Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Khảo sát đặc tính gây bệnh và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type a H5N1 lưu hành tại đồng bằng sông Cửu Long giai đoạn 2014-2016

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:214

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xác định các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm type A H5N1 và tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm khỏe mạnh nuôi tại các hộ chăn nuôi, buôn bán tại các chợ và tại các lò giết mổ gia cầm tại các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên trình tự acid amin của protein HA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Khảo sát đặc tính gây bệnh và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type a H5N1 lưu hành tại đồng bằng sông Cửu Long giai đoạn 2014-2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TIỀN NGỌC TIÊN KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH VÀ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM TYPE A H5N1 LƯU HÀNH TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG GIAI ĐOẠN 2014-2016 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TIỀN NGỌC TIÊN KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH VÀ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM TYPE A H5N1 LƯU HÀNH TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG GIAI ĐOẠN 2014-2016 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ NGÀNH: 62640102 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. LÝ THỊ LIÊN KHAI 2020
LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, khoa Sau đại học, ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp, Bộ môn Thú y, các Quý thầy, cô đã giảng dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô hướng dẫn PGS.TS. Lý Thị Liên Khai đã giảng dạy, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, chăm bồi kiến thức và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn các anh, chị đồng nghiệp trong ngành thú y đã giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu của mình. Tôi xin dành tất cả sự yêu thương và lời cám ơn tới gia đình, người thân yêu của tôi đã luôn ủng hộ, chia sẻ những buồn vui trong cuộc sống để tôi có thể an tâm và có thêm nghị lực hoàn thành luận án. Tiền Ngọc Tiên i
TÓM TẮT Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của loài gia cầm, do virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Bệnh cúm gia cầm type A H5N1 bắt đầu xuất hiện tại Việt Nam từ cuối năm 2003 và từ đó đến nay dịch bệnh này xảy ra hàng năm và virus luôn biến đổi phân nhánh gây bệnh tại một số địa phương trong cả nước làm chết và tiêu hủy với số lượng lớn gia cầm. Bên cạnh khả năng lây nhiễm bệnh trên các loài gia cầm, virus cúm type A H5N1 còn có khả năng lây nhiễm và gây tử vong trên người. Do đó, việc thực hiện giám sát tình hình dịch bệnh, sự lưu hành và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 có ý nghĩa rất quan trọng góp phần phát triển ngành chăn nuôi gia cầm và bảo vệ sức khỏe con người. Mẫu swab dịch hầu họng trên gà khỏe (420 mẫu), trên vịt khỏe (936 mẫu) bán tại các chợ, tại các lò giết mổ và các hộ chăn nuôi gia cầm; 144 mẫu mô (não, lách, khí quản, phổi) của gia cầm có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích nghi mắc bệnh cúm gia cầm type A H5N1 được thu thập để xét nghiệm. Các mẫu swab và mẫu mô trên gia cầm được xét nghiệm bằng kỹ thuật Real time RT-PCR để xác định tỷ lệ lưu hành virus và các đàn gia cầm nhiễm bệnh cúm tại 10 tỉnh/thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Giải trình tự gene HA của 49 mẫu đại diện để xác định sự biến đổi, tiến hóa và mối tương quan di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1. Kết quả nghiên cứu cho thấy virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh chủ yếu trên các đàn gia cầm từ 1-3 tháng tuổi, tập trung vào thời gian quý I hàng năm trên các đàn gia cầm chưa được tiêm phòng hoặc tiêm phòng chưa đầy đủ theo quy định. Các đàn gia cầm mắc bệnh cúm gia cầm type A H5N1có các triệu chứng phổ biến như ủ rũ, bỏ ăn, sốt; phù đầu, mặt, thở khò khè, liệt chân, sả cánh, phân trắng xanh, da chân xuất huyết; thần kinh (quay vòng, co giật nghẹo cổ) và các bệnh tích đặc trưng như não xuất huyết, phổi xuất huyết, xuất huyết lớp mỡ vành tim, gan