Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu hệ gen phiên mã (Transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống

Chia sẻ: Chuheodethuong 09 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:147

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là giải mã hệ gen phiên mã (transcriptome) từ 4 mô (mô cơ, môt tim, mô gan tụy, mô gốc mắt) của tôm sú (Penaeus monodon), thiết lập cơ sở dữ liệu hệ phiên mã phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Sàng lọc các gen giả định liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. Xác định bộ SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu hệ gen phiên mã (Transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------- NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------- NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đinh Duy Kháng 2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh HÀ NỘI - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm2018 Tác giả luận án Nguyễn Giang Thu i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thiện luận án, cho phép tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Đinh Duy Kháng – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 3 đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, PGS.TS. Đồng Văn Quyền – Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, TS. Nguyễn Cường – Trưởng phòng Tin sinh học- Viện Công nghệ sinh học, cùng các anh chị em trong phòng đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Sáng, TS. Nguyễn Văn Hảo, TS. Đặng Tố Vân Cầm, cùng các anh chị em cán bộ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 2 đã cung cấp mẫu tôm cho nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo sau đại học đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Giang Thu ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... i DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... ii DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... iii MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 5 1.1. TÔM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM SÚ Ở VIỆT NAM........... 5 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú ..................................................................... 5 1.1.2. Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và Việt Nam ......................... 7 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ GEN PHIÊN MÃ CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI .......................................................... 11 1.2.1. Công trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ gen phiên mã của tôm . .................................................................................................. 12 1.2.2. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tôm thông qua việc phân tích hệ phiên mã .................................................................... 13 1.2.3. Xác định các gen có liên quan tới khả năng sinh sản của tôm ....... . . .................................................................................................. 14 1.2.4. Xác định các gen có liên quan tới giới tính của tôm sú............... 14 1.2.5. Nghiên cứu giải trình tự hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Thái Lan . .................................................................................................. 15 1.2.6. Nghiên cứu lập bản đồ gen tôm sú ở Đài Loan ........................... 16 1.2.7. Nghiên cứu giải mã hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Việt Nam .... . . .................................................................................................. 16 1.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP VÀ MICROSATELLITE ................... 18 1.3.1. Chỉ thị phân tử SNP ................................................................... 18
1.3.2. Chỉ thị phân tử Microsatellite..................................................... 21 1.4. TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ GEN DỰ ĐOÁN LIÊN QUAN Ở ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC .............................................. 25 1.4.1. Tính trạng tăng trưởng ............................................................... 25 1.4.2. Các nhóm gen ứng viên liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã được công bố trong nhóm giáp xác ........................................................ 26 1.4.3. Các nhóm gen ứng viên trong quá trình lột xác .......................... 32 1.4.4. Các gen phân giải và phát triển hệ cơ trong quá trình lột xác ..... 35 1.5. SƠ LƯỢC CÁC PHẦN MỀM LẮP RÁP SỬ DỤNG CHO CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI...................................... 38 1.5.1. Phân loại các phần mềm lắp ráp ................................................. 39 1.5.2. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen .............................................. 39 1.5.3. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen phiên mã .............................. 41 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 44 2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU............................................................ 44 2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ......................................................... 44 2.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................... 44 2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................... 47 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 47 2.5.1. Phương pháp tách riêng rẽ các mô nghiên cứu ........................... 48 2.5.2. Tách chiết RNA tổng số từ mô tôm bằng Trizol ......................... 48 2.5.3. Tách và tinh sạch mRNA ........................................................... 49 2.5.4. Thiết lập thư viện cDNA ............................................................ 50 2.5.5. Phương pháp tiền xử lý dữ liệu .................................................. 50 2.5.6. Phương pháp lắp ráp de novo hệ gen phiên mã .......................... 51 2.5.7. Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã .............. 51
