 414.1449 ([M+H]+, C24H20N3O+; calc.

414.1448).

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

Ethyl 4,5-diphenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (83; 85%)

4.96 (s, 2H, NH2); 7.00 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.29 (m, 8H, Ph); 7.46 (d, J＝8.3,

2H, Ph); 7.85 (d, J＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 125.6

(2C); 127.3 (3C); 127.7 (3C); 128.4; 128.7 (2C); 129.0; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.2; 141.1; 142.4; 142.6; 142.7; 162.3. HRMS, m/z = 448.1327 ([M+H]+, C24H22N3O4S+ ;

calc. 448.1326).

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.27 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.73 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

Ethyl 1,4,5-tris(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (84; 83%)

6H, 2OMe); 4.31 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.68 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 6.81- 6.83 (m, 4H,

Ph); 6.87 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.13 (d, J＝8.8, 2H, Ph); 7.20 (d, J＝8.8, 2H, Ph). 13C

NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1 (2C); 55.47; 60.78; 113.2; 113.7 (2C); 113.9

(2C); 121.3; 123.9 (2C); 124.3; 127.0 (2C); 131.6 (2C); 131.8 (2C); 132.8; 141.1; +; 142.0; 158.6; 159.1; 159.4; 162.6. HRMS, m/z = 459.1914 ([M+H]+, C27H27N2O5

calc. 459.1914).

Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.27 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

carboxylate (85; 78%)

3H, OMe); 4.32 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.73 (d, J＝8, 2H, Ph); 6.82 (d, J＝8.7, 2H, Ph);

6.90 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 7.13 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.40 (d, J＝8.2, 2H, Ph); 7.57 (d, J

＝8.2, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1 (2C); 61.0;113.2 (2C);

114.1 (2C);120.8; 123.7 (2C); 124.8 (2C); 125.5 (2C); 126.0 (4C); 131.6; 131.7; 142.1; +; 142.3; 142.4; 158.8; 159.8; 162.4. HRMS, m/z = 497.1683 ([M+H]+, C27H24F3N2O4

calc. 497.1683)

Ethyl 1-(4-cyanophenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (86;

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

70%)

3H, OMe); 4.33 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.75 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6.81 (d, J＝8.3, 2H,

Ph); 6.90 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.11 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.40 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 7.60

(d, J＝9.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1; 55.2; 61.1; 111.4;

+; calc. 454.1761).

113.3 (2C); 114.2; 118.2 (2C); 120.6; 123.4 (2C); 125.1; 125.6 (2C); 131.5 (2C); 131.7

(2C); 132.8; 142.1; 142.8; 142.9; 158.8; 160.0; 162.2. HRMS, m/z = 454.1765 ([M+H]+, C27H24N3O4

Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-nitrophenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (87;

60%)

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.29 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

3H, OMe); 4.33 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.76 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6,81 (d, J＝8.3, 2H,

Ph); 6.92 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.12 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.49 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 8.17

(d, J＝9.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1; 55.2; 61.1; 113.4

+; calc. 474.1660).

(2C); 114.3 (2C); 120.5; 123.3 (2C); 124.3 (2C); 125.3 (2C); 131.1 (2C); 131.6 (2C); 142.3; 143.0; 144.4; 146.5; 158.8; 160.0; 162.2. HRMS, m/z = 474.1659 ([M+H]+,

C26H24N3O6

Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (88;

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.0, 3H, Me); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

78%)

3H, OMe); 4.30 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.73 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6.80 (d, J＝8.3, 2H,

Ph); 6.89 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.11 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.42 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 7.82

(d, J＝9.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 55.1; 55.2; 61.1; 113.2

(2C); 114.3 (2C); 120.5; 123.5 (2C); 125.6 (2C); 127.2(2C); 131.6 (2C); 131.7 (2C); 141.1; 142.2; 142.6; 142.7; 158.8; 159.9; 162.3. HRMS, m/z = 508.1540 ([M+H]+, C26H26N3O6S+; calc. 508.1537).

Ethyl

5-(4-bromophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.80 (s, 3H, OMe); 4.32 (q, J

(89; 77%)

＝7.1, 2H, CH2); 6.82- 6.85 (m, 4H, Ph); 7.19－7.21 (m, 4H, Ph); 7.25－7.30 (m, 5H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 55.6; 60.8; 113.9 (2C); 124.5; 127.0 (2C);

127.1; 127.6 (2C); 128.3 (2C); 128.4; 129.1; 130.4 (2C); 130.7 (2C); 131.9; 132.6; +; calc. 141.2; 142.2; 159.2; 162.5. HRMS, m/z = 477.0813 ([M+H]+, C25H22BrN2O3

477.0808).

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.32 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

carboxylate (90; 69%)

6.85 (m, 2H, Ph); 7.10－7.20 (m, 2H, Ph); 7.29－7.30 (m, 3H, Ph); 7.35－7.36 (m,

2H, Ph); 7.45 (d, J＝7.4, 2H, Ph); 7.3 (d, J＝7.6, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz,

+; calc. 515.0577).

CDCl3): δ 14.0; 61.1; 125.5 (2C); 125.6; 126.2 (3C); 127.5 (3C); 127.9 (3C); 130.5

(2C); 131.0 (2C); 131.7 (2C); 132.0; 141.9; 142.0; 142.6; 162.0. HRMS, m/z = 515.0576 ([M+H]+, C25H19BrF3N2O2

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-cyanophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (91;

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.23 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

65%)

6.87 (d, J＝6.86, 2H, Ph); 7.17－7.18 (m, 2H, Ph); 7.26-7.29 (m, 3H, Ph); 7.38 (d, J＝

7.3, 2H, Ph) ); 7.45 (d, J＝7.4, 2H, Ph); 7.65 (d, J＝7.6, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz,

+; calc. 472.0655).

CDCl3): δ 14.1; 61.2; 111.9; 117.8; 123.7; 125.7 (2C); 125.9; 127.3; 127.6; 127.9 (2C);

130.4 (2C); 130.8; 131.6 (2C); 132.1 (2C); 133.0 (2C); 141.1; 142.4; 143.0; 161.9. HRMS, m/z = 472.0661 ([M+H]+, C25H19BrN3O2

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-nitrophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (92;

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.34 (q, J＝7.1, 2H, CH2),

67%)

6.88 (d, J＝8.2, 2H, Ph); 7.17－7.19 (m, 2H, Ph); 7.29－7.30 (m, 3H, Ph); 7.39 (d, J

＝8.2, 2H, Ph); 7.5 (d, J＝8.6, 2H, Ph); 8.2 (d, J＝9.3, 2H, Ph); 13C NMR (125 MHz,

+; calc. 492.0553).

CDCl3): δ 14.2; 61.2; 111.8; 117.8; 123.7; 125.6 (2C); 125.9; 127.5; 127.6; 127.9 (2C);

130.9 (2C); 130.8; 131.1 (2C); 132.4 (2C); 133.0 (2C); 141.2; 142.2; 143.1; 161.9. HRMS, m/z = 492.0555 ([M+H]+, C24H19BrN3O2

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

(93; 75%)

4.91 (s, 2H, NH2); 6.87 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.17－7.29 (m, 2H, Ph); 7.28－7.30 (m,

3H, Ph); 7.36 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.47 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7,91 (d, J＝9.1, 2H, Ph).

13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.4; 123.7; 125.6 (2C); 125.8; 127.3 ;

127.5(2C); 127.6 (2C); 127.9; 130.4 (2C); 130.9; 131.7 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 142.6; 142.8; 162.0. HRMS, m/z = 526.0429 ([M+H]+, C24H21BrN3O4S+; calc.

526.0431).

Ethyl 5-(4-hydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.14 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.22 (q, J＝7.0, 2H, CH2);

(94; 73%)

6.64 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 6.93 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.20 (m, 2H, Ph); 7,27 (m, 3H, Ph);

7,45 (s, 2H, NH2); 7.49 (d, J＝8.5, 2H, Ph); 7.83 (d, J＝8.6, 2H, Ph); 9.72 (s, 1H, OH); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.3; 60.8; 111.9; 115.9 (2C); 124.5 (2C);

126.0 (2C); 127.4 ; 128.0 (2C); 130.8 (2C); 132.0 (2C); 132.2 (2C); 141.9; 142.0; 143.1; 143.8; 158.3; 162.2. HRMS, m/z = 464.1276 ([M+H]+, C24H22N3O5S+; calc.

464.1275).

Ethyl 5-(2,4-dihydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.22 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.08 (q, J＝7.0, 2H, CH2);

carboxylate (95; 66%)

6.93 (d, J＝8.3, 2H); 6,98-7.11 (dd, J＝8.4, 2H, Ph); 7.23 – 7.25 (m, 4H, Ph); 7.40 –

7.41 (m, 6H, Ph, NH2); 7.95 (d, J＝7.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ

14.5; 62.5; 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8;

129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1; 175.7; HRMS, m/z = 480.1200 ([M+H]+, C24H22N3O6S+; calc. 480.1224).

Ethyl 5-(4-fluorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.13 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.18 (q, J＝7.0, 2H, CH2);

(96; 67%)

6.93 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.11- 7.17 (dd, J＝8.4, 3H, Ph); 7.48 – 7.51 (m, 2H, Ph); 7.52

– 7.53 (m, 2H, Ph); 7.84 (d, J＝7.0, 2H, Ph).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.1;

61.4; 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 141.3; 142.3; 162.0; HRMS, m/z = 466.1230 ([M+H]+, C24H21FN3O4S+; calc. 466.1231).

Ethyl 5-(4-chlorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.27 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 5.2

(97; 75%)

(s, 2H, NH2); 6.9 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.19－7.20 (m, 2H, Ph); 7.26－7.29 (m, 3H,

Ph); 7.41 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.43 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.85 (d, J＝9.1, 2H, Ph). 13C

NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 126.6; 125.6 (2C); 125.8; 127.3 ; 127.5(2C);

127.6 (2C); 127.9; 130.4 (2C); 130.9; 131.7 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 141.6; 142.7; 162.0. HRMS, m/z = 482.0935 ([M+H]+, C24H21ClN3O4S+; calc. 482.0936).

Ethyl 5-(2,4-dimethoxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.25 (m, 3H, Me); 3.84 (s, 3H, OMe); 3.88 (s, 3H,

carboxylate (98; 64%)

OMe); 4.27 (s, 2H, CH2); 6.44 (d, J＝3.1, 1H, Ph); 6,50 (dd, J＝8.3, 1H, Ph); 7.20 – 7.22 (m, 4H, Ph); 7.25 – 7.28 (m, 5H, Ph); 7.78 (d, J = 8.0, 1H, Ph). 13C NMR (125

MHz, DMSO-d6): δ 14.4;55.6 (C); 61.2 (2C); 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C);

128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1; 175.7; HRMS, m/z = 508.1570 ([M+H]+, C26H26N3O6S+; calc. 508.1537).

Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp các chất 65, 102

100 Chất 101

Chất 78e

Sản phẩm

Lƣợng thu

Hiệu suất

TT

(mg)

(ký hiệu)

(mg)

(%)

170

208

360

134 mg

65

170

208

355

210 mg

102

4-(3-(trifluoromethyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-pyrazol-1-yl)benzenesulfonamide

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.69 (s, 6H, 2OMe, Ph); 3.87 (s, 3H, OMe, Ph);

(102; 78%)

4.99 (s, 2H, NH2); 6.44 (s, 2H, Ph); 6,76 (s, 1H, Ph); 7.50 (d, J = 8.0, 2H, Ph); 7.92 (d, J = 8.0, 2H, Ph).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 56.2 (2C); 61.3; 102.4 (3C);

123.8; 125.5 (3C); 127.4 (3C); 141.5; 145.0; 153.5 (3C). HRMS, m/z = 458.0962 ([M+H]+, C19H18F3N3O5S+; calc. 458.0992).

Bảng 3.3. Kết quả tổng hợp các dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122

Chất

M chất đầu

Sản phẩm

Lƣợng thu

Hiệu suất

NaH

TT

(mg)

(ký hiệu)

(mg)

(%)

165

114

74%

79

103

165

105

68%

80

104

135

65%

81

105

134

65%

82

106

165

111

67%

83

107

190

132

74%

84

108

193

127

70%

85

109

158

63%

86

110

141

54%

87

111

197

131

70%

88

112

183

119

69%

89

113

177

106

62%

90

114

153

58%

91

115

164

60%

92

116

196

125

67%

93

117

169

110

69%

94

118

102

59%

95

119

156

64%

96

120

180

115

67%

97

121

162

57%

98

122

Trong số các hợp chất lai thu được, các chất 79 đến 98 và 102 đến 122 lần đầu

tiên được tổng hợp và chưa từng được công bố trước đây. Và 01 hợp chất đã được công

bố là celecoxib (65) cũng được coi là chất gốc của hợp chất lai được biết đến với nhiều

công trình nghiên cứu [4-5].

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.0 (s, 3H); 6.16 (d, J＝8.8 Hz, 2H); 6.81 (dd, J＝

1-(4-methoxyphenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (103; 74%)

9.4 Hz, J＝1.4 Hz, 2H); 6.4－6.5 (m, 10H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.3;

113.9 (2C); 123.4; 126.7; 126.9(3C); 127.4 (2C); 128.2 (3C); 128.5; 128.8; 130.3 (3C); +, 131.9; 132.1; 142.0; 158.7; 163.2. HRMS, m/z = 371.1403 ([M+H]+. C23H19N2O3

calc. 370.13).