sưng xuất huyết, lách sưng xuất huyết; khí quản xuất huyết, tích dịch. Đã phát hiện sự lưu hành virus cúm gia cầm type A H5N1 trên gà và vịt bán tại các chợ và lò giết mổ; không phát hiện sự lưu hành của virus cúm trên gà và vịt tại các hộ chăn nuôi. Có sự biến đổi ở mức độ nucleotide của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm giai đoạn 2014-2016 và tỷ lệ biến đổi tăng dần theo thời gian. Các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm trong giai đoạn này ở các tỉnh/thành ĐBSCL thuộc phân nhánh 2.3.2.1d và có trình tự các acid amin tại các vị trí quy định độc lực từ 341 đến 346 trên protein HA là RRR–KR. Đồng thời, có sự biến đổi ở các vị trí acid amin trên protein HA là yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng liên kết với thụ thể α 2-6 gắn kết vào tế bào và gây bệnh trên người. Đã xác định được một ii
số vị trí acid amin số 82, 152, 185, 282 có vai trò quan trọng đối với đặc tính gây bệnh của virus cúm gia cầm type A H5N1, sự biến đổi loại acid amin ở những vị trí này sẽ có khả năng làm thay đổi tính gây bệnh, virus cúm gia cầm type A H5N1 có thể chuyển đổi khả năng từ gây bệnh trên gia cầm sang gây bệnh trên người và ngược lại. Từ khóa: Cúm gia cầm, Type A H5N1, Gà, Vịt, Đồng bằng sông Cửu Long, Nucleotide iii
ABSTRACT Avian influenza is an acute infectious disease of poultry, caused by influenza virus belonging to the family Orthomyxoviridae. Type A H5N1 Avian influenza has appeared in Vietnam since the end of 2003 and then this epidemic has been happening every year and the virus has always changed its pathogen in some localities in the country to kill and destroy large numbers of poultry. Besides the possibility of infection on poultry species, the type A H5N1 influenza virus is also capable of infecting and killing people. Therefore, the surveillance of disease, circulation and genetic variation of type A H5N1 avian influenza virus has important implications for the development of poultry industry and human health protection. Oropharyngeal swab sample on healthy chickens (420 samples), on healthy ducks (936 samples) sold in markets, slaughterhouses and households; 144 tissue samples (brain, spleen, treachal, lung) of poultry with symptomatic, suspected case with type A H5N1 avian influenza were collected for testing. Swab and tissue samples from poultry were tested by Real time RT-PCR technique to determine the prevalence of virus and poultry infected by type A H5N1 avian influenza in 10 provinces in the Mekong Delta. HA gene sequence of 49 representative samples to determine the variation, evolution and genetic correlation of type A H5N1 avian influenza virus. Research results showed that the type A H5N1 avian influenza virus caused disease mainly in 1-3 months old poultry flocks, focusing on the first quarter of the year in unvaccinated or not enough dose as prescribed vaccinated flocks. The common symptoms type A H5N1 avian influenza infected poultry flocks were depression, anorexia, edema of the head, respiratory signs, leg paralysis, wings paralysis, green to white diarrhea, shanks hemorrhages; neurological sign and specific lesions such as brain hemorrhages; lungs hemorrhages; hemorrhages on heart perirenal; liver swelling, hemorrhages; spleen swelling, hemorrhages; trachea hemorrhages. The circulation of type A H5N1 avian influenza virus has been detected on chickens and ducks that sold in markets and slaughterhouses; non circulation of the type A H5N1 avian influenza virus on chickens and ducks at households. There was a change in the nucleotide level of type A H5N1 avian influenza viruses circulating and causing disease in poultry during the 2014- 2016 period and the rate of changes gradually increased by time. Type A H5N1 avian influenza viruses circulated and caused disease in poultry during this period in the provinces of the Mekong Delta belonging to clade 2.3.2.1d and had sequences of amino acids at cleavage sites from position 341 to 346 on protein HA is RRR-KR. At the same time, there was a change in amino iv
