Luận án Tiến sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản: Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:164

Thêm vào BST

Báo xấu

150
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu; xác định đặc điểm bệnh học của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản: Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cần Thơ, 2016 i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần Thơ, 2016 ii
LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành các nội dung cơ bản trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ không nhỏ từ nhiều tổ chức, cơ quan và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành biết ơn tới Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, quý thầy, cô Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS Đặng Thị Hoàng Oanh đã trực tiếp, hướng dẫn, tận tình dìu dắt và đóng góp ý kiến quý báu để giúp tôi hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy sản đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tại Bộ môn. Cám ơn các em học viên Cao học và các em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Sở Nông nghiệp & PTNT, Trung tâm Khuyến nông Khuyến ngư Bạc Liêu đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tại Trường Đại học Cần Thơ. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp những người đã góp ý, chia sẻ chân thành, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa học. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã tạo mọi điều kiện để tôi vượt qua khó khăn, trở ngại trong suốt quá trình học tập và làm việc. TÁC GIẢ i
TÓM TẮT Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) đã gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi. Qua kết quả điều tra phỏng vấn trực tiếp 90 hộ nuôi ở Bạc Liêu cho thấy, mật độ nuôi cá bống kèo dao động từ 100 – 150 con/m2, trong suốt thời gian nuôi hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước, xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Cá tập trung bệnh ở giai đoạn 02 tháng tuổi với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và trên diện rộng, ảnh hưởng đến năng suất và lợi nhuận của người nuôi. Kết quả phân lập vi khuẩn sau 6 lần thu mẫu đã thu được 252 khuẩn lạc, tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn thu được là vi khuẩn Gram (+), hình tròn, không di động, oxidase và catalase âm tính. Sau khi tiến hành định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep và phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Streptococcus dysgalactiae. Quy trình PCR sử dụng đoạn mồi STRD-DyI/dys-16S-23S-2 được chuẩn hóa để chẩn đoán nhanh S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. Kết quả xác định liều lượng gây chết LD50 của vi khuẩn là 4,25 x 104 CFU/ml. Vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nhạy cao với kháng sinh florfenicol và doxycycline. Kết quả điều trị trong phòng thí nghiệm cho thấy khi gây cảm nhiễm cá bống kèo bằng chủng vi khuẩn B1-6T với liều lượng vi khuẩn 4,25 x 104 CFU/cá, sử dụng 02 loại thuốc kháng sinh florfenicol và doxycycline ở liều lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá, sau 21 ngày theo dõi cả hai loại kháng sinh trên (ở dạng nguyên liệu và thành phẩm) đều cho tỷ lệ điều trị đạt cao, tỉ lệ sống của cá đạt từ 65,56 % – 71,11 %, giá trị RPS (%) đạt từ 45,27% – 61,16 %. ii
ABSTRACT Hemorrhagic disease has caused huge losses in the cultured mudskipper (Pseudapocryptes elongates). Result interviewed 90 farmers in Bac Lieu province showed that the farmers culture mudskipper density from 100-150 fish/m2, almost no change water but they add water in the pond, they use chemical processing and microbiology for improving farming environment. Fish concentrate disease stage 02 months old with clinical signs of hemorrhage in the body, at the fin and anal with a high mortality rate and widespread, affecting the productivity and profitability of farmers. Results were obtained sampling 252 colonies after 6 times collecting bacteria sample, examined some basic biochemical indicators of bacteria showed that bacterial is Gram (+), cocci, non-motile, oxidase and catalase-negative. After conducting identification of bacteria by API 20 Strep kit and method of 16S rRNA gene sequence analysis has identified the bacteria is Streptococcus dysgalactiae. PCR using primers STRD-DYI/dys-16S-23S-2 is standardized to provide rapid diagnosis pathogenic S. dysgalactiae in hemorrhage mudskipper. The results determine the LD50 in lethal doses of bacteria is 4.25 x 104 CFU/ml. S. dysgalactiae bacteria were sensitized with florfenicol and doxycycline. The results of treatment in the laboratory showed that when the mudskippers are causing susceptibility by strain B1-6T with dose 4.25 x 104 CFU/fish, use florfenicol and doxycycline in dose 20 mg/kg fish, after 21 days, the result of the experiment showed that two kinds of antibiotics (materials and products) are for reaching higher treatment rates, survival rate is from 65.56% - 71.11%, the value RPS (%) was from 45.27% - 61.16%. iii
CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài ‟Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes lanceolatus) nuôi thương phẩm và đề xuất giải pháp phòng, trị” (Mã số: B2013- 16-29) do Bộ Giáo dục và Đào tạo tài trợ. Đề tài có quyền sử dụng kết quả luận án này để phục vụ cho đề tài. Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Tác giả Nguyễn Thu Dung iv
MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ ............................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................... ii Abstract ................................................................................................................. iii Cam kết kết quả .................................................................................................... iv Chƣơng I: Giới thiệu ........................................................................................... 1 1.1 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 1.2 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 2 1.4 Giới hạn nghiên cứu......................................................................................... 3 1.5 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................... 3 1.6 Điểm mới của luận án ...................................................................................... 3 Chƣơng II: Tổng quan tài liệu ............................................................................ 4 2.1 Phân loại cá bống kèo ...................................................................................... 4 2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước ................................. 4 2.2.1 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới ...................................................... 4 2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nước ........................................................ 5 2.3 Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo...................................................... 5 2.4 Bệnh xuất huyết ở cá........................................................................................ 6 2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................................... 6 2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học ................................................................................. 6 2.4.3 Đặc điểm huyết học ...................................................................................... 7 2.5 Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá ......................................... 8 2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio............................................................................... 8 2.5.2 Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas ................................................................. 10 2.5.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus................................................................. 11 2.5.4 Bệnh do vi khuẩn Flexibacter ..................................................................... 12 2.5.5 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas..................................................................... 13 2.5.6 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ................................................................. 15 2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nước lợ, mặn ........... 16 2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae........................................................ 17 2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ............................................... 18 2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae ........................................... 19 2.6.4 Cơ chế gây bệnh.......................................................................................... 20 2.6.5 Phương thức lây truyền bệnh trong môi trường nuôi ................................. 20 2.6.6 Phương thức chẩn đoán .............................................................................. 21 2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá ... 21 v
2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá .................................................................... 22 2.9 Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá.................................................................. 23 2.9.1 Hóa chất ...................................................................................................... 23 2.9.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 23 2.9.3 Vắc xin ........................................................................................................ 25 Chƣơng III: Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 27 3.1.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 27 3.1.2 Hóa chất ...................................................................................................... 27 3.1.3 Môi trường .................................................................................................. 27 3.1.4 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 28 3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện .................................................................. 28 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 28 3.2.1 Điều tra phỏng vấn...................................................................................... 28 3.2.2 Phương pháp thu mẫu cá............................................................................. 29 3.2.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng ........................................................... 29 3.2.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn ........................................................ 29 3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ................................. 32 3.2.6 Phương pháp mô bệnh học ......................................................................... 33 3.2.7 Phương pháp huyết học .............................................................................. 33 3.2.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết ........................................ 34 3.2.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 37 3.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 38 3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 41 Chƣơng IV: Kết quả và thảo luận .................................................................... 42 4.1 Khảo sát tình hình nuôi cá bống kèo ............................................................. 