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.13(d, J＝8.2 Hz, 2H); 7.19－7.32 (m, 8H); 7.5 (d,

4,5-diphenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (104; 68%)

J＝8.2 Hz, 2H); 7.77 (d, J＝8.2 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 124.2;

125.7 (2C); 126.1(3C); 126.9 (2C); 127.5 (2C); 128.4 (2C); 128.9 (3C); 130.3 (3C); +. 131.4; 142.1 (2C); 142.5; 163.0. HRMS, m/z = 409.1194 ([M+H]+. C23H15F3N2O2

calc. 408.3802)

1-(4-cyanophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (105; 65%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.13 (m, 2H); 7.18－7.30 (m, 10H); 7.46 (dd, J＝

6.8 Hz, J＝2.0 Hz, 2H); 7.87 (d, J＝6.8 Hz, J＝2.0 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz,

+, calc. 366.1238)

DMSO-d6): δ 110.6; 117.9; 125.7 (2C); 126.9; 127.5 (2C); 128.3; 128.5 (2C); 129.0;

130.2 (3C); 130.3 (2C); 131.3; 133.2 (2C); 142.2; 142.4; 142.7; 162.9. HRMS, m/z = 366.1270 ([M+H]+, C23H16N3O2

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.15－7.34 (m, 10H); 7.55 (dd, J＝7.0 Hz, J＝2.2

1-(4-nitrophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (106, 65%)

Hz, 2H); 8.2 (dd, J＝7.0 Hz, J＝2.2 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 120.4

(3C); 125.8 (3C); 127.0; 127.5 (2C); 128.2; 128.5 (2C); 129.2; 130.2 (2C); 130.4 (2C); +, 131.4; 142.3; 143.8; 146.3; 162.9; HRMS, m/z = 386.1174 ([M+H]+, C22H15N3O4

calc. 386.1136)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.15 (d, J＝8.2 Hz, 2H); 7.2－7.33 (m, 8H); 7.46

4,5-diphenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (107; 67%)

(m, 4H); 7.81 (d, J＝9.2 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 124.7; 126.9

(3C); 127.4 (3C); 128.0; 128.9 (2C); 129.4; 130.8 (2C); 132.0; 141.8; 142.7; 142.9; 143.8; 163.5. HRMS, m/z = 420.1055 ([M+H]+. C22H18N3O4S+. calc. 419.4550).

1H NMR (500 MHz,) δ 3.68 (s, 3H); 3.71 (s, 3H); 3.75 (s, 3H); 6.78 - 6.81 (m, 4H);

1,4,5-tris(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (108,74%)

6.92 (d, J＝8.6 Hz, 2H); 6.98 (d, J＝8.6 Hz, 2H); 7.01 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.20 (d, J＝

-. calc. 430.4600)

8.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 55.4 (2C); 55.8; 113.5; 114.2 (2C); 114.4

(2C); 121.5; 123.4; 124.6; 127.4 (2C); 131.9 (2C); 132.2 ; 132.8; 141.6; 142.3; 158.5; 159.2; 159.5; 163.9. HRMS, m/z = 429.1424; ([M+H]+. C25H21N2O5

4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.71 (s, 3H); 3.73 (s, 3H); 6.82 - 6.86 (m, 4H); 7.06

(109; 70%)

(d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.11 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.5 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.78 (d, J＝9.0

Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4; 55.5; 113.5 (2C); 114.5 (2C);121.0;

124.1; 124.3 126.2 (2C); 126.6 (4C); 128.4; 128.6; 131.9; 132.2; 142.4; 142.9; 143.0; +, calc. 468.4322) 158.7; 159.9; 163.7. HRMS, m/z = 469.1278 ([M+H]+. C25H20F3N2O4

1-(4-cyanophenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (110;

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.72 (s, 3H); 3.73 (s, 3H); 6.82 – 6.87 (m, 4H); 7.0

63%,)

(d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.11 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.74 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 7.89 (d, J＝9.00

Hz, 2H); .13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4 (2C); 110.9; 113.5 (2C); 114.5;

118.5; 120.9; 124.1 ; 124.5; 126.2 (2C); 131.9 (2C); 132.2 (2C); 133.7; 142.5; 143.1; +, calc. 143.3; 158.8; 160.0; 163.7. HRMS, m/z = 426.1372 ([M+H]+. C25H20N3O4

425.4440)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.72 (s, 3H); 3.74 (s, 3H); 6.68 (m, 4H); 7.08 (m,

4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-nitrophenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (111; 54%)

4H); 7.54 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.82 (d, J＝9.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-

+; calc. 445.4310)

d6): δ 55.4 (2C); 110.9; 113.5 (2C); 114.5; 118.5; 120.9; 124.0 ; 124.5; 126.1 (2C);

131.9 (2C); 132.0 (2C); 133.2; 142.5; 143.0; 143.3; 158.8; 160.1; HRMS, m/z = 446.1248. ([M+H]+. C24H20N3O6

4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (112;

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.73 (s, 6H); 6.82 (m, 4H); 7.05 (m , 4H); 7.45 (m,

70%,)

4H); 7.81 (d, J＝7.7 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4 (2C); 113.5

(2C); 114.5 (2C); 121.1; 124.5; 125.9 (2C); 126.9 (2C); 131.9 (2C); 132.3; 142.0; 142.4; 143.6; 158.6; 159.8; HRMS, m/z = 480.1126. ([M+H]+. C24H22N3O6S+; calc.

479.1151)

5-(4-bromophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.76 (s, 3H); 6.94 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 7.0 (d, J＝8.4

(113; 69%)

Hz, 2H); 7.17 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 7.23 – 7.26 (m, 5H); 7.45 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 13C

NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4; 114.0 (2C); 127.0 (2C); 127.5; 128.3 (2C); 130.3 -, (2C); 131.2 (2C); 132.4 (2C); 159.2; HRMS, m/z = 447.0359 ([M-H]-; C23H16BrN2O3

calc. 448.04)

5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-(trifluoromethyl) phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.08 (d, J＝7.4 Hz, 2H); 7.21 (m, 2H); 7.25－7.30

acid (114; 62%)

(m, 3H); 7.74 (d, J＝7.4 Hz, 2H); 7.82 (d, J＝7.4 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz,

-. calc. 487.2762)

DMSO-d6): δ 123.2 (2C); 125.0; 126.4 (3C); 126.8 (3C); 127.6; 128.1 (2C); 130.8; 131.0; 132.0 (2C); 132.9; 141.5; 142.4; 143.1; 163.4. MRMS, m/z = 487.0092 ([M-H]-

C23H13BrF3N2O2

5-(4-bromophenyl)-1-(4-cyanophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (115,

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.07 (d, J＝7.4 Hz, 2H); 7.20 (m, 2H); 7.27－7.29

58%)

(m, 3H); 7.49 – 7.52 (m, 4H); 7.92 (d, J＝7.4 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-

-. calc. 444.2880)

d6): δ 111.3; 111.8; 123.2; 125.2; 126.4; 127.6; 128.1; 130.8 (2C); 131.6; 132.1 (2C); 132.9; 133.8; 141.6; 142.8; 143.3; 163.7. HRMS, m/z = 444.0161 [M-H]-.

(C23H13BrN3O2

5-(4-bromophenyl)-1-(4-nitrophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (116;

60%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.1 (d, J＝8.2 Hz, 2H); 7.2－7.21 (m, 2H); 7.26－

13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 123.4; 125.1 (2C); 125.4; 126.5 (2C); 127.7;

+. calc. 464.2750)

7.30 (m, 3H); 7.50 (d, J＝8.3 Hz, 2H); 7.57 (d, J＝8.3 Hz, 2H); 8.2 (d, J＝8.8 Hz, 2H);

128.0; 128.1; 130.8 (2C); 132.1 (2C); 132.9 (2C); 141.1; 143.6; 144.1; 146.9; 163.4. HRMS, m/z = 466.0131 ([M+H]+. C22H15BrN3O4

5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7.0 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.18－7.20 (m, 2H); 7.24－

(117; 67%)

7.27 (m, 3H); 7.46 (s, 2H); 7.4 – 7.51 (dd, J＝3.2 Hz, J＝8.4 Hz, 4H) 7.8 (d, J＝8.5

Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 123.1; 125.0; 126.2 (2C); 127.1 (2H);

127.6 (2C); 128.1 (2C); 128.2; 130.8 (2C); 131.7 (2C); 132.0 (2C); 132.9 (2C) 141.6; 143.1; 144.1; 163.6. HRMS, m/z = 499.9993 ([M+H]+. C22H17BrN3O4S+. calc.

498.3510)

5-(4-hydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.65 (d, J＝8.6 Hz, 1H); 6.76 (d, J＝8.6 Hz, 1H);

(118; 69%)

6.91 (d, J＝8.6 Hz, 1H); 7.08 - 7.36 (m, 7H); 7.43-7.54 (m, 5H); 7.82 (d, J＝8.6 Hz,

1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 115.8 (2C); 123.5 (2C); 125.0; 128.0 (2C);

130.8 (2C); 132.0 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 142.6; 142.8; 162.0; HRMS, m/z = 436.0873 ([M+H]+, C22H17N3O5S+, calc. 436.0962)

5-(2,4-dihydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.91 (d, J＝3.2 Hz, 2H); 6,96- 6.98 (dd, J＝8.6 Hz,

acid (119; 59%)

J＝3.2 Hz 2H); 7.25 – 7.27 (m, 3H); 7.35 – 7.39 (m, 5H); 7.92 (d, J＝8.3 Hz, 2H). 13C

NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 102.6; 116.4 (2C); 127.7; 128.1 (2C); 130.4 (3C); 132.4 (2C); 157.7; 157.3; 162.8; 163.7; 175.9; HRMS, m/z = 452.1200 ([M+H]+ C22H18N3O6S+, calc. 451.4530)

5-(4-fluorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.10 – 7.28 (m, 9H); 7.45 – 7.48 (m, 2H); 7.50 (d, J

(120; 64%)

＝8.3 Hz, 2H);7.84 (d, J＝8.3 Hz, 2H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 116.0;

116.2; 124.9; 125.4; 126.1 (2C); 127.0 (2C); 127.5; 128.1; 129.3; 130.2; 130.8; 131.9;

133.2; 133.3; 141.7; 141.8; 142.8; 143.9; 163.5; 163.6; HRMS, m/z = 436.0768 ([M - H]-, C22H16FN3O4S-, calc. 436.0772)

5-(4-chlorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.15 (d, J＝7.9 Hz, 2H); 7.20 (d, J＝7.0 Hz, 2H);

(121; 67%)

7.25－7.28 (m, 3H); 7.36 (d, J＝7.9 Hz, 2H); 7.47 (s, 2H); 7.50 (d, J＝7.9 Hz, 2H); 7.8

(d, J＝7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 124.9; 126.1 (2C); 127.1 (2C);

127.5; 127.9; 128.1 (2C); 129.1 (2C); 130.8 (2C); 131.8; 132.7; 132.8; 134.3; 141.2; 141.7; 143.9; 146.7; 162.0. HRMS, m/z = 454.0538 ([M+H]+. C22H16ClN3O4S+. calc.

453.8970)

5-(2,4-dimethoxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.9 (d, J＝7.0 Hz, 2H); 7.20 – 7.22 (m, 4H); 7.25 –

acid (122; 57%)

7.28 (m, 5H); 7.78(d, 1H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 116.4; 125.5; 127.8

(2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1; 175.7; HRMS, m/z = 480.1570 ([M+H]+. C24H21N3O6S+, calc. 479.1151)

3.3. Hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin

3.3.1. Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin

Sàng lọc hoạt tính của 20 hợp chất lai hóa coxib - combretastatin dạng este và 02

chất lai chứa nhóm CF3

Độc tính tế bào của 20 hợp chất lai hóa coxib dạng este và 02 hợp chất chứa

nhóm CF3 đã được đánh giá về tỷ lệ ức chế sự phát triển tế bào trên ba dòng HT-29,

Hep-G2 và MCF-7 bằng phương pháp được phát triển bởi Monks và cộng sự [120].

Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3.4 theo hoạt tính giảm dần. Các hoạt tính chống tăng

sinh của celecoxib thể hiện trên các tế bào ung thư ở người như ung thư vú (MCF-7),

ung thư gan (Hep-G2) ung thư trực tràng (HT-29) đã được công bố [121-123]. Trong

phạm vi công trình nghiên cứu này 12 hợp chất lai hóa mới 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91,

92, 89, 90, 97, 85 thể hiện độc tính tế bào trên các dòng MCF-7 mạnh hơn celecoxib

và năm hợp chất 102, 96, 81, 82, 94 có IC50 < 10 µM. Trong đó một số các hợp chất

như 102, 96, 94, 93 và 97 cũng có độc tính Hep-G2 tương đương với chất gốc

celecoxib (65). Hơn nữa, 05 hợp chất lai 96, 94, 90, 97, 80 cho thấy khả năng chống lại

tế bào HT-29 mạnh hơn 3-6 lần so với chất gốc celecoxib và hợp chất 90 có IC50 10

µM. Qua đó có thể khẳng định, sự hiện diện của các nhóm thế chứa nitơ, halogen tại vị

trí para- của cả hai vòng phenyl liền kề 96, 93, 91, 92, 97 góp phần làm tăng độc tính tế

bào. Hợp chất 102 mang đầy đủ các đặc điểm cấu trúc của khung celecoxib và CA4

cho thấy hoạt tính gây độc tế bào nổi trội với dòng MCF-7. 21 hợp chất và celecoxib

(65) cũng được thử tác dụng ức chế oxit nitric (NO) khi kích hoạt lipopolysaccharide

(LPS) trên đại thực bào RAW 264.7 [124]. Điều thú vị là, ngoại trừ các hợp chất 102

và 98 có hoạt tính kép mạnh nổi trội đối với việc ức chế sản xuất NO cũng như hoạt

động gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, các hợp chất khác trong nhóm

này thể hiện hoạt động ức chế sản xuất NO yếu hơn , nhấn mạnh rằng chúng có thể có

tính an toàn tốt hơn trên hệ thống tim mạch so với celecoxib [110].