acid positions on HA protein, which increases the ability binding to α 2-6 receptors to bind to cells and cause disease in humans. There were some positions of amino acid as 82, 152, 185, 282 that play an important role in the pathogenicity of type A H5N1 avian influenza virus, changes kind of amino acids in these locations will alter the pathogenicity, the type A H5N1 avian influenza virus can switch the pathogen from poultry to human and vice versa. Keywords: Avian influenza, Type A H5N1, Chicken, Duck, Mekong delta, Nucleotide. v
Lor cAM xnr rnr euA T6i xin cam doan d6y ld c6ng trinh nghiCn criu cria ri6ng t6i, c6c ktit qu6 nghiOn ciru dugc trinh bdy trong lu4n 6n ld trung thgc, kh6ch quan vd chua tung dung aC Uao vQ o b6t kj,noi ddu. T6i xin cam doan ring moi su gifp d0 cho viQc thpc hiQn lufln 6n d6 dugc c6m on, c6c th6ng tin trich d6n trong lufln 6n ndy d6u dugc chi 16 ngu6n g6c. C6n bQ huring dfin Tic gii lufn 6n PGS.TS. Ly Thi Li6n Khai Ti6n Nggc Ti6n V1
MỤC LỤC Lời cảm tạ .........................................................................................................i Tóm tắt Tiếng Việt ........................................................................................... ii Tóm tắt Tiếng Anh ...........................................................................................iv Trang cam kết kết quả ......................................................................................vi Mục lục ........................................................................................................... vii Danh sách bảng ............................................................................................... x Danh sách hình............................................................................................... xiii Danh mục từ viết tắt........................................................................................ xv Chương 1 GIỚI THIỆU ................................................................................ 1 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 2.1 Sơ lược về bệnh cúm gia cầm .................................................................... 4 2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm ......................................................................... 4 2.3 Virus cúm gia cầm ..................................................................................... 7 2.3.1 Hình thái và cấu trúc ............................................................................... 7 2.3.2 Cấu trúc gene của virus cúm gia cầm ..................................................... 8 2.3.3 Kháng nguyên quan trọng của virus cúm gia cầm................................. 10 2.3.4 Cơ chế và đặc tính gây bệnh của virus cúm gia cầm ............................. 11 2.3.5 Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm gia cầm ......... 14 2.3.6 Sức đề kháng của virus cúm gia cầm..................................................... 16 2.3.7 Đường lây truyền ................................................................................... 16 2.3.8 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm gia cầm ................................. 17 2.3.9 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên trong tế bào vật chủ của virus cúm gia cầm .................................................................................................................. 17 2.3.10 Khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm ........................................ 19 2.4 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm ................................................ 20 2.4.1 Triệu chứng ............................................................................................ 20 2.4.2 Bệnh tích ................................................................................................ 20 2.4.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên thế giới ...................... 21 2.4.4 Bệnh cúm gia cầm type A H5N1 ở Việt Nam ....................................... 26 2.4.5 Bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên người ......................................... 31 2.5 Một số nghiên cứu về virus cúm gia cầm và bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên thế giới và ở Việt Nam.................................................................. 32 2.5.1 Trên thế giới ........................................................................................... 32 2.5.2 Việt Nam ............................................................................................... 38 2.6 Tình hình sử dụng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm type A H5N1 tại Việt Nam ................................................................................................................. 45 Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 48 vii