2.5.8. Phương pháp chú giải chức năng của unigene trong hệ gen phiên mã ………………………………………………………………………53 2.5.9. Phương pháp phân tích biểu hiện hệ gen phiên mã ..................... 54 2.5.10. Xác định các SNP trong ngân hàng unigene ............................... 54 2.5.11. Xác định các microsatellite trong ngân hàng unigene................. 55 2.5.12. Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ................... 55 2.5.13. Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR) ...................... 56 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 57 3.1. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) ................. 57 3.1.1. Sàng lọc mẫu tôm sạch bệnh ...................................................... 57 3.1.2. Chuẩn bị thư viện cDNA............................................................ 58 3.1.3. Giải trình tự, đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự thô ....... 66 3.1.4. Lắp ráp và chú giải chức năng hệgen phiên mã .......................... 70 3.1.5. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm sú (Penaeus monodon)........................................................................... 78 3.2. SÀNG LỌC CÁC GEN GIẢ ĐỊNH (UNIGENE) LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) ............................................................................................ 85 3.2.1. Sàng lọc các unigene .................................................................. 85 3.2.2. Phân tích sự biểu hiện khác nhau của hệ gen phiên mã tôm sú (Penaeus monodon) ............................................................................... 90 3.3. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)TỪ DỮ LIỆU HỆ PHIÊN MÃ. ............................................................................................. 96
3.4. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG TỪ NHÓM TÔM SÚ GIA HÓA TĂNG TRƯỞNG NHANH VÀ TĂNG TRƯỞNG CHẬM ................................................................ 99 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 101 KẾT LUẬN ........................................................................................... 101 KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 102 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ................................................ 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 104 PHỤ LỤC.................................................................................................. 123
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt 3’UTR 3’ untranslated region (trình tự không dịch mã đầu 3’) cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung được tổng hợp từ mRNA) Contig Contiguous nucleotide sequence DNA deoxyribonucleic acid EC Enzyme commission IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (virus gây gệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô) MBV Monodon baculovirus (virus gây bệnh còi) Nr-NCBI Non redundant protein database-National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) RNA Ribonucleic acid RNA-seq RNA sequencing (giải trình tự RNA) TSV Taura syndrome virus (virus gây hội chứng Taura) WSSV White spot syndrome virus (virus gây hội chứng đốm trắng) YHV Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng) QC Quality score (Điểm chất lượng đánh giá trình tự) i
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu tôm sú thu từ vùng biển khác nhau của Nghệ An-Hà Tĩnh ..................................................................................................................... 45 Bảng 2.2: Thông tin về 10 mẫu tôm tăng trưởng nhanh và 10 mẫu tôm tăng trưởng chậm sử dụng trong phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome) ........ 46 Bảng 2.3: Cặp mồi sử dụng cho qPCR ......................................................... 56 Bảng 3.1: Nồng độ mRNA của các mô nghiên cứu ...................................... 61 Bảng 3.2: Nồng độ DNA sử dụng cho giải trình tự transcriptome bằng hệ thống Illumina MiSeq platform .................................................................... 62 Bảng 3.3: Mô tả bộ dữ liệu sau khi giải trình tự ........................................... 66 Bảng 3.4: Thống kê số lượng, độ dài trình tự đọc theo từng mô................... 68 Bảng 3.5: Thống kê kết quả lắp ráp hệ gen phiên mã tinh sạch từ các mô tôm sú Penaeus monodon .................................................................................... 70 Bảng 3.6: Thống kê kết quả chú giải chức năng tôm sú P.monodon ............ 72 Bảng 3.7: Thống kê kết quả các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú P.monodon. .................................................................................................. 81 Bảng 3.8: Thống kê miền lặp của các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú.................................................................................................................. 82 Bảng 3.9: Thống kê unigene liên quan đến tăng trưởng trong hệ gen phiên mã tôm sú .......................................................................................................... 87 Bảng 3.10: Sự biểu hiện của hệ phiên mã tôm sú ......................................... 91 Bảng 3.11: Thống kê một số SNPs được chú giải ở một số gen chính liên quan đến tính trạng tăng trưởng .................................................................... 97 ii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tôm sú thu được từ vùng biển Nghệ An, Việt Nam. ...................... 5 Hình 1.2: Sản lượng tôm sú của một số nước trên thế giới vào năm 2011 (Nguyễn Bích, 2013) ...................................................................................... 8 Hình 1.3: Mô hình SNP ............................................................................... 