Bảng 3.4. Tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng este đối với ba dòng

tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và ức chế sản xuất NO

STT Hợp

R

R’

R’’

IC50 (µM)

chất

Ức chế

sản

HT-29

Hep-G2

MCF-7

xuất NO

3,4,5-

43.0 ± 6.0 39.96± 3.36

1

102 1.95±0.11

4.63± 0.59

4-NH2SO2

triOMe

4-F

81.6 ± 10.6

18.7 ± 1.7 29.37± 1.90

2

96 7.97±0.51

4-NH2SO2

4-CN

116.83±7.7

37.6±3.5

>254

3

81 8.20± 0.93

129.88±15.7

21.2±2.1

>242

4

82 9.67± 0.92

4-NO2

4-OH

92.3 ± 7.2

5

94

18.8 ± 1.5 14.51±1.36

8.90± 0.79

4-NH2SO2

73.7 ± 2.6

4-Br

23.5 ± 1.8 35.48±2.85

19.27±0.27

6

93

4-NH2SO2

4-Br

4-CN

116.01±13.6

32.6± 3.0

>211

20.16± 1.83

7

91

4-Br

91.58±7.8

153.2± 10 >203

21.30± 1.40

8

92

4-NO2

4-Br

4-OMe

21.01±4.3

39.6±2.9

>209

21.51± 1.48

9

89

4-Br

> 233

75.87±4.41

21.65± 1.86

10

90 10.0±0.7

4-CF3

4-Cl

122.2 ± 9.7

14.1 ± 1

37.04±4.95

23.79± 3.11

11

97

4-NH2SO2

4-OMe

134.10±15.7

107± 10

>201

29.80± 2.71

12

85

4-CF3

13

65 4-Me

83.59 ± 5.0

58.4 ± 3.4 37.11±2.14

30.67±3.79

4-NH2SO2

4,6-

136.0

>197

39.93± 2.64

14

98 4.41±0.17

4-NH2SO2

diOMe

> 233

100 ± 10

54.35±4.57

40.54±2.56

15

83

4-NH2SO2

4-OMe

30.0±13.4

>251

21.43±1.93

43.19±4.86

16

79

4-OMe

148.85±8.4

>211

48.81± 2.62

17

87

4-NO2

4-OMe

4-CN

76.42±9.4

110.3±7.0 >220

48.86± 3.13

18

86

4-OMe

67.06±3.7

160±15

>218

49.32± 1.72

19

84

59.52±5.5

17.3±2.0

63.17± 3.01

50.66± 4.46

20

80

4-CF3

4-OMe

103.4 ±10.5

99.0±6.3

58.57± 4.70

68.43± 7.05

21

88

4-NH2SO2

4,6-

> 208.5

173.9

64.03± 5.75

83.60± 3.44

22

98

4-NH2SO2

diOH

8.39±0.31

L-NMMA

0.44± 0.05

0.36± 0.04

0.18±

Ellipticine

0.04

20 hợp chất axit tổng hợp thành công được tiến hành sàng lọc hoạt tính với dòng

tế bào ung thư vú MCF7 và khả năng ức chế sản xuất NO đem so sánh với các chất

dạng lai hóa este. Tuy nhiên kết quả hoạt tính thu được của các chất gốc axit là thấp

hơn đáng kể so với hoạt tính của các chất lai hóa dạng este. Hoạt tính được thể hiện

trong bảng 3.5. Theo kết quả sàng lọc thu được bước đầu có thể khẳng định chất lai

coxib – combretastatin khi chuyển sang dạng lai có gốc axit thì hoạt tính giảm đi đáng

kể, tuy nhiên hai chất 116 và 111 thể hiện khả năng ức chế sản sinh NO cao hơn so với

chất kháng viêm celecoxib và đồng thời cao hơn chất lai coxib - combretastatin khi ở

dạng este.

Bảng 3.5. So sánh tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng axit và dạng

este đối với tế bào ung thư MCF-7 và ức chế sản xuất NO

IC50 (µM)

R’

R’’

STT

R

Este (NO)

Axit (NO)

Este (MCF-

Axit (MCF7)

7)

3,4,5-

43.0 ± 6.0

39.96± 3.36

1.95±0.11

4.63± 0.59

1

triOMe

NH2SO2

4-F

81.6 ± 10.6

194.5±7.6

187.7±9.5

2 7.97±0.51

NH2SO2

4-CN

116.83±7.7

256.7±22.1

154.5±15.1

8.20± 0.93

3

129.88±15.7

>261.1

187.6±10.4

9.67± 0.92

4

4-NO2

4-OH

92.3 ± 7.2

75.8±2.6

34.6±2.6

8.90± 0.79

5

NH2SO2

73.7 ± 2.6

4-Br

>202.0

19.27±0.27

149.5±7.3

6

NH2SO2

4-Br

4-CN

116.01±13.6

97.9±9.4

20.16± 1.83

70.1± 4.6

7

4-Br

91.58±7.8

111.2±8.7

21.30± 1.40

34.0±6.4

8

4-NO2

4-Br

4-OMe

21.01±4.3

>223.7

21.51± 1.48

>223.7

9

4-Br

> 233

80.0±6.3

21.65± 1.86

129.5±9.7

10

4-CF3

4-Cl

122.2 ± 9.7

>220.7

23.79± 3.11

191.1±20.6

11

NH2SO2

4-OMe

134.10±15.7

140.3±16.7

29.80± 2.71

136.0±8.4

12

4-CF3

13 4-Me

4-

83.59 ± 5.0

30.67±3.79

30.0±3.3

NH2SO2

4,6-

>208.7

39.93± 2.64

94.0±6.4

14 4.41±0.17

diOMe

NH2SO2

> 233

>239.8

40.54±2.56

178.9±12.9

15

NH2SO2

4-OMe

30.0±13.4

>271.7

43.19±4.86

209.3 ± 20.0

16

4-OMe

148.85±8.4

185.9±9.8

48.81± 2.62

17 31.8±3.7

4-NO2

4-OMe

4-CN

76.42±9.4

157.0±12.2

48.86± 3.13

83.0±10.3

18

4-OMe

67.06±3.7

145.7±15.2

49.32± 1.72

75.7±6.9

19

59.52±5.5

109.4±5.8

50.66± 4.46

203.8 ± 5.1

20

4-CF3

4-OMe

103.4 ±10.5

>209

68.43± 7.05

150.0±14.7

21

NH2SO2

> 208.5

>222.0

83.60± 3.44

>222.0

4,6-

22

diOH

NH2SO2

8.39±0.31

L-NMMA

0.36± 0.04

Ellipticine

Ghi chú: * : Cột thống kê hoạt tính các chất este

**: Cột thống kê hoạt tính các chất axit

Các hợp chất lai 102, 96, 81, 82, 94 và celecoxib thể hiện hoạt tính vượt trội

được thống kê lại trong bảng 3.6. được tiếp tục thử nghiệm về hoạt tính ức chế sản sinh

PGE2 nhằm sàng lọc kỹ hơn về hoạt tính kháng viêm lẫn kháng ung thư của hoạt chất.

Bảng 3.6. Các chất lai có hoạt tính sinh học nổi trội gây độc tế bào MCF7

Ức chế sự phát triển

STT

Hợp chất

R

R’

R’’

(MCF7)

IC50 (µM)

3,4,5-triOMe

4.63± 0.59

1

102

4-NH2SO2

4-F

7.97±0.51

2

96

4-NH2SO2

4-CN

8.20± 0.93

4

81

9.67± 0.92

6

82

4-NO2

4-OH

8.90± 0.79

8

94

4-NH2SO2

4-Me

30.0±3.3

10

65

4-NH2SO2

0.36± 0.04

11 Ellipticine

3.3.2. Nghiên cứu cơ chế kháng viêm và kháng ung thư

3.3.2.1. Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2

Như đã được đề cập đến, trong quá trình viêm nhiễm, các tế bào miễn dịch đã

được kích hoạt và tiết ra một số chất trung gian gây viêm như cytokine tiền viêm, nitric

oxide (NO) và prostaglandin E2 (PGE2). Trong quá trình sàng lọc hoạt tính, các chất

lai và celecoxib đã được kiểm tra hoạt tính độc tế bào và khả năng ức chế sản sinh NO

trong đại thực bào chuột RAW264.7 được kích hoạt bởi LPS. Các hợp chất tiêu biểu là

102, 96, 81, 82, 94, celecoxib tiếp tục được thử nghiệm về khả năng ức chế sản sinh

PGE2. Kích thích LPS làm tăng đáng kể việc tạo ra PGE2 trong đại thực bào đến 329.6

pg / mL. Tuy nhiên, so với chỉ xử lý bằng LPS celecoxib ở nồng độ 4.2 và 100 µM ức

chế sự tiết PGE2 từ 278.64 đến 41.45 pg / mL trên các đại thực bào được kích thích

bằng LPS, tương ứng (P <0.01). Tất cả các hợp chất ức chế đáng kể sản sinh PGE2 và

trong số đó, chất 102 cho thấy sự ức chế mạnh nhất thể hiện lượng PGE2 sản sinh giảm

xuống 65.31 pg /mL ở 20 µM, mạnh hơn khoảng hai lần so với hoạt tính của celecoxib

ở cùng nồng độ (P <0.01). Hợp chất 82 cũng ức chế sản sinh PGE2 ở mức tương

đương của celecoxib làm giảm nồng độ xuống 155.07 pg / mL ở 20 µM (P <0.01). Các

hợp chất khác làm giảm đáng kể lượng PGE2 trong đại thực bào, nhưng yếu hơn 2 lần

hoạt tính của celecoxib ở cùng nồng độ. Hơn nữa, thử nghiệm MTT mà tại đó tác dụng

ức chế sản sinh PGE2 do độc tính tế bào không chọn lọc đã cho thấy không có độc tính

ở nồng độ tế bào thử nghiệm 2 × 10 5 / giếng (Bảng 3.7). Vì vậy, tất cả các hợp chất thử

nghiệm cho thấy tính chọn lọc trên các tế bào ung thư hơn các tế bào nành.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 trong các

đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS

PGE2 (pg/ml)

Nồng độ

102

96

81

82

94 Nồng độ (µM) Celecoxib (43)

(µM)

100

41.45

65.31

223.82 253.60

155.07

246.88

100

129.83

133.59 326.20 277.23

383.49

488.82

278.64

0.8

225.56 399.56 490.73

478.52

560.34

LPS

329.60

Hình 3.2. Đánh giá mức độ biểu hiện PGE2 của các hợp chất 102, 96, 81, 82, 94,

Celecoxib ở nồng độ 20 µM trên đại thực bào RAW-264,7 sau 48 giờ xử lý

3.3.2.2. Phân tích chu kỳ tế bào

Rối loạn chu kỳ tế bào là một trong những thay đổi thường xuyên nhất trong quá

trình phát triển khối u và hạn chế sự tiến triển rối loạn của chu kỳ tế bào được coi là

một chiến lược hiệu quả để loại bỏ tế bào ung thư. Do đó, các hợp chất tổng hợp có kết

quả sàng lọc hoạt tính tiêu biểu như 102, 96, 81, 82, 94 đã được phân tích tiến trình chu

kỳ tế bào đem so sánh với chất gốc celecoxib (Bảng 3.8 và Hình 3.3). Celecoxib thể

hiện gây ra sự gia tăng số lượng tế bào trong pha G0 /G1 do đó giảm sút số lượng tế

bào trong pha S và G2 / M so với các mẫu đối chứng [101] . Hợp chất 96, 81, 82 và 94

gây ra sự tăng số lượng tế bào trong pha G0 /G1 và giảm số lượng ở pha S và G2 / M

tương tự như celecoxib. Celecoxib và các hợp chất liên quan cũng được biết là có khả

năng ức chế sự phát triển của khối u và tạo ra quá trình apoptosis. Sự bắt giữ tế bào ở

pha G0 /G1 của celecoxib cũng được xác định là không có sự tham gia của COX2 cũng

như của PGE2 [114]. Mặt khác, hợp chất 102 tạo ra sự bắt giữ tế bào tại pha G2 /M

đồng thời giảm tế bào trong các pha S. Việc bắt giữ tế bào tại Pha G2 /M dẫn đến ngăn

cản tế bào thoát khỏi quá trình nguyên phân, tính năng này được thể hiện bởi các tác

nhân ức chế vi ống giống colchicin hoặc combretastatin [4]. Trong trường hợp hợp chất

102, thay thế liên kết đôi của CA4 với vòng pyrazol của celecoxib mà vẫn duy trì gốc

trimethoxybenzen của CA4 chỉ ra là rất quan trọng để thu được các tính năng gây độc

tế bào và kháng phân bào của chất gốc [108, 125].