3.1 Nội dung nghiên cứu................................................................................. 48 3.1.1 Nội dung 1 ............................................................................................. 48 3.1.2 Nội dung 2 ............................................................................................. 48 3.1.3 Nội dung 3 ............................................................................................. 48 3.1.4 Nội dung 4 ............................................................................................. 48 3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 48 3.2.1 Thời gian ................................................................................................ 48 3.2.2 Địa điểm ................................................................................................. 48 3.3 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 48 3.3.1 Mẫu vật dùng trong nghiên cứu ............................................................. 48 3.3.2 Hóa chất và các chất sinh học chính sử dụng trong nghiên cứu ............ 49 3.3.3 Trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu...................................... 49 3.3.4 Biểu mẫu thu thập thông tin................................................................... 49 3.4 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 50 3.4.1 Phương pháp thu thập thông tin dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích, xét nghiệm, xây dựng bản đồ dịch tễ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 và khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long................................................................................................ 50 3.4.2 Phương pháp giải trình tự và phân tích trình tự gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên các đàn gia cầm khỏe mạnh nuôi tại các hộ chăn nuôi, buôn bán tại các chợ và các lò giết mổ gia cầm ... 56 3.4.3 Phương pháp xây dựng cây phả hệ từ các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được trong nghiên cứu và các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 đã công bố ở Việt Nam và thế giới .......................................... 58 3.4.4 Phương pháp phân tích trình tự acid amin trên protein HA để xác định đặc tính gây bệnh của virus cúm gia cầm type A H5N1 ................................ 60 3.4.5 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ................................................. 60 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 61 4.1 Kết quả khảo sát tình hình dịch tễ; triệu chứng, bệnh tích; xét nghiệm; xây dựng bản đồ dịch tễ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 và khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long ................................................................................................................ 61 4.1.1 Kết quả khảo sát tình hình dịch tễ; triệu chứng, bệnh tích; bệnh cúm gia cầm type A H5N1 năm 2014, 2015 và 2016. ................................................. 61 4.1.2 Kết quả xét nghiệm virus gây bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm tại các tỉnh ĐBSCL năm 2014, 2015 và 2016 ............................ 69 4.1.3 Kết quả xây dựng bản đồ dịch tễ về không gian các đàn gia cầm bị bệnh cúm gia cầm type A H5N1 ............................................................................. 71 viii