42 4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo .......................................................................... 42 4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo nuôi thương phẩm .................................. 49 4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo ........................................... 50 4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết .............. 51 4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 51 4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo .......................................................................................... 52 4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep .................................... 53 4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ..................... 53 4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo................... 55 4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ................ 55 4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ......................... 58 4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh ................................................ 63 vi
4.5 Phát triển quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................................. 69 4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá ........................................ 69 4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn ............................................................... 69 4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae ......................................................................... 69 4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 70 4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 71 4.6 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................................................... 72 4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ....... 72 4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ................................................................... 77 4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50 ................................................... 80 4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm .................... 82 Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất ......................................................................... 86 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 86 5.1.1 Kết quả điều tra ........................................................................................... 86 5.1.2 Kết quả nghiên cứu ..................................................................................... 86 5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 88 1. Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 88 2. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 100 PHỤ LỤC.......................................................................................................... 106 Phụ lục A: Phiếu điều tra ao nuôi ...................................................................... 106 Phụ lục B: Hóa chất và phương pháp phân tích mẫu......................................... 108 Phụ lục B.1: Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn.............. 108 Phụ lục B.2: Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ............. 108 Phụ lục B.3: Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh .......................................................................... 109 Phụ lục C: Số liệu nghiên cứu ........................................................................... 112 Phụ lục C.1: Kết quả điều tra ............................................................................. 112 Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn ......................................... 121 Phụ lục C.3: Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ................................... 141 Phụ lục C.4: Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn.................................. 142 Phụ lục C.5: Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo ......................................... 154 Phụ lục C.6: Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................... 157 vii
Phụ lục C.7: Kết quả thí nghiệm LD50 ............................................................... 158 Phụ lục C.8: Kết quả thí nghiệm điều trị ........................................................... 160 viii
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio ............................. 9 Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas .............................. 10 Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Streptococcus ............................... 12 Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Flexibacter ................................... 13 Bảng 2.5 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Aeromonas ................................... 14 Bảng 2.6 Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri ..................................... 15 Bảng 3.1 Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep ................ 32 Bảng 3.2 Đường kính vô trùng của một số kháng sinh ....................................... 38 Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo ........................................... 42 Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo ................................................................... 43 Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao ........................................................................... 45 Bảng 4.4 Mật độ thả giống .................................................................................. 46 Bảng 4.5 Tỷ lệ cá chết ......................................................................................... 