Bảng 3.8. Phần trăm tế bào theo pha của các hợp chất được thử nghiệm với MCF7

Phần trăm tế bào theo phase (%)

STT

Hợp chất

% G0/G1 % S % G2/M

Đối chứng (-)

42.46

40.47

13.15

(DMSO 0,5%)

102 (10 µM)

40.72

35.09

21.04

96 (10 µM)

49.00

34.17

14.17

81 (10 µM)

45.22

34.46

17.45

82 (10 µM)

50.96

30.75

14.80

94 (10 µM)

49.55

34.50

14.34

Celecoxib (30 µM)

46.80

36.69

11.45

Đối chứng 102 96

81 82 94

Celecoxib (65)

Hình 3.3. Phân tích chu kỳ tế bào của các hợp chất được thử nghiệm bao gồm

102, 96, 81, 82, 94 tại nồng độ 10 µM và Celecoxib (65) tại nồng độ 30 µM trên MCF7

3.3.2.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hai chất 82 và 102

Vì hai hợp chất 102 và 82 là các chất ức chế hoạt động chống tăng sinh tiềm

năng, ức chế sản sinh PGE2 mạnh hơn celecoxib và ức chế chu kỳ tế bào một cách có

chọn lọc do vậy nó được chọn để đánh giá thêm khả năng gây apoptosis.

Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào

với Hoechst 33342

Thúc đẩy quá trình chết tế bào ung thư là một trong những dấu hiệu của hoạt

động chống khối u. Apoptosis là một quá trình chết đặc trưng bởi sự thay đổi hình thái

tế bào, sự ngưng tụ chất nhiễm sắc, sự phân cắt DNA và sự phân mảnh nhân. Các đặc

điểm hình thái điển hình này của tế bào apoptotic có thể được quan sát qua quá trình

nhuộm bằng Hoechst 33342 và được đọc kết quả nhờ kính hiển vi huỳnh quang [126].

Trong nghiên cứu này, tế bào ung thư vú được ủ với các hợp chất 82 và 102 tại nồng

độ 5 µM, 10 µM và 20 µM để xác định tính cảm ứng với apoptosis bằng phương pháp

nhuộm Hoechst 33342 và kết quả được trình bày trong Bảng 3.9 và Hình 3.4.

Tại các nồng độ nghiên cứu, mẫu 82 chưa thể hiện rõ có khả năng gây ra sự cô

đặc hoặc phân mảnh nhân tế bào với % tế bào có nhân cô đặc chỉ từ 2.42-5.33%. Tại

nồng độ 20 µM, mẫu 102 đã thể hiện khả năng gây ra sự cô đặc hoặc phân mảnh nhân

tế bào với % tế bào có nhân cô đặc đạt 12.38%. Mẫu đối chứng tham khảo

camptothecin ở nồng độ 5 µM đã thể hiện khả năng gây ra sự cô đặc hoặc phân mảnh

nhân tế bào với % tế bào có nhân cô đặc đạt 22.71%.(P <0.01).

Bảng 3.9. Phần trăm sự ngưng tụ hoặc phân mảnh của nhân tế bào do hợp chất 102 và

82 gây ra

Tế bào Apoptosis (%)

(-)

82

102 Camptothecin

Đối chứng

(20 µM)

(10 µM)

(5 µM)

(20 µM)

(10 µM)

(5 µM)

(5µM)

3.55±

5.33 ± 0.34

2.69± 0.22

2.42± 0.27

12.38± 0.96

5.18± 0.33

0.39

22.71± 2.01

2.71± 0.29

Các mẫu nghiên cứu thu được Hình ảnh tế bào MCF7 sau khi được nhuộm Hoechst

33342 ở các nồng độ khác nhau:

Đối chứng âm Camptothecin (5 µM)

102 (20 µM) 102 (10 µM)

82 (20 µM) 82 (10 µM)

Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 được nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của

các mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau

Nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3

Caspase-3, một thành viên của họ caspase, là cần thiết để xác thực khả năng gây

apoptotic bằng cách hoạt hóa protease chết, xúc tác sự phân cắt các protein tín hiệu cụ

thể, làm ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh DNA [127]. Khả năng kích hoạt

caspase-3 đã được đánh giá cho hợp chất 102 và 82 tại nồng độ 5, 10 và 20 µM (Bảng

3.10).

Bảng 3.10. Hoạt tính caspase - 3 của 102 và 82

% Tế bào Apoptosis

(-)

Hợp

102 102 (10

102

82 Camptothecin

Đối

chất

(20 µM)

µM)

(5 µM)

(20µM)

(10 µM)

(5 µM)

(5µM)

chứng

Giá trị

1.36*

1.21*

1.01

1.08

1.12

1.11

1.67**

1.00

Độ lệch

0.033

0.013

0.037

0.023

0.056

0.040

0.020

0.070

- * P<0.05 and ** P<0.01

Kết quả thu được chỉ ra rằng chỉ có chất 102 làm tăng đáng kể tế bào apoptotic so

với đối chứng âm ở cùng nồng độ, cụ thể tăng từ 1.21 và 1.36 lần tại nồng độ tương

ứng là 10 µM (P <0.05) và 20 µM (P <0.01). Điều này chỉ ra rằng chất 102 đã kích

hoạt con đường caspase để kích hoạt quá trình apoptosis của các tế bào MCF7 và sau

đó dẫn đến sự ức chế sự tăng sinh.

Nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phƣơng pháp trắc lƣu tế bào nhuộm

FITC-anexin V và PI

Trong các tế bào apoptotic sớm, sự bất đối xứng của vỡ màng dẫn đến những

thay đổi đáng kể trong các đặc tính sinh hóa của màng, chẳng hạn như sự phân phối lại

của phosphatidylserin (PS) từ bên trong ra bên ngoài của huyết tương màng. Sự hình

thành bên ngoài của các phân tử PS có thể được xác định thông qua khả năng gây

apoptosis bằng kit Anexin V [128]. Anexin V là một protein gắn với phospholipid phụ thuộc vào ion Ca++ có ái lực mạnh với PS, vì vậy Anexin V được gắn với chất hiện

mầu huỳnh quang FITC được sử dụng để xác định sự biểu hiện PS thông qua phương

pháp trắc lưu tế bào. Sự dịch chuyển của PS thường xảy ra trước khi màng tế bào bị

phá hủy trong quá trình chết của tế bào do apoptosis hoặc hoại tử. Vì vậy nhuộm

anexin V thường kết hợp với Propidium iodid (PI) để xác định apoptosis sớm và

muộn. Thông qua phương pháp này, những tế bào sống không nhuộm với bất kì loại

mầu nhuộm nào. Tế bào biểu hiện apoptosis sớm bắt màu với FITC-anexin V, tế bào

biểu hiện apoptosis muộn bắt mầu với cả FITC-anexin V và PI; tế bào chết do hoại tử

chỉ bắt mầu với thuốc nhuộm PI. Kết quả phân tích trắc lưu tế bào thể hiện ở Bảng 3.11

và Hình 3.6 cho thấy các hợp chất 82 và 102 tại nồng độ 5 µM, 10 µM và 20 µM thể

hiện ảnh hưởng đến tế bào apoptotic (cả sớm và muộn qua các giai đoạn) trong các

dòng tế bào ung thư vú MCF7, sau 24 giờ tiếp xúc. Dữ liệu chỉ ra rằng chỉ có hợp chất

102 cho kết quả làm tăng đáng kể tế bào apoptotic (P <0.05). Được ghi nhận qua sự

thống kê sự sống sót của tế bào khối u MCF7 đã giảm khi xử lý bằng hợp chất 102 so

với đối chứng âm, trong khi chất 102 tại nồng độ 20 µM làm tăng tốc độ tế bào

apoptosis sớm và muộn từ 18.32% đến 42.24% và từ 1.90% đến 6.73%. Những kết

quả này đã chứng minh khả năng của hợp chất 102 gây ra quá trình apoptosis, đặc biệt

là trong giai đoạn đầu apoptosis của tế bào MCF7.

Mẫu thí nghiệm

tế bào

tế

bào

tế

bào

tế bào

hoại tử

apoptosis sớm

apoptosis muộn

apoptosis

ĐC âm

0.22

18.32

1.90

20.22

Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào apoptosis

82 (20 µM)

1.39

18.49

4.08

22.57

82 (10 µM)

0.27

21.62

4.59

26.21

82 (5 µM)

0.16

22.74

3.27

26.01

102 (20 µM)

0.42

42.24

6.73

48.97*

102 (10 µM)

0.49

19.90

3.45

23.35

102 (5 µM)

0.27

15.84

2.17

18.01

73.83

4.96

Camptothecin (5µM)

0.08

78.79**

Ghi chú: * là P<0.05; ** là P<0.01

Tế bào ủ với mẫu 82 (20 Tế bào ủ với mẫu 82 (10 Tế bào ủ với mẫu 82 (5

µg/ml) trong 48h µg/ml) trong 48h µg/ml) trong 48h

Tế bào ủ với mẫu 102 (20 Tế bào ủ với mẫu 102 (10 Tế bào ủ với mẫu 102 (5

µg/ml) trong 48h µg/ml) trong 48h µg/ml) trong 48h

Tế bào ủ với 0.5% DMSO Tế bào ủ với 5 µM

trong 48h Camptothecin trong 48h

Hình 3.5. Tác động của mẫu nghiên cứu đến quá trình apoptosis tế bào thông

qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Các mẫu thử được phân

tích bằng hệ thống trắc lưu tế bào. Trục x thể hiện mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin

V, trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log.

Phần kết luận xác định khả năng cảm ứng apoptosis của 2 mẫu nghiên cứu

Qua việc xác định cảm ứng apoptosis qua ba phương pháp phát hiện apoptosis của

hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, caspase - 3 và Flow cytometry có

thể tổng kết:

 Mẫu 82 ở các nồng độ thử nghiệm làm tăng nhẹ tỉ lệ tế bào ở giai đoạn

apoptosis sớm và apoptosis muộn so với đối chứng âm, đạt từ 22.57- 26.21%.

 Mẫu 102, ở nồng độ 20 µg/ml làm tăng cao tỉ lệ tế bào ở giai đoạn apoptosis

sớm và muộn so với đối chứng âm từ 18.3% đến 42.2% và 1.90% đến 6.7%,

một cách tương ứng. Ở nồng độ thấp hơn làm tăng nhẹ (10 µg/ml và 5µg/ml) tỉ

lệ tế bào apoptosis so với đối chứng âm.

 Camptothecin - đối chứng dương tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, đạt từ 78.79%.

 Mẫu 82 chưa thể hiện rõ khả năng cảm ứng apoptosis với các nồng độ nghiên

cứu trong các thử nghiệm được thực hiện;

 Mẫu 102 ở nồng độ 10 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào MCF7

thông qua cảm ứng sinh caspase 3 với hàm lượng tăng 1.21 lần so với đối chứng

âm (P<0.05);

 Mẫu 102 ở nồng độ 20 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào MCF7

thông qua: gây ra sự cô đặc hoặc phân mảnh nhân tế bào với tỉ lệ 12.386%; cảm

ứng sinh caspase -3 với hàm lượng tăng 1.36 lần so với đối chứng âm (P<0.01);

quần thể tế bào apoptosis tăng và đặc biệt là quần thể apoptosis sớm tăng

42.24% thông qua kĩ thuật trắc lưu tế bào (P<0.05)

Qua đó, dựa trên kết quả thử hoạt tính độc tế bào, kháng viêm NO, PGE2 và cảm

ứng apoptosis đã khẳng định được cơ chế và đặc điểm về hoạt tính của các hợp chất lai

thu được. Kết quả chỉ ra phân tử lai cả về mặt cấu trúc phân tử lẫn hoạt tính sinh học

theo mô hình mục tiêu thiết kế của phân tử lai ban đầu. Chúng tôi đã tiếp tục lựa chọn

phân tích docking phân tử để mô phỏng tương tác giữa chất lai thiết kế với các mục

tiêu COX2 và tubulin.

3.4. Nghiên cứu docking phân tử

Do các hoạt động ức chế tiềm năng trong quá trình tăng sinh tế bào, tiến trình

của chu kỳ tế bào và sản sinh PGE2. Các hợp chất 102 và 82 được chọn để đánh giá về

khả năng tương tác của chúng với COX2 và tubulin trên mô hình docking phân tử. Các

kết quả gắn kết có thể làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của các hợp chất được nghiên cứu

liên quan đến hoạt tính sinh học in vitro. Bước đầu tiên, chúng tôi đã docking ba hợp

chất celecoxib, colchicine và combretastatin A4 lên COX2 và tubulin, sử dụng phần

mềm AutoDock 4.2.6. Việc mô phỏng được tiến hành trên các cấu trúc tinh thể khác

nhau của cả hai mục tiêu để tìm tương quan và nghiên cứu cảm ứng của chất trên các

mục tiêu này.