4.1.4 Kết quả khảo sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm khỏe nuôi tại các hộ chăn nuôi, các chợ và các lò giết mổ gia cầm .................................................................................................................. 76 4.2 Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên các đàn gia cầm khỏe tại các hộ chăn nuôi, các chợ và các lò giết mổ gia cầm ......................................................... 80 4.2.1 Kết quả giải trình tự gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên các đàn gia cầm khỏe tại các hộ chăn nuôi, các chợ và các lò giết mổ gia cầm .................................................................................... 80 4.2.2 Kết quả phân tích trình tự gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên các đàn gia cầm khỏe tại các hộ chăn nuôi, các chợ và các lò giết mổ gia cầm................................................................................ 81 4.3 Kết quả xây dựng cây phả hệ của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm phân lập được ở ĐBSCL năm 2014, 2015 và 2016 và các chủng virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam và thế giới ................................................................................................................. 114 4.4 Kết quả phân tích trình tự acid amin trên protein HA để xác định đặc tính gây bệnh của virus cúm gia cầm type A H5N1. ............................................ 120 4.4.1 Kết quả phân tích trình tự các acid amin ở vị trí quy định độc lực (HA0) của các chủng virus cúm gia cầm gây bệnh và lưu hành trên gia cầm năm 2014, 2015 và 2016 ........................................................................................ 120 4.4.2 Kết quả phân tích trình tự các acid amin trên protein HA để xác định đặc tính gây bệnh của các chủng virus phân lập được năm 2014, 2015 và 2016 123 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................... 162 5.1 Kết luận .................................................................................................... 162 5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 163 Tài liệu tham khảo ......................................................................................... 165 Phụ lục ........................................................................................................... 175 ix
DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các mốc thời gian chính của lịch sử bệnh cúm gia cầm 6 2.2 Chức năng cơ bản của các protein của virus cúm type A 10 H5N1 2.3 Kết quả khảo sát biến đổi bệnh tích bệnh cúm gia cầm 21 2.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh cúm trên gà và vịt qua các đợt dịch 29 2.5 Số ca bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên người ở thế giới 31 từ năm 2003-2016 3.1 Phân bố mẫu và số mẫu swab gia cầm lấy qua các năm tại 51 các tỉnh, thành phố 3.2 Hỗn hợp nguyên liệu (master mix) của phản ứng rRT – PCR 53 xác định virus cúm type A và subtype H5 3.3 Hỗn hợp nguyên liệu (master mix) của phản ứng rRT – PCR 54 xác định virus cúm subtype N1 3.4 Chương trình nhiệt chạy mẫu xác định virus cúm type A 54 3.5 Chương trình nhiệt chạy mẫu xác đinh virus cúm phân type 55 H5 và N1 3.6 Hỗn hợp nguyên liệu chạy nhân gene HA 57 3.7 Chương trình nhiệt chạy nhân gene HA 58 4.1 Thông tin dịch tễ về số lượng các đàn gia cầm mắc bệnh 61 cúm type A H5N1 tại một số tỉnh ĐĐBSCL theo loài 4.2a Tỷ lệ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên gà tại các tỉnh 62 ĐBSCL năm 2014, 2015 và 2016 theo lứa tuổi 4.2b Tỷ lệ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên vịt và vịt xiêm 63 tại các tỉnh ĐBSCL năm 2014, 2015 và 2016 theo lứa tuổi 4.3 Tỷ lệ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm 64 tại các tỉnh ĐBSCL theo tình trạng tiêm phòng vaccine 4.4 Tỷ lệ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm 65 tại các tỉnh ĐBSCL theo thời gian 4.5 Tỷ lệ bệnh cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm 66 tại các tỉnh ĐBSCL theo qui mô đàn 4.6 Tần suất xuất hiện các triệu chứng bệnh cúm gia cầm type A 67 H5N1 4.7 Tần suất xuất hiện các bệnh tích của bệnh cúm gia cầm type 68 AH5N1 4.8 Kết quả xét nghiệm virus gây bệnh cúm gia cầm type A 69 H5N1 tại các tỉnh ĐBSCL 4.9 Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên các 76 đàn gia cầm khỏe năm 2014, 2015 và 2016 4.10 Tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên các 78 x