50 Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo ................... 51 Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu ........ 52 Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI..... 54 Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết ............... 65 Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu trên cá bống kèo................................................... 67 Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo .............................. 67 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ .......................................................... 74 Bảng 4.13 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S. dysgalactiae trên 3 loại kháng sinh FFC, DO và AML ........................................... 77 Bảng 4.14 Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae ở thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................................... 77 Bảng 4.15 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá bống kèo gây cảm nhiễm ........................................................... 79 Bảng 4.16 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G........ 81 Bảng 4.17 Tỷ lệ sống (%) của cá ở thí nghiệm điều trị ....................................... 84 ix
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Cá bống kèo ............................................................................................ 4 Hình 4.1 Tần suất cho ăn ..................................................................................... 47 Hình 4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu ...... 48 Hình 4.3 Cá bống kèo bị bệnh ............................................................................. 49 Hình 4.4 Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm ............ 49 Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X) ............................ 52 Hình 4.6 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl) ...................................................... 53 Hình 4.7 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G ........... 53 Hình 4.8 Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết............. 56 Hình 4.9 Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết ............. 56 Hình 4.10 Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X) ............. 58 Hình 4.11 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ..................... 59 Hình 4.12 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ....................... 61 Hình 4.13 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ........................ 63 Hình 4.14 Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X) ..................................... 64 Hình 4.15 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X) ..................................... 64 Hình 4.16 Các loại bạch cầu (100X) ................................................................... 66 Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 .......................................... 69 Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình .. 70 Hình 4.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình .......... 71 Hình 4.20 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn......................................................... 71 Hình 4.21 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết .................... 72 Hình 4.22 Kết quả tách ròng và nhuộm gram các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm kháng sinh đồ ................................................................... 73 Hình 4.23 Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn S. dysgalactiae .......................... 73 Hình 4.24 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ........................................................... 78 Hình 4.25 Kết quả PCR 4 chủng vi khuẩn........................................................... 80 Hình 4.26 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G ................... 81 Hình 4.27 Dấu hiệu bệnh lý của cá trong thí nghiệm điều trị.............................. 82 Hình 4.28 Kết quả định danh chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm điều trị .......................................................................... 83 Hình 4.29 Tỷ lệ sống của cá ở thí nghiệm điều trị............................................... 84 x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long Sở NN&PTNT Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn NCBI National Center for Biotechnology Information TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth NB Nutrient Broth NA Nutrient Agar TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar BHIA Brain Heart Infusion Agar MHA Mueller Hinton Agar TH-CR Todd Hewitt – Congo Red LD50 Lethal Dose 50 RPS Relative Percent Survival O/F Oxidation – Fermentation PCR Polymerase Chain Reaction dNTPs Deoxynucleoside Triphosphates EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate DNA Deoxyribonucleic Acid GCS Group C Streptococci GLS Group L Streptococci GCSD Group C Streptococcus dysgalactiae MIC Minimum Inhibitory Concentration N Neomycin FFC Florfenicol CIP Cirprofloxacin GM Gentamicin DO Doxycycline CZ Cefazolin AMP Ampicillin AML Amoxicillin xi
SXT Trimethoprim + sulfamethoxazole TE Tetracycline NOR Norfloxacin ENR Enrofloxacin RBC Red Blood Cell NT Nghiệm thức BC Bạch cầu xii