Bảng 3.12. Lựa chọn cấu trúc COX2 và tubulin tương ứng sử dụng cho chương trình

docking

Giá trị (Kcal/mol)

Hợp chất

COX2

Tubulin

∆G (1)-(4)

1CX2 (2)

3E22 (6)

- 11.45

3LN1 (1) -11.90

6BL3 (3) -11.40

1Z2B (4) - 8.06

3DU7 (5) - 7.92

-8.98

-3.84

102

-11.92

- 10.48

-11.78

- 9.37

-8.96

-8.70

-2.55

82

-6.71

-1.88

-9.63

- 7.83

-7.76

- 7.75

- 6.30

CA4

-7.18

-8.06

-7.85

Colchicin

-11.50

-10.90

-11.03

Celecoxib

Bảng 3.12 trình bày các giá trị năng lượng gắn kết của mỗi hợp chất với COX2

và mô hình tubulin. Trong tất cả các mô hình được docking, chỉ số liên kết của

celecoxib với 3LN1 cho thấy khả năng hoạt tính gắn kết cao đối với mô hình này; do

đó, nó đã được chọn cho phân tích sâu hơn. Đối với tubulin, mô hình 1Z2B đã được sử

dụng với cùng một lý do. Giá trị ngưỡng của năng lượng docking (khả năng gắn kết)

cần được xác định và các phối tử tham chiếu được chọn cho quá trình này; do đó, các

hợp chất có năng lượng gần với cả hai – 11.50 kcal /mol (COX2) và – 8.06 kcal /mol

(tubulin) có thể được coi là như chất ức chế tiềm năng đối với hai mục tiêu protein này.

Hợp chất 102 liên kết với mục tiêu COX2 với điểm docking – 11.90 kcal /mol cao hơn

một chút so với cả celecoxib (- 11.50 kcal /mol) và combretastatin A-4 (- 9.63 kcal /

mol) (Bảng 3.13). Phân tích định hướng liên kết cho thấy Val335, Leu345, Val509,

Ala513 và Leu517 có tương tác alkyl và Pi-alkyl; tương tác hydro cacbon được quan

sát đối với Gly512 và Ser516; hai liên kết Pi – sigma với Ser339 và Tyr371; sự tương

tác là ổn định hơn nữa thông qua sự hình thành liên kết hydro với Gln178, Leu338,

Phe504 (Hình 3.6, Hinhh 3.7). Những tương tác chính này phù hợp với các nghiên cứu

trước đây [129-130]. Đối với thử nghiệm docking trên tubulin, hợp chất 102 có giá trị

là – 8.06 kcal /mol, tương đương với colchicine và cao hơn so với combretastatin A-4

(- 7.75 kcal /mol). Phân tích docking của hợp chất 102 với tubulin chỉ ra rằng Asn101,

Ala250, Asn258, Met259, Lys352 là chìa khóa khẳng định sự hình thành liên kết hydro

và liên kết cộng hóa trị đã được thấy trong Val238, Cys241 (Halogen); Leu248,

Leu255 và Ala316 (Loại liên kết pi-alkyl); Lys254 và Val351 (liên kết hydro cacbon)

(Hình 3.7)

Hợp chất 82 được quan sát thấy có giá trị năng lượng liên kết đáng kể với COX2

(- 11.92 kcal / mol), cao hơn celecoxib (- 11.50 kcal mol). Nó hình thành liên kết

tương tự với Phe504 so với hợp chất 102 gợi ý tương tác này có thể là nguyên nhân của

sự gia tăng hoạt tính. Liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl của 82 với nhóm amin của

Arg106 kết hợp với tương tác không cộng hóa trị với các gốc quan trọng Val335,

Leu338, Val509, Ala513, Leu517 (loại liên kết Pi-alkyl) và Ser339, Arg499 (liên kết

hydro cacbon) cũng góp phần vào tăng cường sự tương tác giữa phối tử và protein mục

tiêu (Hình 3.7). Phân tích tương quan hợp chất 82 và vị trí liên kết colchicine trong

protein tubulin thể hiện giá trị docking - 9.37 kcal / mol, cao hơn của colchicine và

combretastatin A-4. Liên kết cộng hóa trị không quan sát thấy với hợp chất 82 bao gồm

Leu242, Leu248, Lys254, Leu255, Ala316, Val318, Lys352, Ala354 (Loại liên kết pi-

alkyl); Cys241 (loại liên kết Pi- S); Thr239 (liên kết hydro cacbon) và liên kết được ổn

định hơn nữa bằng một liên kết hydro với Ala250 là cùng năng lượng tương tác như

hợp chất 102. Theo tiêu chí xếp hạng của AutoDock 4.2.6, giá trị càng âm của năng

lượng thì khả năng liên kết của hợp chất với thụ thể nhắm mục tiêu càng tốt. Hợp chất

102 và 82 được chứng minh là hai ứng cử viên tiềm năng với năng lượng kết nối tốt

cho cả hai mục tiêu và có thể được coi là chất ức chế kép COX2 / tubulin tiềm năng,

các tương tác của chúng được phân tích thêm bằng cách sử dụng mô hình Studio

Visualizer. Tính toán thu được kết quả có thể được sử dụng để dự đoán chất ức chế tốt

hơn cho mô hình protein dựa trên độ lệch (Δ) giữa giá trị tương tác của COX2 và

tubulin (Phương trình 1–2).

Đặc biệt, tất cả các hợp chất có giá trị liên kết gắn với COX2 âm hơn là liên kết

với tubulin (Bảng 3.14). Phối tử cho thấy tỷ lệ gắn kết năng lượng và tổng số nguyên tử

(không kể nguyên tử hiđro) [130]. Điều này có thể được gây ra do sự khác biệt về cấu

trúc giữa vị trí liên kết của hai protein và do đó gợi ý rằng các hợp chất được thiết kế

này có lợi cho liên kết với COX2 nhiều hơn tubulin. Docking của hợp chất 102 với

COX2 cho thấy ba tương tác liên kết hydro giữa nhóm sulfonamid (NH2) và Gln178,

Leu338, Phe504 (khoảng cách = 2.71; 2.93; 3.33 Å, tương ứng), trong khi vị trí liên kết

của tubulin chỉ ra rằng nhóm này tạo ra ba liên kết hydro với Asn258, Met259, Lys352

(khoảng cách = 2.91; 3.20; Tương ứng là 2.86 Å). Ngoài ra, sự tương tác giữa hợp chất

102 và tubulin được tăng cường hơn nữa thông qua hai liên kết hydro do

trimethoxybenzen với Asn101, Ala250. Phân tích liên kết của hợp chất 82 cũng chỉ ra

các liên kết hydro được hình thành bởi nhóm etyl este (CO2C2H5) với Arg106 của

COX2 và Ala250 của tubulin (khoảng cách = 2.99; 3.18 Å, tương ứng); đặc biệt là NO2

của 82 đã liên kết với Phe504 của COX2. Liên kết này hỗ trợ giả định rằng nhóm

sulfonamit và etyl este đóng vai trò quan trọng đối với hoạt động kép của các hợp chất

102 và 82. Mặt khác, trimethoxybenzen và các nhóm thế aryl được giả định là đặc

trưng cho đặc điểm liên kết của mỗi hợp chất với mục tiêu protein.

Bảng 3.13. Tập hợp các hợp chất được thiết kế với điểm kết nối tương ứng trên hai mô

hình protein (kcal/mol)

Năng lƣợng (kcal/mol)

Hợp chất

Tubulin (1Z2B)

COX2 (3LN1)

-8.06

-11.90

102

-9.37

-11.92

82

-7.75

-9.63

Combretastatin A-4

-8.06

Colchicin

-11.50

Celecoxib

(A) (B)

Hình 3.6. Các dạng liên kết hydro của các hợp chất với protein COX2 (PDB ID: 3LN1)

và tubulin (PDB ID: 1Z2B). (A) chất 102 với COX2; (B) Chất lượng 102 với tubulin;

(A) (B)

(D)

(C)

Hình 3.7. Vị trí gắn kết 2D của các hợp chất được thiết kế với protein COX2

PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B). (A) hợp chất 102 với COX2; (B) hợp chất

102 với tubulin; (C) hợp chất 82 với COX2; (D) hợp chất 82 với tubulin

Docking 82 –COX2 Docking 82 – tubulin

Docking 102 – COX2 Docking 102 -tubulin

82 –COX2 82 – tubulin

102 -tubulin 102- COX2

Hinh 3.8. Hình ảnh stereo các mẫu chất

Bảng 3.14. Tương tác bộ hợp chất, phối tử trên COX2 (ID: 3LN1) và mô hình protein

Năng lượng liên kết (LE)

Hợp chất thiết kế

COX2

Tubulin

ΔLE

- 0.38

- 0.26

-0.12

tubulin (ID: 1Z2B)

102

- 0.38

- 0.30

-0.08

82

Combretatin A4

- 0.42

- 0.34

-0.08

- 0.28

Colchicin

- 0.44

Celecoxib

3.5. Thảo luận

Sản phẩm thu được là các dẫn xuất pyrazol được thay thế bằng aryl mới được

tổng hợp cấu trúc giống với cis-diphenylethylen. Qua nghiên cứu hoạt tính sinh học và

cơ chế kháng viêm cùng kháng ung thư cho thấy, trong các chất thu được có 2 chất, là

các chất 82 và 102 thể hiện hoạt tính chống tăng sinh cũng như chống viêm mạnh. Hai

chất lai này đều có tác dụng ức chế đồng thời sản xuất prostaglandin E2 (PGE2) trong

các tế bào RAW 264,7 của đại thực bào được kích hoạt LPS và sự tiến triển chu kỳ tế

bào bị ức chế của các tế bào MCF7 ở các pha G2 /M hoặc G0 /G1. Riêng chất 102 có

hoạt tính gây apoptosis thông qua hoạt hóa caspase-3. Hơn nữa, qua mô hình docking

phân tử cho thấy, cả hai chất cho thấy năng lượng gắn kết tốt với cả mục tiêu protein

COX-2 và tubulin trong tương tác phân tử mẫu. Qua đó, có thể đưa ra một số điểm lưu

ý về cấu trúc và hoạt tính của phân tử lai như sau: Cấu hình cis-diphenylethylene của

celecoxib hoặc combretastatin A-4 cũng như các nhóm chức năng như ethyl nhóm este

và sulfonamit, CF3 có thể được coi là đặc điểm tiềm năng cho hoạt tính kép của các

hợp chất đã nghiên cứu và đối với sự có mặt của nhóm trimethoxybenzene vẫn là đặc

điểm quan trọng để làm tăng hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất lai mới. Sản

phẩm 2 chất lai 82 và 102 thể hiện những hoạt tính kháng viêm và kháng ung thư lý

thú, nên được nghiên cứu và bổ sung thêm những dẫn chất có cấu hình tương tự. Tuy

nhiên, do khối lượng công việc cũng như thời gian hạn chế trong khuôn khổ của luận

án, do vậy nhóm nghiên cứu vẫn chưa tiến hành tổng hợp cũng như phát triển thêm

được nhiều các dẫn chất mới xoay quanh cấu trúc thể hiện mạnh hoạt tính sinh học

này.

KẾT LUẬN

Luận án đã đạt đƣợc những kết quả chính nhƣ sau:

1. Đã thiết kế và tiến hành tổng hợp thành công 41 hợp chất lai mới. Trong đó có 20

chất lai coxib - combretastatin dạng este, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin dạng

axit, 01 hợp chất lai coxib – combretastatin chứa nhóm CF3 2. Đã đánh giá hoạt tính sinh học 22 chất trên các dòng tế bào ung thư ở người HT-

29, Hep-G2, MCF-7 và ức chế sản sinh NO. Trong đó có 12 chất 102, 96, 81, 82, 94,

93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hiện hoạt tính nổi trội so với chất gốc celecoxib, 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 có hoạt tính IC50 < 10 µM 3. Đã đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO và ung thư vú MCF-7 đối với các chất lai

coxib – combretastatin dạng gốc axit và tiến hành so sánh hoạt tính với các chất lai

coxib – combretastatin dạng gốc este. Tuy nhiên, kết quả cho thấy chỉ có 02 chất 118

và 114 thể hiện độc tính tế bào trên các dòng MCF-7 mạnh hơn celecoxib và 02 chất

116 và 111 là tương đương với hoạt tính ức chế sản sinh NO của celecoxib.

4. Đã đánh giá hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 và

celecoxib thông qua xác định khả năng ức chế sản sinh PEG2, phân tích chu kỳ tế bào

và hoạt tính gây apotosis thông qua xác định khả năng gây apotosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, bằng chỉ thị caspase ‑ 3 và trắc lưu tế bào.

5. Đã thu được 2 chất tiêu biểu là 82 và 102 là những phân tử đa đích sinh học, có hoạt

tính nổi trội về hoạt tính kháng ung thư so với combretastatin và kháng viêm so với

celecoxib,

6. Trên mô hình docking phân tử, đã khảng định hai chất 82 và 102 thể hiện hoạt tính

kép với hai đích tác dụng tubulin và COX2 theo đúng mục tiêu thiết kế của luận án.

7. Các chất thu được đã được chứng minh là không độc với tế bào thường trên mô hình

in vitro.

Kiến nghị:. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm

của các hợp chất lai thu được và thử nghiệm lâm sàng để đưa ra các loại thuốc chống

ung thư mới.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Đã tổng hợp thành công 41 phân tử lai đa đích sinh học coxib – combretatastatin

theo đúng mục tiêu thiết kế ban đầu.

2. Đã sàng lọc hoạt tính kháng viêm NO và kháng ung thư HepG2, HT-29, MCF7

của lớp chất lai mới.