đàn gia cầm khỏe tại các hộ chăn nuôi, tại các chợ và các lò giết mổ 4.11 Tỷ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 giai đoạn 79 2014-2016 theo loài 4.12 Kết quả giải trình tự gene HA của virus cúm gia cầm type A 80 H5N1 gây bệnh và lưu hành trên các đàn gia cầm khỏe tại các hộ chăn nuôi, các chợ và các lò giết mổ gia cầm 4.13 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 82 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được giữa năm 2014 và 2015 với chiều dài đoạn so sánh là 1.597 nucleotide 4.14 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 87 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được giữa năm 2014 và 2016 với chiều dài đoạn so sánh là 1.598 nucleotide 4.15 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 92 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được giữa năm 2015 và 2016 với chiều dài đoạn so sánh là 1.594 nucleotide 4.16 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 97 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được năm 2014 với các chủng virus lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới với chiều dài đoạn so sánh là 1.649 nucleotide 4.17 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 99 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được năm 2015 với các chủng virus lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới với chiều dài đoạn so sánh là 1.600 nucleotide 4.18 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 101 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A H5N1 giải trình tự được năm 2016 với các chủng virus lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới với chiều dài đoạn so sánh là 1.600 nucleotide 4.19 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 103 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn xi
gene HA giữa các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm năm 2015 với chiều dài đoạn gene so sánh là 1.600 nucleotide 4.20 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 105 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA giữa các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm năm 2016 với chiều dài đoạn gene so sánh là 1.600 nucleotide 4.21 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 107 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2014, 2015 và 2016 với chiều dài đoạn gene so sánh là 1.598 nucleotide 4.22 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 109 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành trên gia cầm năm 2015 và 2016 với chiều dài đoạn gene so sánh là 1.635 nucleotide 4.23 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 111 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus gia cầm type A H5N1 phân lập được trên gia cầm năm 2015 với các chủng virus cúm type A H5N1 gây bệnh trên người tại Việt Nam với chiều dài đoạn gene so sánh là 1.615 nucleotide 4.24 Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm (phía trên đường chéo) và số 112 lượng (phía dưới đường chéo) nucleotide sai khác trên đoạn gene HA của virus gia cầm type A H5N1phân lập được năm 2016 với các chủng virus cúm type A H5N1 gây bệnh trên người tại Việt Nam với chiều dài đoạn gene so sánh là 1.600 nucleotide 4.25 Kết quả phân tích trình tự các acid amin trên protein HA để 123 xác định đặc tính gây bệnh của các chủng virus phân lập được năm 2014 4.26 Kết quả phân tích trình tự các acid amin trên protein HA để 130 xác định đặc tính gây bệnh của các chủng virus phân lập được năm 2015 4.27 Kết quả phân tích trình tự các acid amin trên protein HA để 146 xác định đặc tính gây bệnh của các chủng virus phân lập được năm 2016 xii
DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc của virus cúm gia cầm 7 2.2 Vị trí liên kết của prorein HA của virus cúm 12 2.3 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm type 18 A ở tế bào chủ 2.4 Vaccine Navet-vifluvac phòng bệnh cúm gia cầm type A 46 H5N1 2.5 Vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 (Re 6) 46 3.1 Các đường chuẩn biểu diễn số lượng đơn vị huỳnh quang 56 của kỹ thuật rRT-PCR 4.1 Gà có biểu hiện xuất huyết da chân 68 4.2 Bản đồ dịch tễ các đàn gia cầm bị bệnh cúm gia cầm type 71 A H5N1 năm 2014 4.3 Bản đồ dịch tễ các đàn gia cầm bị bệnh cúm gia cầm type 72 A H5N1 năm 2015 4.4 Bản đồ dịch tễ các đàn gia cầm bị bệnh cúm gia cầm type 73 A H5N1 năm 2016 4.5 Bản đồ dịch tễ các đàn gia cầm bị bệnh cúm gia cầm type 74 A H5N1 năm 2014, 2015 và 2016 4.6 Vịt được bày bán tại chợ 77 4.7 Vị trí sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm type A 86 H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm tại các tỉnh, thành phố vùng Đồng bằng sông Cửu Long năm 2014 và 2015 