Chƣơng I: GIỚI THIỆU Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là một loài cá bản địa với nguồn giống tự nhiên phong phú và là nguồn thực phẩm được nhiều người ưa chuộng. Hiện nay, cá bống kèo là loài thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, được tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nghề nuôi cá bống kèo gặp trở ngại lớn do bệnh xuất hiện và lây lan trên diện rộng làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi trồng và thu nhập của người dân. Cá bống kèo được nuôi tập trung ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng, trong đó Bạc Liêu là tỉnh có diện tích nuôi khá lớn, diện tích nuôi đạt 405 ha vào năm 2011 (Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2012). Tuy nhiên từ năm 2007 đến nay cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và chết trên diện rộng. Xuất huyết là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác nhân gây ra như virus, vi khuẩn và do môi trường. Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển hình như tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi (Oreochromis spp.) ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam được Phạm Hồng Quân và ctv., 2013 xác định là do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra. Vi khuẩn này cũng gây bệnh xuất huyết ở cá điêu hồng (Oreochromis spp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Bệnh xuất huyết còn do tác nhân là vi khuẩn S. iniae, theo kết quả nghiên cứu của Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng (2011) thì tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Latex calcarifer) là vi khuẩn S. iniae, vi khuẩn này còn là tác nhân gây bệnh trên cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999). Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae, vi khuẩn này gây hội chứng xuất huyết, bơi xoắn, mất phương hướng ở cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii) (Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp (Rachycentron canadum) (Abdelsalam et al., 2009). Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều loài vi khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và ctv., 2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá mú giống và cá mú thịt, (Leong tak Seng, 1994; Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012). 1
Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh được xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào về bệnh xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin cho các đơn vị quản lý, các nhà chuyên môn khuyến cáo người nuôi phòng, trị bệnh một cách hiệu quả. Vì thế, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)” sẽ góp phần vào việc kiểm soát dịch bệnh ở cá bống kèo nói riêng và ở thủy sản nuôi trong vùng nói chung ngày càng hiệu quả hơn. 1.1. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu trƣớc mắt: Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả. Mục tiêu lâu dài: Cung cấp thông tin làm cơ sở cho các giải pháp phòng trị bệnh ở cá bống kèo hướng đến nghề nuôi cá bống kèo bền vững. 1.2 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tập trung vào phân lập, định danh, xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nuôi. Đồng thời phát triển qui trình chẩn đoán bệnh và thử nghiệm phòng trị bệnh xuất huyết ở cá bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm. 1.3. Nội dung nghiên cứu Luận án tập trung nghiên cứu các nội dung sau: 1. Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm. 1.1 Điều tra, khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo nuôi. 1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. 2. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo. 2.1 Xác định đặc điểm bệnh học. 2.2 Xác định đặc điểm mô học. 2.3 Xác định đặc điểm huyết học. 3. Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp sinh học phân tử. 4. Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết ở cá bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm. 4.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. 2
4.2 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm. 1.4 Giới hạn nghiên cứu Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm tại tỉnh Bạc Liêu. 1.5 Ý nghĩa nghiên cứu Kết quả nghiên cứu nhằm đáp ứng cho quá trình đa dạng vật nuôi thủy sản và góp phần gia tăng sản lượng động vật thủy sản. Thông tin từ kết quả khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui trình phòng trị bệnh sẽ góp phần hạn chế thiệt hại trong quá trình nuôi cá bống kèo mang lại hiệu quả về năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi. 1.6. Điểm mới của luận án Lần đầu tiên xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo là vi khuẩn Streptococcus dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường xuất hiện ở cá bống kèo nuôi trong ao. Hoàn chỉnh qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae để ứng dụng chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp PCR. Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. 3
Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại cá bống kèo Hiện nay cá bống kèo được gọi phổ biến là Pseudapocryptes elongatus. Tên tiếng Việt là cá bống kèo hay cá bống kèo vẩy nhỏ. Tên tiếng Anh là Lanceolate goby. Theo Cuveir (1816), cá bống kèo được phân loại: Bộ: Perciformes Họ: Gobiidae Giống: Pseudapocryptes Loài: Pseudapoccryptes lanceolatus (Bloch & Schneider, 1801) Pseudapocryptes elongatus (Cuveir, 1816) Hình 2.1: Cá bống kèo 2.2. Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nƣớc 2.2.1. Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới Cá bống kèo là loài cá phân bố rộng ở những vùng cửa sông hay trong hệ sinh thái rừng ngập mặn và bãi bùn ở Ấn Độ, Banglades, Campuchia, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam…(Abid et al., 2014). Đây cũng là một trong những đối tượng được quan tâm phát triển nghề nuôi trên thế giới do cá dễ nuôi và có giá trị dinh dưỡng cao, có 34 giống cá bống thuộc họ Gobiiidae được tập trung nuôi ở các nước như Banglades, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Philippines và Việt Nam (Polgar và Lim, 2011). Theo Hong và Zhang (2004) thì Trung Quốc đã sinh sản nhân tạo thành công một loài cá bống có tên khoa học là Boleophthalmus pectinirostris và đã phát triển nuôi đối tượng này với mật độ nuôi từ 4,5 – 7,5 con/m2, năng suất trung bình đạt từ 750 đến 975 kg/ha. Diện tích nuôi loài cá này ở Trung Quốc đạt khoảng 13.000 ha ở (Hong et al., 2007). Đây cũng là loài cá bống được nuôi phổ biến ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan (Takeshi, 2008). Một loài cá bống khác là cá bống kèo Pseudapocryptes elongates cũng được phát triển mạnh ở một số nước Châu Á, điển hình như Đài Loan và Việt 4