3. Đã chứng minh cơ chế hoạt tính sinh học của các hợp chất lai với các mô hình

in vitro

4. Đã khẳng định về mặt hoạt tính và phân tích tương tác sinh học với các đích tác

dụng là tubulin và COX2 trên mô hình docking phân tử

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Thuy Hang Nguyen Thi, Yen Tran Thi, Le Anh Nguyen, Ngoc Binh Vo, Quoc Anh

Ngo. “Design, Synthesis and Biological Activities of New Pyrazole Derivatives

Possessing Both Coxib and Combretastatins Pharmacophores”. Chem. Biodiversity,

2019.

2. Quoc Anh Ngo, Thuy Hang Nguyen Thi, Minh Quan Pham, Domenico Delfno, Thi

Thao Do. “Antiproliferative and antiinfammatory coxib–combretastatin hybrids

suppress cell cycle progression and induce apoptosis of MCF7 breast cancer cells”

Molecular Diversity, 2020.

3. Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Lê Anh, Trần Thị Yến, Võ Ngọc Bình, Vũ Đình

Hoàng, Ngô Quốc Anh. “Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất lai ghép giữa

combretastatin và celecoxib”. Tạp chí hóa học, 2017, 55(4E23), 235-239.

4. Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Lê Anh, Trần Thị Yến, Võ Ngọc Bình, Đỗ Trung

Sỹ, Vũ Đình Hoàng, Ngô Quốc Anh. “Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất lai ghép mới

mô phỏng cấu trúc combretastatin”. Tạp chí hóa học, 2017, 55(5e34) 349-353.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bode, A. M.; Dong, Z., Cancer prevention research—then and now. Nature

Reviews Cancer, 2009, 9, (7), 508-516.

2. Zhan, P.; Liu, X., Designed multiple ligands: an emerging anti-HIV drug

discovery paradigm. Current pharmaceutical design, 2009, 15, (16), 1893-1917.

3. Gediya, L. K.; Njar, V. C., Promise and challenges in drug discovery and

development of hybrid anticancer drugs. Expert opinion on drug discovery, 2009, 4,

(11), 1099-1111.

4. Dai, Z.-J.; Ma, X.-B.; Kang, H.-F.; Gao, J.; Min, W.-L.; Guan, H.-T.; Diao, Y.;

Lu, W.-F.; Wang, X.-J., Antitumor activity of the selective cyclooxygenase-2 inhibitor,

celecoxib, on breast cancer in vitro and in vivo. Cancer cell international, 2012, 12,

(1), 1-8.

5. Grösch, S.; Tegeder, I.; Niederberger, E.; Bräutigam, L.; Geisslinger, G., COX‐2

independent induction of cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells by the

selective COX‐2 inhibitor celecoxib. The FASEB journal, 2001, 15, (14), 1-22.

6. Viegas-Junior, C.; Danuello, A.; da Silva Bolzani, V.; Barreiro, E. J.; Fraga, C.

A. M., Molecular hybridization: a useful tool in the design of new drug prototypes.

Current medicinal chemistry, 2007, 14, (17), 1829-1852.

7. Morphy, R.; Kay, C.; Rankovic, Z., From magic bullets to designed multiple

ligands. Drug discovery today, 2004, 9, (15), 641-651.

8. Hulsman, N.; Medema, J. P.; Bos, C.; Jongejan, A.; Leurs, R.; Smit, M. J.; de

Esch, I. J.; Richel, D.; Wijtmans, M., Chemical insights in the concept of hybrid drugs:

the antitumor effect of nitric oxide-donating aspirin involves a quinone methide but not

nitric oxide nor aspirin. Journal of medicinal chemistry, 2007, 50, (10), 2424-2431.

9. Lane, M. E.; Yu, B.; Rice, A.; Lipson, K. E.; Liang, C.; Sun, L.; Tang, C.;

McMahon, G.; Pestell, R. G.; Wadler, S., A novel cdk2-selective inhibitor, SU9516,

induces apoptosis in colon carcinoma cells. Cancer research, 2001, 61, (16), 6170-

6177.

100

10. Ma, J.; Li, S.; Reed, K.; Guo, P.; Gallo, J. M., Pharmacodynamic-mediated

effects of the angiogenesis inhibitor SU5416 on the tumor disposition of temozolomide

in subcutaneous and intracerebral glioma xenograft models. Journal of Pharmacology

and Experimental Therapeutics, 2003, 305, (3), 833-839.

11. Sabet, R.; Mohammadpour, M.; Sadeghi, A.; Fassihi, A., QSAR study of isatin

analogues as in vitro anti-cancer agents. European journal of medicinal chemistry,

2010, 45, (3), 1113-1118.

12. Singh, P.; Sharma, P.; Anand, A.; Bedi, P.; Kaur, T.; Saxena, A.; Kumar, V.,

Azide-alkyne cycloaddition en route to novel 1H-1, 2, 3-triazole tethered isatin

conjugates with in vitro cytotoxic evaluation. European journal of medicinal chemistry,

2012, 55, 455-461.

13. Guibourt, N. J. B. G., Histoire abrégée des drogues simples. Société

encyclographique des sciences médicales: 1839; Vol. 2.

14. Piazzi, L.; Cavalli, A.; Colizzi, F.; Belluti, F.; Bartolini, M.; Mancini, F.;

Recanatini, M.; Andrisano, V.; Rampa, A., Multi-target-directed coumarin derivatives:

hAChE and BACE1 inhibitors as potential anti-Alzheimer compounds. Bioorganic &

medicinal chemistry letters, 2008, 18, (1), 423-426.

15. Amin, K. M.; Eissa, A. A.; Abou-Seri, S. M.; Awadallah, F. M.; Hassan, G. S.,

Synthesis and biological evaluation of novel coumarin–pyrazoline hybrids endowed

with phenylsulfonyl moiety as antitumor agents. European Journal of Medicinal

Chemistry, 2013, 60, 187-198.

16. Belluti, F.; Fontana, G.; Dal Bo, L.; Carenini, N.; Giommarelli, C.; Zunino, F.,

Design, synthesis and anticancer activities of stilbene-coumarin hybrid compounds:

Identification of novel proapoptotic agents. Bioorganic & medicinal chemistry, 2010,

18, (10), 3543-3550.

17. Singh, K. Phytochemical determination and antibacterial activity of

Trichosanthes dioica Roxb (Patal), Cucurbita Maxima (pumpkin) and Abelmoschus

esculentus Moench (Okra) plant seeds. 2012.

101

18. Gupta, A.; Saha, P.; Descôteaux, C.; Leblanc, V.; Asselin, É.; Bérubé, G.,

Design, synthesis and biological evaluation of estradiol–chlorambucil hybrids as

anticancer agents. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2010, 20, (5), 1614-1618.

19. Kuduk, S. D.; Zheng, F. F.; Sepp-Lorenzino, L.; Rosen, N.; Danishefsky, S. J.,

Synthesis and evaluation of geldanamycin-estradiol hybrids. Bioorganic & medicinal

chemistry letters, 1999, 9, (9), 1233-1238.

20. Kuduk, S. D.; Harris, C. R.; Zheng, F. F.; Sepp-Lorenzino, L.; Ouerfelli, Q.;

Rosen, N.; Danishefsky, S. J., Synthesis and evaluation of geldanamycin–testosterone

hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2000, 10, (11), 1303-1306.

21. Kumar, R.; Lown, J., Recent developments in novel pyrrolo [2, 1-c][1, 4]

benzodiazepine conjugates: synthesis and biological evaluation. Mini reviews in

medicinal chemistry, 2003, 3, (4), 323-339.

22. Bose, D. S.; Idrees, M.; Todewale, I. K.; Jakka, N.; Rao, J. V., Hybrids of

privileged structures benzothiazoles and pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepin-5-one,

and diversity-oriented synthesis of benzothiazoles. European journal of medicinal

chemistry, 2012, 50, 27-38.

23. Kamal, A.; Srikanth, Y.; Ramaiah, M. J.; Khan, M. N. A.; Reddy, M. K.;

Ashraf, M.; Lavanya, A.; Pushpavalli, S.; Pal-Bhadra, M., Synthesis, anticancer

activity and apoptosis inducing ability of bisindole linked pyrrolo [2, 1-c][1, 4]

benzodiazepine conjugates. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012, 22, (1),

571-578.

24. Kim, M.-Y.; Na, Y.; Vankayalapati, H.; Gleason-Guzman, M.; Hurley, L. H.,

Design, synthesis, and evaluation of psorospermin/quinobenzoxazine hybrids as

structurally novel antitumor agents. Journal of medicinal chemistry, 2003, 46, (14),

2958-2972.

25. Nepali, K.; Sharma, S.; Kumar, D.; Budhiraja, A.; L Dhar, K., Anticancer

hybrids-a patent survey. Recent patents on anti-cancer drug discovery, 2014, 9, (3),

303-339.

26. Yang, X.-D.; Wan, W.-C.; Deng, X.-Y.; Li, Y.; Yang, L.-J.; Li, L.; Zhang, H.-

B., Design, synthesis and cytotoxic activities of novel hybrid compounds between 2-

102

phenylbenzofuran and imidazole. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012, 22,

(8), 2726-2729.

27. Jordan, M. A.; Wilson, L., Microtubules as a target for anticancer drugs.

Nature Reviews Cancer, 2004, 4, (4), 253-265.

28. Ducki, S.; Mackenzie, G.; Greedy, B.; Armitage, S.; Chabert, J. F. D.; Bennett,

E.; Nettles, J.; Snyder, J. P.; Lawrence, N. J., Combretastatin-like chalcones as

inhibitors of microtubule polymerisation. Part 2: Structure-based discovery of alpha-

aryl chalcones. Bioorganic & medicinal chemistry, 2009, 17, (22), 7711-7722.

29. Downing, K. H., Structural basis for the interaction of tubulin with proteins and

drugs that affect microtubule dynamics. Annual review of cell and developmental

biology, 2000, 16, (1), 89-111.

30. Kaur, R.; Kaur, G.; Gill, R. K.; Soni, R.; Bariwal, J., Recent developments in

tubulin polymerization inhibitors: An overview. European journal of medicinal

chemistry, 2014, 87, 89-124.

31. Airy Shaw, H., A dictionary of the flowering plants and ferns. Cambridge: CUP,

1973.

32. Watt, J. M.; Breyer-brandwijk, M. G., The Medicinal and Poisonous Plants of

Southern and Eastern Africa being an Account of their Medicinal and other Uses,

Chemical Composition, Pharmacological Effects and Toxicology in Man and Animal.

E. & S. Livingstone Ltd.: 16-17, Teviot Place, Edinburgh, 1962; p xii + 1457 pp.

33. Hartwell, J., Plants used against cancer (A survey) Quarterman Publications.

Inc. Lawrence, Massachu setts, 1982, 408.

34. Cushman, M.; Nagarathnam, D.; Gopal, D.; Chakraborti, A. K.; Lin, C. M.;

Hamel, E., Synthesis and evaluation of stilbene and dihydrostilbene derivatives as

potential anticancer agents that inhibit tubulin polymerization. Journal of medicinal

chemistry, 1991, 34, (8), 2579-2588.

35. Sackett, D. L., Podophyllotoxin, steganacin and combretastatin: natural

products that bind at the colchicine site of tubulin. Pharmacology & therapeutics, 1993,

59, (2), 163-228.

103

36.

Tozer, G. M.; Kanthou, C.; Parkins, C. S.; Hill, S. A., The biology of the

combretastatins as tumour vascular targeting agents. International journal of

experimental pathology, 2002, 83, (1), 21-38.

37. Parihar, S.; Kumar, A.; Chaturvedi, A. K.; Sachan, N. K.; Luqman, S.;

Changkija, B.; Manohar, M.; Prakash, O.; Chanda, D.; Khan, F., Synthesis of

combretastatin A4 analogues on steroidal framework and their anti-breast cancer

activity. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 2013, 137, 332-

344.

38. Shen, L.; Yang, X.; Yang, B.; He, Q.; Hu, Y., Novel hybrids from lamellarin D

and combretastatin A 4 as cytotoxic agents. European journal of medicinal chemistry,

2010, 45, (1), 11-18.

39. Kamal, A.; Mallareddy, A.; Ramaiah, M. J.; Pushpavalli, S.; Suresh, P.; Kishor,

C.; Murty, J.; Rao, N. S.; Ghosh, S.; Addlagatta, A., Synthesis and biological

evaluation of combretastatin-amidobenzothiazole conjugates as potential anticancer

agents. European journal of medicinal chemistry, 2012, 56, 166-178.

40. Rasolofonjatovo, E.; Provot, O.; Hamze, A.; Bignon, J.; Thoret, S.; Brion, J.-D.;

Alami, M., Regioselective hydrostannation of diarylalkynes directed by a labile ortho

bromine atom: An easy access to stereodefined triarylolefins, hybrids of combretastatin

A-4 and isocombretastatin A-4. European journal of medicinal chemistry, 2010, 45,

(9), 3617-3626.

41. Nam, N.-H., Combretastatin A-4 analogues as antimitotic antitumor agents.

Current medicinal chemistry, 2003, 10, (17), 1697-1722.

42. Levy, M.; Spino, M.; Read, S. E., Colchicine: a state‐of‐the‐art review.

Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, 1991, 11,

(3), 196-211.