4.8 Vị trí sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm 91 type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm tại các tỉnh, thành phố vùng Đồng bằng sông Cửu Long năm 2014 và 2016 4.9 Vị trí sai khác trên đoạn gene HA của virus cúm gia cầm 96 type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm tại các tỉnh, thành phố vùng Đồng bằng sông Cửu Long năm 2015 và 2016 4.10 Cây phả hệ các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 115 năm 2014 4.11 Cây phả hệ các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 116 năm 2015 4.12 Cây phả hệ các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 118 năm 2016 4.13 Trình tự các acid amin ở vị trí quy định độc lực (HA0) của 120 các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 năm 2014 4.14 Trình tự các acid amin ở vị trí quy định độc lực (HA0) của 121 các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 năm 2015 4.15 Trình tự các acid amin ở vị trí quy định độc lực (HA0) của 122 các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 năm 2016 4.16 Vị trí biến đổi của acid amin trên protein HA của virus cúm 125 gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2014 xiii
4.17 Vị trí biến đổi của acid amin trên protein HA của virus cúm 129 gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2014 so sánh với các chủng virus gây bệnh trên người tại Việt Nam 4.18 Vị trí biến đổi của acid amin trên protein HA của virus cúm 138 gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2015 4.19 Vị trí biến đổi của acid amin trên protein HA của virus cúm 145 gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2015 so sánh với các chủng virus gây bệnh trên người tại Việt Nam 4.20 Vị trí biến đổi của acid amin trên protein HA của virus cúm 154 gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2016 4.21 Vị trí biến đổi của acid amin trên protein HA của virus cúm 161 gia cầm type A H5N1 gây bệnh trên gia cầm năm 2016 so sánh với các chủng virus gây bệnh trên người tại Việt Nam xiv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT rRT – PCR: Real time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ADN: Acid deoxyribonucleic ARN: Acid ribonucleic AI: Avian influenza HPAI: High Pathogenic Avian Influenza LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza NA: Neuraminidase Antigen HA: Hemagglutination NP: Nucleoprotein WHO: World Health Organization ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long xv
Chương 1: GIỚI THIỆU Bệnh cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện tại Việt Nam từ cuối năm 2003 tại một số tỉnh như Hà Tây, Tiền Giang và Long An sau đó lan rộng ra hầu hết các tỉnh, thành trong cả nước làm chết và tiêu hủy hàng triệu gia cầm, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm của nước ta. Đặc biệt đối với các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với đặc điểm chăn nuôi vịt theo phương thức chạy đồng; chăn nuôi gà với quy mô hộ gia đình chiếm đa số và chăn nuôi nhiều loại gia cầm trong cùng một hộ gia đình nên nguy cơ lây truyền và nhiễm bệnh cúm gia cầm là rất cao. Đồng thời, với đặc điểm chăn nuôi như vậy nên gây rất nhiều khó khăn cho công tác tiêm phòng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm cho các đàn gia cầm. Bên cạnh đó, theo kết quả giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm cho thấy luôn có sự hiện diện của virus cúm gia cầm trên các đàn gia cầm nuôi và gia cầm bán tại các chợ buôn bán gia cầm sống. Trong những năm gần đây theo kết quả theo dõi sự biến đổi đặc tính di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 của Cục Thú y cho thấy chủng virus này đã thay đổi liên tục tạo ra các phân nhánh virus khác nhau (Cục Thú y, 2015). Do đó, công tác tiêm phòng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 cho các đàn gia cầm gặp rất nhiều khó khăn do khả năng đáp ứng miễn dịch giữa các phân nhánh virus H5N1 là khác nhau. Theo Cục Thú y (2015), về cơ bản virus cúm H5N1 phân nhánh 2.3.2.1 hiện lưu hành chủ yếu tại các tỉnh miền Bắc, miền Trung và một số tỉnh miền Nam; phân nhánh 1.1 lưu hành chủ yếu tại các tỉnh Miền Nam. Cụ thể phân nhánh virus 2.3.2.1 a hiện lưu hành tại các tỉnh gồm Bình Thuận, Cà Mau, Tây Ninh, Long An; phân nhánh virus 2.3.2.1b lưu hành tại tỉnh Lạng Sơn; phân nhánh virus 