Nam, đây là loài cá được nuôi ở dạng mô hình nuôi thâm canh và bán thâm canh (Dinh et al., 2007) với năng suất nuôi đạt bình quân 0,8 tấn/ha ở mật độ thấp và 6,4 tấn/ha ở mật độ nuôi cao (Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương, 2011) 2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nƣớc Cá bống kèo là một trong những đối tượng thủy sản được các tỉnh vùng ven biển ĐBSCL quan tâm phát triển nuôi trong những năm gần đây. Cá bống kèo (Pseudapoccryptes elongatus) là loài cá bản địa, đây là một đối tượng nuôi còn khá mới, diện tích nuôi đối tượng này không đáng kể, ở những năm đầu 2000 diện tích nuôi dối tượng này chỉ vài ha, tuy nhiên vào những năm 2011, 2012 diện tích nuôi đối tượng này đã tăng 105 ha ở Cà Mau (Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Cà Mau, 2013) và 445 ha ở tỉnh Bạc Liêu (Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2013), diện tích nuôi cá bống kèo ở tỉnh Bạc Liêu tập trung ở 03 huyện trọng điểm đó là thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải. Theo Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu (2013) thì cá bống kèo được nuôi ở quy mô thâm canh với diện tích ao nuôi từ 3.000 m2 đến 5.000 m2. Mật độ thả giống cao, trung bình thả nuôi 100 con/m2, thời gian nuôi từ 4 – 6 tháng cá đạt trung bình từ 40 – 50 con/kg, năng suất ước đạt từ 10 – 15 tấn/ha, một số hộ nuôi có thể đạt năng suất 20 tấn/ha, lợi nhuận bình quân từ 100 triệu – 150 triệu đồng/ha. Công trình phục vụ cho quá trình nuôi đối tượng này khá đơn giản, người nuôi ít tốn công chăm sóc, chủ yếu tập trung chủ yếu ở giai đoạn cải tạo ao và xử lý nước đầu vụ nuôi còn trong suốt thời gian nuôi, người nuôi không có hoạt động thay nước trong ao, chỉ cung cấp thêm nước khi cần thiết và cho cá ăn liên tục trong ngày. Chính những hoạt động này đã góp phần làm cho môi trường ao nuôi ngày càng xấu đi do các chất cặn bã tích tụ dưới đáy ao và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh trên cá ảnh hưởng đến năng suất nuôi cũng như lợi nhuận của người sản xuất. 2.3. Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo Do tốc độ phát triển của nghề nuôi cá bống kèo phát triển nhanh chóng, cá được nuôi dưới hình thức công nghiệp – bán công nghiệp với mật độ nuôi cao, lên đến 100 con/m2 (Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu, 2013), nhưng kỹ thuật nuôi đối tượng này vẫn chưa hoàn chỉnh, người dân chưa được trang bị đầy đủ kiến thức về phương pháp quản lý, chăm sóc cũng như phòng và trị bệnh về cá nuôi. Cá bống kèo được nuôi trong điều kiện ao nuôi không thay nước, lượng thức ăn được cung cấp liên tục trong ngày tạo ra một lượng thức ăn dư thừa tích tụ dưới đáy ao, nhưng trong quản lý môi 5
trường ao nuôi người dân ít sử dụng các loại vi sinh cải thiện điều kiện sống của cá nuôi, kết hợp những yếu tố trên đã làm cho chất lượng môi trường nuôi ngày càng bị ô nhiễm ảnh hưởng đến sức khỏe của cá, tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát. Mô hình nuôi cá bống kèo thương phẩm là mô hình nuôi mới, diện tích nuôi của mô hình nhỏ so với tổng diện tích nuôi thủy sản của các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng, nên không có số liệu thống kê diện tích cá bị thiệt hại và tỷ lệ thiệt hại chính thức từ các cơ quan chức năng, nhưng những năm 2007, 2008 và 2009 là năm mà nghề nuôi cá bống kèo của tỉnh Bạc Liêu và các tỉnh lân cận như Sóc Trăng và Cà Mau gặp rất nhiều khó khăn do phát sinh dịch bệnh, cá bị chết hàng loạt có những ao tỷ lệ chết lên đến 90%, cá biệt có những ao tỷ lệ cá chết “trắng”, mỗi ngày người nuôi vớt từ 200 – 300 con cá bống kèo chết trong một ao với dấu hiệu thường thấy là xuất huyết, chướng bụng, nổ mắt và lở loét (http://vasep.com.vn). 2.4 Bệnh xuất huyết ở cá 2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý Cá bệnh xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng mảng đỏ trên cơ thể, xuất huyết khắp trên da cá, tập trung nhiều ở gốc vây và đuôi, hậu môn bị viêm hoặc xuất huyết. Hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, mắt lồi, mờ đục và phù ra. Bụng sưng to, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại tử, thận và tỳ tạng sưng to (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). Kết quả nghiên cứu trên cá điêu hồng bị bệnh xuất huyết cho thấy, cá bệnh có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt, bơi lội mất phương hướng, mắt lồi và đục, trên thân có những đốm xuất huyết ở vây ngực và vây bụng, mang tái nhạt, bụng trương to, xoang bụng có chứa dịch màu vàng, nội tạng bị xuất huyết, mềm nhũn (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Kết quả tương tự khi nghiên cứu trên một số loài cá bị bệnh xuất huyết như cá tầm (Wunging và Aihua Li, 2009), cá đối (Qi et al., 2013) và cá rô phi (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013). 2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học Kết quả nghiên cứu của Trương Đình Hoài và ctv. (2012) trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) bị bệnh xuất huyết cho thấy, mang cá xuất huyết, phù nề và tăng sinh biểu mô. Mô não bị sung huyết, viêm và thoái hóa ở nhu mô não. Mô thận cá xuất hiện nhiều vùng bị sung huyết, tụ huyết và thoái hóa, ống thận bị hoại tử và mất cấu trúc. Mô gan cá xuất hiện nhiều tế bào đại thực bào, đảo tụy tăng sinh, xuất hiện nhiều vùng sung huyết, tụ máu, thoái hóa và 6