43. Bourdron, J.; Commeiras, L.; Barbier, P.; Bourgarel-Rey, V.; Pasquier, E.;

Vanthuyne, N.; Hubaud, J.-C.; Peyrot, V.; Parrain, J.-L., Caulerpenyne–colchicine

hybrid: Synthesis and biological evaluation. Bioorganic & medicinal chemistry, 2006,

14, (16), 5540-5548.

104

44. Malysheva, Y. B.; Combes, S.; Allegro, D.; Peyrot, V.; Knochel, P.;

Gavryushin, A. E.; Fedorov, A. Y., Synthesis and biological evaluation of novel

anticancer bivalent colchicine–tubulizine hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry,

2012, 20, (14), 4271-4278.

45. Zefirova, O. N.; Nurieva, E. V.; Shishov, D. V.; Baskin, I. I.; Fuchs, F.;

Lemcke, H.; Schröder, F.; Weiss, D. G.; Zefirov, N. S.; Kuznetsov, S. A., Synthesis

and SAR requirements of adamantane–colchicine conjugates with both microtubule

depolymerizing and tubulin clustering activities. Bioorganic & medicinal chemistry,

2011, 19, (18), 5529-5538.

46. Li, W.; Li, M.-f.; Yang, D.; Xu, R.; Zhang, Y.-r., Production of podophyllotaxin

by root culture of Podophyllum hexandrum Royle. Electron J Biol, 2009, 5, (2), 34-9.

47. Hartwell, J.; Schrecker, A., The chemistry of Podophyllum. In Fortschritte der

Chemie organischer Naturstoffe/Progress in the Chemistry of Organic Natural

Products/Progrès dans la Chimie des Substances Organiques Naturelles, Springer:

1958; pp 83-166.

48. Damayanthi, Y.; Lown, J. W., Podophyllotoxins: current status and recent

developments. Current medicinal chemistry, 1998, 5, 205-252.

49. Kamal, A.; Laxman, E.; Khanna, G. R.; Reddy, P.; Rehana, T.; Arifuddin, M.;

Neelima, K.; Kondapi, A. K.; Dastidar, S. G., Design, synthesis, biological evaluation

and QSAR studies of novel bisepipodophyllotoxins as cytotoxic agents. Bioorganic &

medicinal chemistry, 2004, 12, (15), 4197-4209.

50. Kamal, A.; Suresh, P.; Ramaiah, M. J.; Mallareddy, A.; Kumar, B. A.; Raju, P.;

Gopal, J. V.; Pushpavalli, S.; Lavanya, A.; Sarma, P., Synthesis and biological

evaluation of 4β-acrylamidopodophyllotoxin congeners as DNA damaging agents.

Bioorganic & medicinal chemistry, 2011, 19, (15), 4589-4600.

51. Sapra, S.; Bhalla, Y.; Sharma, S.; Singh, G.; Nepali, K.; Budhiraja, A.; Dhar, K.

L., Colchicine and its various physicochemical and biological aspects. Medicinal

Chemistry Research, 2013, 22, (2), 531-547.

105

52. Kamal, A.; Ramakrishna, G.; Raju, P.; Viswanath, A.; Ramaiah, M. J.;

Balakishan, G.; Pal-Bhadra, M., Synthesis and anti-cancer activity of chalcone linked

imidazolones. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2010, 20, (16), 4865-4869.

53. Nagaraju, M.; Deepthi, E. G.; Ashwini, C.; Vishnuvardhan, M.; Nayak, V. L.;

Chandra, R.; Ramakrishna, S.; Gawali, B., Synthesis and selective cytotoxic activity of

novel hybrid chalcones against prostate cancer cells. Bioorganic & medicinal

chemistry letters, 2012, 22, (13), 4314-4317.

54. Overmeyer, J. H.; Young, A. M.; Bhanot, H.; Maltese, W. A., A chalcone-

related small molecule that induces methuosis, a novel form of non-apoptotic cell

death, in glioblastoma cells. Molecular Cancer, 2011, 10, (1), 69.

55. Nepali, K.; Ojha, R.; Sharma, S.; MS Bedi, P.; L Dhar, K., Tubulin inhibitors: a

patent survey. Recent patents on anti-cancer drug discovery, 2014, 9, (2), 176-220.

56. Wittman, M. D.; Kadow, J. F.; Vyas, D. M.; Lee, F. L.; Rose, W. C.; Long, B.

H.; Fairchild, C.; Johnston, K., Synthesis and antitumor activity of novel paclitaxel–

chlorambucil hybrids. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2001, 11, (6), 811-

814.

57. Smith, A. B.; Sugasawa, K.; Atasoylu, O.; Yang, C.-P. H.; Horwitz, S. B.,

Design and Synthesis of (+)-Discodermolide–Paclitaxel Hybrids Leading to Enhanced

Biological Activity. Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 54, (18), 6319-6327.

58. Smith III, A. B.; Sugasawa, K.; Atasoylu, O.; Yang, C.-P. H.; Horwitz, S. B.,

Design and synthesis of (+)-discodermolide–paclitaxel hybrids leading to enhanced

biological activity. Journal of medicinal chemistry, 2011, 54, (18), 6319-6327.

59. Huang, G. S.; Lopez-Barcons, L.; Freeze, B. S.; Smith, A. B.; Goldberg, G. L.;

Horwitz, S. B.; McDaid, H. M., Potentiation of taxol efficacy by discodermolide in

ovarian carcinoma xenograft-bearing mice. Clinical cancer research, 2006, 12, (1),

298-304.

60. Khrapunovich-Baine, M.; Menon, V.; Verdier-Pinard, P.; Smith III, A. B.;

Angeletti, R. H.; Fiser, A.; Horwitz, S. B.; Xiao, H., Distinct pose of discodermolide in

taxol binding pocket drives a complementary mode of microtubule stabilization.

Biochemistry, 2009, 48, (49), 11664-11677.

106

61. Ngo, Q. A.; Roussi, F.; Cormier, A.; Thoret, S.; Knossow, M.; Guénard, D.;

Guéritte, F., Synthesis and biological evaluation of vinca alkaloids and phomopsin

hybrids. Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 52, (1), 134-142.

62. Nogales, E., A structural view of microtubule dynamics. Cellular and Molecular

Life Sciences CMLS, 1999, 56, (1-2), 133-142.

63. Wilson, L.; Jordan, M.; Morse, A.; Margolis, R., Interaction of vinblastine with

steady-state microtubules in vitro. Journal of molecular biology, 1982, 159, (1), 125-

149.

64. Passarella, D.; Giardini, A.; Peretto, B.; Fontana, G.; Sacchetti, A.; Silvani, A.;

Ronchi, C.; Cappelletti, G.; Cartelli, D.; Borlak, J., Inhibitors of tubulin

polymerization: Synthesis and biological evaluation of hybrids of vindoline,

anhydrovinblastine and vinorelbine with thiocolchicine, podophyllotoxin and baccatin

III. Bioorganic & medicinal chemistry, 2008, 16, (11), 6269-6285.

65. Lin, C. M.; Singh, S.; Chu, P.; Dempcy, R.; Schmidt, J.; Pettit, G.; Hamel, E.,

Interactions of tubulin with potent natural and synthetic analogs of the antimitotic

agent combretastatin: a structure-activity study. Molecular pharmacology, 1988, 34,

(2), 200-208.

66. Pettit, G. R.; Lippert, J. W., 3rd, Antineoplastic agents 429. Syntheses of the

combretastatin A-1 and combretastatin B-1 prodrugs. Anticancer Drug Des, 2000, 15,

(3), 203-16.

67. Pinney, K. G.; Jelinek, C.; Edvardsen, K.; Chaplin, D. J.; Pettit, G. R., The

discovery and development of the combretastatins. Anticancer agents from natural

products, 2005, 23-46.

68. Pettit, G.; Lippert, J., Preparation of combretastatin A-1 phosphate and

combretastatin B-1 phosphate prodrugs with increased solubility, PCT Int. Application

WO2001081355 A, 1, 2001.

69. Pettit, G.; Minardi, M., Preparation of combretastatin A3 diphosphate prodrugs

for the treatment of cancer, PCT Int. Application WO2002102766 A, 2, 2002.

70. Pinney, K. G.; Mejia, M. P.; Villalobos, V. M.; Rosenquist, B. E.; Pettit, G. R.;

Verdier-Pinard, P.; Hamel, E., Synthesis and biological evaluation of aryl azide

107

derivatives of combretastatin A-4 as molecular probes for tubulin. Bioorganic &

medicinal chemistry, 2000, 8, (10), 2417-2425.

71. Ohsumi, K.; Hatanaka, T.; Nakagawa, R.; Fukuda, Y.; Morinaga, Y.; Suga, Y.;

Nihei, Y.; Ohishi, K.; Akiyama, Y.; Tsuji, T., Synthesis and antitumor activities of

amino acid prodrugs of amino-combretastatins. Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14,

(6), 539-548.

72. Hadimani, M. B., Studies toward the discovery of new classes of privileged

molecules as colchicine-site binding ligands for tubulin: Structure-based design,

synthesis and bioactivity of small ligands targeted at tumor vasculature. Baylor

University: 2004.

73. Pettit, G. R.; Anderson, C. R.; Herald, D. L.; Jung, M. K.; Lee, D. J.; Hamel, E.;

Pettit, R. K., Antineoplastic agents. 487. Synthesis and biological evaluation of the

antineoplastic agent 3, 4-methylenedioxy-5, 4 ‘-dimethoxy-3 ‘-amino-Z-stilbene and

derived amino acid amides. Journal of medicinal chemistry, 2003, 46, (4), 525-531.

74. Lawrence, N. J.; Hepworth, L. A.; Rennison, D.; McGown, A. T.; Hadfield, J.

A., Synthesis and anticancer activity of fluorinated analogues of combretastatin A-4.

Journal of fluorine chemistry, 2003, 123, (1), 101-108.

75. Davis, P. D., Compositions with vascular damaging activity. Google Patents:

2006.

76. Gaukroger, K.; Hadfield, J. A.; Lawrence, N. J.; Nolan, S.; McGown, A. T.,

Structural requirements for the interaction of combretastatins with tubulin: how

important is the trimethoxy unit? Organic & biomolecular chemistry, 2003, 1, (17),

3033-3037.

77. Cragg, G. M.; Kingston, D. G.; Newman, D. J., Anticancer agents from natural

products. CRC press: 2011.

78. Janik, M. E.; Bane, S. L., Synthesis and antimicrotubule activity of

combretatropone derivatives. Bioorganic & medicinal chemistry, 2002, 10, (6), 1895-

1903.

79. Pinney, K.; Mocharla, V.; Chen, Z.; Garner, C.; Ghatak, A.; Hadimani, M.;

Kessler, J.; Dorsey, J.; Edvardsen, K.; Chaplin, D., 8. Preparation of aryl and

108

arylcarbonylbenzothiophenes,-benzofurans,-indenes, and-indoles as tubulin binding

ligands and corresponding prodrug constructs thereof useful as antitumor agents. US

Patent Appl. Publ. 20040043969 A, 2004, 1.

80. Álvarez, R.; Álvarez, C.; Mollinedo, F.; Sierra, B. G.; Medarde, M.; Peláez, R.,

Isocombretastatins A: 1,1-Diarylethenes as potent inhibitors of tubulin polymerization

and cytotoxic compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17, (17), 6422-

6431.

81. Jiménez, C.; Ellahioui, Y.; Álvarez, R.; Aramburu, L.; Riesco, A.; González,

M.; Vicente, A.; Dahdouh, A.; Ibn Mansour, A.; Jiménez, C.; Martín, D.; Sarmiento, R.

G.; Medarde, M.; Caballero, E.; Peláez, R., Exploring the size adaptability of the B

ring binding zone of the colchicine site of tubulin with para-nitrogen substituted

isocombretastatins. European journal of medicinal chemistry, 2015, 100, 210-222.

82. Holwell, S.; Cooper, P.; Thompson, M.; Pettit, G.; Lippert, J.; Martin, S.; Bibby,

M., Anti-tumor and anti-vascular effects of the novel tubulin-binding agent

combretastatin A-1 phosphate. Anticancer research, 2002, 22, (6 C), 3933-3940.

83. Hill, S. A.; Toze, G.; Pettit, G. R.; Chaplin, D. J., Preclinical evaluation of the

antitumour activity of the novel vascular targeting agent Oxi 4503. Anticancer

research, 2002, 22, (3), 1453-1458.

84. Shnyder, S.; Cooper, P.; Pettit, G.; Bibby, M., Combretastatin A-1 phosphate

potentiates the antitumour activity of cisplatin in a murine adenocarcinoma model.

Anticancer research, 2003, 23, (2B), 1619-1623.

85. Hua, J.; Sheng, Y.; Pinney, K. G.; Garner, C. M.; Kane, R. R.; Prezioso, J. A.;

Pettit, G. R.; Chaplin, D. J.; Edvardsen, K., Oxi4503, a novel vascular targeting agent:

effects on blood flow and antitumor activity in comparison to combretastatin A-4

phosphate. Anticancer research, 2003, 23, (2B), 1433-1440.

86. Kirwan, I. G.; Loadman, P. M.; Swaine, D. J.; Anthoney, D. A.; Pettit, G. R.;

Lippert, J. W.; Shnyder, S. D.; Cooper, P. A.; Bibby, M. C., Comparative preclinical

pharmacokinetic and metabolic studies of the combretastatin prodrugs combretastatin

A4 phosphate and A1 phosphate. Clinical Cancer Research, 2004, 10, (4), 1446-1453.