2.3.2.1c lưu hành tại các tỉnh Sơn La, Thái Nguyên, Hải Phòng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Quảng Ninh, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Khánh Hòa, Đăk Lăk, Lâm Đồng, Bình Thuận, TP. Hồ Chí Minh, Long An, Tây Ninh, Cà Mau, Cần Thơ, Sóc Trăng, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh; phân nhánh virus 1.1 lưu hành tại các tỉnh Bắc Ninh, TP. HCM, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Trà Vinh. Theo kết quả trên cho thấy một vài phân nhánh virus H5N1 mới đã xuất hiện ở một số tỉnh vùng ĐBSCL làm cho công tác phòng chống dịch cúm gia cầm ngày càng gặp nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, công tác lựa chọn vaccine phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 không đạt hiệu quả cao do có sự xuất hiện của nhiều nhánh virus H5N1 mới tại một số địa phương. Bên cạnh khả năng lây 1
nhiễm bệnh trên các loài gia cầm của virus cúm H5N1, chúng còn có khả năng lây nhiễm và gây tử vong trên người. Đặc biệt trong những năm trước đây tại một số tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long như Đồng Tháp, Kiên Giang, Sóc Trăng liên tục xảy ra các ca bệnh cúm gia cầm H5N1 trên người và gây tử vong với tỷ lệ cao, cụ thể từ năm 2012 đến 2013 có 03 ca nhiễm bệnh cúm gia cầm H5N1 trên người tại 03 tỉnh Đồng Tháp, Kiên Giang, Sóc Trăng và tỷ lệ tử vong là 100%. Trong tháng 01/2014 đã liên tục xảy ra 02 trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm type A H5N1 trên người tại tỉnh Bình Phước và Đồng Tháp và cả 02 ca nhiễm bệnh đều đã tử vong (Cục Y tế Dự phòng, 2015). Với đặc điểm lây lan nhanh, lưu hành trên các đàn gia cầm khỏe mạnh, xuất hiện các phân nhánh virus mới có khả năng biến đổi gây bệnh với tỷ lệ tử vong cao trên người của bệnh cúm gia cầm type A H5N1 thì việc phát hiện sớm, khống chế các ổ dịch, tiêu hủy gia cầm bị nhiễm bệnh, thực hiện các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi gia cầm, xác định đặc tính gây bệnh và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 là rất cấp thiết và có ý nghĩa rất quan trọng nhằm hạn chế tổn thất về kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Do vậy, nghiên cứu “Khảo sát đặc tính gây bệnh và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành tại Đồng bằng sông Cửu Long giai đoạn 2014-2016” được tiến hành. Mục tiêu của đề tài - Xác định các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm type A H5N1 và tỷ lệ lưu hành của virus cúm gia cầm type A H5N1 trên các đàn gia cầm khỏe mạnh nuôi tại các hộ chăn nuôi, buôn bán tại các chợ và tại các lò giết mổ gia cầm. - Xác định sự biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành tại các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - Xác định mối tương quan di truyền giữa các chủng virus cúm gia cầm type A H5N1 gây bệnh và lưu hành trên gia cầm; giữa các virus cúm gia cầm type A H5N1 phát hiện được trong nghiên cứu và các chủng virus cúm type A H5N1 đã công bố ở Việt Nam và thế giới. - Xác định đặc tính gây bệnh của các virus cúm gia cầm type A H5N1 tại các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên trình tự acid amin của protein HA. 2
Ý nghĩa của luận án Đây là công trình nghiên cứu về tình hình dịch tễ của bệnh cúm gia cầm type A H5N1 và biến đổi di truyền của virus cúm gia cầm type A H5N1, là cơ sở khoa học cho việc xây thực hiện các biện pháp phòng chống dịch bệnh có hiệu quả, giúp ngành chăn nuôi gia cầm phát triển và góp phần bảo vệ sức khỏe con người. Những điểm mới của luận án - Xác định được phân nhánh virus cúm gia cầm type A H5N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm trong giai đoạn 2014-2016 tại các tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long thuộc phân nhánh 2.3.2.1d. - Xác định được sự biến đổi ở các vị trí acid amin trên protein HA là yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng liên kết với thụ thể α 2-6 gắn kết vào tế bào và gây bệnh trên người. - Đã xác định được một số vị trí acid amin 82, 152, 185, 282 có vai trò quan trọng đối với đặc tính gây bệnh của virus cúm gia cầm type A H5N1, sự biến đổi loại acid amin ở những vị trí này có khả năng làm thay đổi tính gây bệnh, virus cúm gia cầm type A H5N1 có thể chuyển đổi khả năng từ gây bệnh trên gia cầm sang gây bệnh trên người và ngược lại. 3