109

87. Guerram, M.; JIANG, Z.-Z.; Zhang, L.-Y., Podophyllotoxin, a medicinal agent

of plant origin: past, present and future. Chinese Journal of Natural Medicines, 2012,

10, (3), 161-169.

88. Banday, A. H.; Kulkarni, V. V.; Hruby, V. J., Design, synthesis, and biological

and docking studies of novel epipodophyllotoxin–chalcone hybrids as potential

anticancer agents. MedChemComm, 2015, 6, (1), 94-104.

89. Ameen, D.; Snape, T. J., Chiral 1, 1-diaryl compounds as important

pharmacophores. MedChemComm, 2013, 4, (6), 893-907.

90. Patterson, D.; Rustin, G.; Serradell, N.; Rosa, E.; Bolos, J., Combretastatin A-4

phosphate. Drugs Future, 2007, 32, 1025-1032.

91. Rimando, A. M.; Suh, N., Biological/chemopreventive activity of stilbenes and

their effect on colon cancer. 2008.

92. Griggs, J.; Metcalfe, J. C.; Hesketh, R., Targeting tumour vasculature: the

development of combretastatin A4. The lancet oncology, 2001, 2, (2), 82-87.

93. Kluza, J.; Gallego, M.-A.; Loyens, A.; Beauvillain, J.-C.; Sousa-Faro, J.-M. F.;

Cuevas, C.; Marchetti, P.; Bailly, C., Cancer cell mitochondria are direct proapoptotic

targets for the marine antitumor drug lamellarin D. Cancer Research, 2006, 66, (6),

3177-3187.

94. Banwell, M. G.; Hamel, E.; Hockless, D. C.; Verdier-Pinard, P.; Willis, A. C.;

Wong, D. J., 4, 5-Diaryl-1H-pyrrole-2-carboxylates as combretastatin A-4/lamellarin

T hybrids: Synthesis and evaluation as anti-mitotic and cytotoxic agents. Bioorganic &

medicinal chemistry, 2006, 14, (13), 4627-4638.

95. Sharma, V.; Bhatia, P.; Alam, O.; Javed Naim, M.; Nawaz, F.; Ahmad Sheikh,

A.; Jha, M., Recent advancement in the discovery and development of COX-2

inhibitors: Insight into biological activities and SAR studies (2008–2019). Bioorganic

Chemistry, 2019, 89, 103007.

96. Xu, X.-C., COX-2 inhibitors in cancer treatment and prevention, a recent

development. Anti-cancer drugs, 2002, 13, (2), 127-137.

110

97.

Fustero, S.; Sanchez-Rosello, M.; Barrio, P.; Simon-Fuentes, A., From 2000 to

mid-2010: a fruitful decade for the synthesis of pyrazoles. Chemical reviews, 2011,

111, (11), 6984-7034.

98. Ansari, A.; Ali, A.; Asif, M., Biologically active pyrazole derivatives. New

Journal of Chemistry, 2017, 41, (1), 16-41.

99. Murahari, M.; Mahajan, V.; Neeladri, S.; Kumar, M. S.; Mayur, Y. C., Ligand

based design and synthesis of pyrazole based derivatives as selective COX-2 inhibitors.

Bioorganic Chemistry, 2019, 86, 583-597.

100. Brullo, C.; Massa, M.; Rapetti, F.; Alfei, S.; Bertolotto, M. B.; Montecucco, F.;

Signorello, M. G.; Bruno, O., New hybrid pyrazole and imidazopyrazole

antinflammatory agents able to reduce ROS production in different biological targets.

Molecules, 2020, 25, (4), 899.

101. Punganuru, S. R.; Madala, H. R.; Mikelis, C. M.; Dixit, A.; Arutla, V.;

Srivenugopal, K. S., Conception, synthesis, and characterization of a rofecoxib-

combretastatin hybrid drug with potent cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibiting and

microtubule disrupting activities in colon cancer cell culture and xenograft models.

Oncotarget, 2018, 9, (40), 26109.

102. Nayak, N.; Ramprasad, J.; Dalimba, U., Synthesis and antitubercular and

antibacterial activity of some active fluorine containing quinoline–pyrazole hybrid

derivatives. Journal of Fluorine Chemistry, 2016, 183, 59-68.

103. Alegaon, S. G.; Hirpara, M. B.; Alagawadi, K. R.; Hullatti, K. K.; Kashniyal,

K., Synthesis of novel pyrazole–thiadiazole hybrid as potential potent and selective

cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,

2014, 24, (22), 5324-5329.

104. Zhang, X.; Chen, J.; Davis, B.; Kiechle, F., Hoechst 33342 induces apoptosis in

HL-60 cells and inhibits topoisomerase I in vivo. Archives of Pathology and

Laboratory Medicine, 1999, 123, (10), 921-927.

105. Mcmartin, C.; Bohacek, R. S., QXP: powerful, rapid computer algorithms for

structure-based drug design. Journal of computer-aided molecular design, 1997, 11,

(4), 333-344.

111

106. Schnecke, V.; Kuhn, L. A., Virtual screening with solvation and ligand-induced

complementarity. In Virtual Screening: An Alternative or Complement to High

Throughput Screening?, Springer: 2000; pp 171-190.

107. Fu, R.-g.; Sun, Y.; Sheng, W.-b.; Liao, D.-f., Designing multi-targeted agents:

an emerging anticancer drug discovery paradigm. European journal of medicinal

chemistry, 2017, 136, 195-211.

108. Ohsumi, K.; Hatanaka, T.; Fujita, K.; Nakagawa, R.; Fukuda, Y.; Nihei, Y.;

Suga, Y.; Morinaga, Y.; Akiyama, Y.; Tsuji, T., Syntheses and antitumor activity of

cis-restricted combretastatins: 5-membered heterocyclic analogues. Bioorganic &

medicinal chemistry letters, 1998, 8, (22), 3153-3158.

109. Kurumbail, R. G.; Stevens, A. M.; Gierse, J. K.; McDonald, J. J.; Stegeman, R.

A.; Pak, J. Y.; Gildehaus, D.; Penning, T. D.; Seibert, K.; Isakson, P. C., Structural

basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents. Nature,

1996, 384, (6610), 644-648.

110. Lala, P. K.; Chakraborty, C., Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour

progression. The lancet oncology, 2001, 2, (3), 149-156.

111. Del Grosso, E.; Boschi, D.; Lazzarato, L.; Cena, C.; Di Stilo, A.; Fruttero, R.;

Moro, S.; Gasco, A., The Furoxan System: Design of Selective Nitric Oxide (NO)

Donor Inhibitors of COX‐2 Endowed with Anti‐Aggregatory and Vasodilating

Activities. Chemistry & biodiversity, 2005, 2, (7), 886-900.

112. Boschi, D.; Lazzarato, L.; Rolando, B.; Filieri, A.; Cena, C.; Di Stilo, A.;

Fruttero, R.; Gasco, A., Nitrooxymethyl‐Substituted Analogues of Celecoxib: Synthesis

and Pharmacological Characterization. Chemistry & Biodiversity, 2009, 6, (3), 369-

379.

113. Bozzo, F.; Bassignana, A.; Lazzarato, L.; Boschi, D.; Gasco, A.; Bocca, C.;

Miglietta, A., Novel nitro-oxy derivatives of celecoxib for the regulation of colon

cancer cell growth. Chemico-biological interactions, 2009, 182, (2-3), 183-190.

114. Bocca, C.; Bozzo, F.; Bassignana, A.; Miglietta, A., Antiproliferative effects of

COX-2 inhibitor celecoxib on human breast cancer cell lines. Molecular and cellular

biochemistry, 2011, 350, (1-2), 59-70.

112

115. Bennett, A., The production of prostanoids in human cancers, and their

implications for tumor progression. Progress in lipid research, 1986, 25, 539-542.

116. Fulton, A. M.; Heppner, G. H., Relationships of prostaglandin E and natural

killer sensitivity to metastatic potential in murine mammary adenocarcinomas. Cancer

research, 1985, 45, (10), 4779-4784.

117. Schrey, M.; Patel, K., Prostaglandin E 2 production and metabolism in human

breast cancer cells and breast fibroblasts. Regulation by inflammatory mediators.

British Journal of Cancer, 1995, 72, (6), 1412-1419.

118. Rakesh, K.; Wang, S.-M.; Leng, J.; Ravindar, L.; Asiri, A. M.; Marwani, H. M.;

Qin, H.-L., Recent development of sulfonyl or sulfonamide hybrids as potential

anticancer agents: a key review. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry

(Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents), 2018, 18, (4), 488-505.

119. Zhai, J.; Gu, C.; Jiang, J.; Zhang, S.; Liao, D.; Wang, L.; Zhu, D.; Ji, Y., A One‐

pot Approach to Ethyl 1, 4, 5‐Triaryl‐1H‐pyrazole‐3‐carboxylates via an Improved

Claisen Condensation‐Knorr Reaction Sequence. Chinese Journal of Chemistry, 2013,

31, (12), 1526-1538.

120. Monks, A.; Scudiero, D.; Skehan, P.; Shoemaker, R.; Paull, K.; Vistica, D.;

Hose, C.; Langley, J.; Cronise, P.; Vaigro-Wolff, A., Feasibility of a high-flux

anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. JNCI:

Journal of the National Cancer Institute, 1991, 83, (11), 757-766.

121. Waskewich, C.; Blumenthal, R. D.; Li, H.; Stein, R.; Goldenberg, D. M.;

Burton, J., Celecoxib exhibits the greatest potency amongst cyclooxygenase (COX)

inhibitors for growth inhibition of COX-2-negative hematopoietic and epithelial cell

lines. Cancer research, 2002, 62, (7), 2029-2033.

122. Li, Y.; Niu, Y.; Wu, H.; Zhang, B.; Sun, Y.; Huang, H.; Li, Q.; Fan, L.; Liu, L.;

Mei, Q., PC‐407, a celecoxib derivative, inhibited the growth of colorectal tumor in

vitro and in vivo. Cancer science, 2009, 100, (12), 2451-2458.

123. Roy, K. R.; Reddy, G. V.; Maitreyi, L.; Agarwal, S.; Achari, C.; Vali, S.;

Reddanna, P., Celecoxib inhibits MDR1 expression through COX-2-dependent

113

mechanism

in human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell line. Cancer

chemotherapy and pharmacology, 2010, 65, (5), 903-911.

124. Cheenpracha, S.; Park, E.-J.; Rostama, B.; Pezzuto, J. M.; Chang, L. C.,

Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated

murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin

A. Marine drugs, 2010, 8, (3), 429-437.

125. Tarade, D.; Ma, D.; Pignanelli, C.; Mansour, F.; Simard, D.; van den Berg, S.;

Gauld, J.; McNulty, J.; Pandey, S., Structurally simplified biphenyl combretastatin A4

derivatives retain in vitro anti-cancer activity dependent on mitotic arrest. Plos one,

2017, 12, (3), e0171806.

126. Belloc, F.; Dumain, P.; Boisseau, M. R.; Jalloustre, C.; Reiffers, J.; Bernard, P.;

Lacombe, F., A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for

simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells.

Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 1994, 17,

(1), 59-65.

127. Porter, A., Jaenicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death

Differ, 1999, 6, 99-104.

128. Van Engeland, M.; Nieland, L. J.; Ramaekers, F. C.; Schutte, B.;

Reutelingsperger, C. P., Annexin V‐affinity assay: a review on an apoptosis detection

system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry: The Journal of the

International Society for Analytical Cytology, 1998, 31, (1), 1-9.

129. Pérez, D. J.; Díaz-Reval, M. I.; Obledo-Benicio, F.; Zakai, U. I.; Gómez-

Sandoval, Z.; Razo-Hernández, R. S.; West, R.; Sumaya-Martínez, M. T.; Pineda-

Urbina, K.; Ramos-Organillo, Á., Silicon containing ibuprofen derivatives with

antioxidant and anti-inflammatory activities: An in vivo and in silico study. European

Journal of Pharmacology, 2017, 814, 18-27.

130. Pérez, D. J.; Sarabia, O.; Villanueva-García, M.; Pineda-Urbina, K.; Ramos-

Organillo, Á.; Gonzalez-Gonzalez, J.; Gómez-Sandoval, Z.; Razo-Hernández, R. S., In

silico receptor-based drug design of X, Y-benzenesulfonamide derivatives as selective

COX-2 inhibitors. Comptes Rendus Chimie, 2017, 20, (2), 169-180.

114

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai Coxib – Combretastatin

gfd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

---------------o0o---------------

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số : 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Ngô Quốc Anh 2. PGS.TS. Vũ Đình Hoàng

HÀ NỘI - 2021

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... 3

1.7. Mục tiêu của luận án ............................................................................................ 29

1.2.6. Một số chất lai theo cơ chế khác

1.4.6. Thuốc lai dựa trên cấu trúc vinca alkaloid

Giai đoạn 2: Phản ứng tổng hợp các hợp chất khung lai ghép dạng este

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

Chất

76(khối

(ii)

Chất 78

Sản phẩm

Lƣợng

Hiệu suất

TT

lƣợng)

(mg)

(ký hiệu)

(mg)

(%)

76