19 Hình 2.1: Mẫu tôm sú tự nhiên thu từ một điểm của vùng biển Nghệ An .... 44 Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................... 47 Hình 2.3: Tôm sú và hình ảnh giải phẫu ...................................................... 48 Hình 2.4: Cách tính N50. ............................................................................. 53 Hình 3.1: Minh họa chất lượng của RNA trên kết quả đo bằng Bioanalyzer (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample _prep_kit_v2/input_req.html) ....................................................................... 59 Hình 3.2: Mẫu RNA không thể hiện được chỉ số RIN trên máy Bioanalyzer (đánh dấu màu đỏ) ....................................................................................... 60 Hình 3.3: Xác định nồng độ cDNA mô tim bằng hệ thống Bioanalyzer ....... 63 Hình 3.4: Xác định nồng độ cDNA mô cơ và mô gan tụy bằng hệ thống Bioanalyzer .................................................................................................. 64 Hình 3.5: Xác định nồng độ cDNA mô gốc mắt bằng hệ thống Bioanalyzer 65 Hình 3.6: Kết quả đánh giá chất lượng dữ liệu trình tự đọc thô và dữ liệu trình tự đọc tinh sạch của các mô ................................................................. 69 Hình 3.7: Phân bố độ dài toàn bộ unigene trên hệ gen phiên mã tinh sạch ... 71 Hình 3.8: Thống kê kết quả chú giải BLASTX trên cơ sở dữ liệu NR-NCBI, A: Thống kê phân bố giá trị E-value, B: Thống kê phân bố độ tương đồng, C: Thống kê phân bố loài trong bộ kết quả tin cậy nhất (E-value thấp nhất)...... 74 Hình 3.9: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng Gene Ontology. ..................................................................................................... 76 Hình 3.10: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng COG. .... 77 iii
Hình 3.11: Thống kê 10 con đường chuyển hóa có số lượng unigene tham gia nhiều nhất ..................................................................................................... 78 Hình 3.12: Số lượng SNP ở các mô ............................................................. 79 Hình 3.13: Sự phân bố SNP trong các mô từ bộ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã . 80 Hình 3.14: Giao diện tìm kiếm SNP trên ngân hàng transcriptome tôm sú thu tại vùng biển Việt Nam ................................................................................ 83 Hình 3.15: Giao diện tìm kiếm microsatellite trên ngân hàng transcriptome tôm sú thu tại vùng biển Việt Nam ............................................................... 84 Hình 3.16. Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 125 unigene liên quan đến tính trạng tăng trưởng trên từng mô. ................... 93 Hình 3.17: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mô tim. ............................................................................................................... 94 Hình 3.18: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấytrong mô cơ. ..................................................................................................................... 94 Hình 3.19: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigenetop đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mô gan tụy. ............................................................................................................... 95 Hình 3.20: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mô gốc mắt......................................................................................................... 95 Hình 3.21: Đánh giá mức độ biểu hiện của unigen bằng qPCR.................... 96 Hình 3.22: Số lượng SNP trong nhóm tôm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm........................................................................................................... 100 iv
MỞ ĐẦU Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao và được nuôi phổ biến ở hơn 22 quốc gia trên thế giới như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ…Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ, với trên 600.000 ha diện tích nuôi, sản lượng mỗi năm đạt khoảng 300.000 tấn. Theo thông tin của Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu tôm tăng trưởng mạnh trong năm 2017, kim ngạch đạt 3,85 tỷ USD, tăng 22,3% so với năm 2016. Ở Việt Nam, tôm sú là đối tượng quan trọng thứ hai sau tôm thẻ chân trắng, với kim ngạch xuất khẩu chiếm khoảng 1/3 kim ngạch xuất khẩu về tôm nước lợ. Nghề nuôi tôm sú có ưu thế lớn là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, đóng góp quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước nhưng đang đối mặt với nhiều thách thức và có xu hướng giảm dần. Nguyên nhân chính của hiện tượng này là không chủ động được tôm bố mẹ do khai thác từ tự nhiên và các loại dịch bệnh tràn lan gây chết tôm hàng loạt. Nếu như trước năm 2003, đối tượng tôm nuôi chủ yếu ở châu Á là tôm sú, chiếm tới 80% thị phần trên toàn thể giới, thì từ năm 2004, tôm thẻ chân trắng từ châu Mỹ tràn sang với lợi thế là chủ động được tôm bố mẹ, tạo được đàn tôm giống sạch bệnh đã lấn át dần tôm sú. Tại Thái Lan, tỷ lệ phần trăm giữa tôm sú/tôm thẻ chân trắng năm 2003 là 60/40, thì đến nay chỉ còn khoảng 1/99. Chiến lược phát triển lâu dài của các nước còn diện tích nuôi tôm sú trong đó có Việt Nam là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường sinh thái. Nền tảng cho chiến lược phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục 1
đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Nghiên cứu hệ gen tôm sú sẽ cung cấp thông tin chính xác cho việc xác định các tính trạng quan trọng như: tính trạng tăng trưởng, tính kháng bệnh, tính chống chịu với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến chất lượng tôm. Do kích thước hệ gen tôm sú khá lớn, ước tính khoảng 2,17 Gb, nên việc giải mã toàn bộ hệ gen tôm sú đòi hỏi thời gian và tốn nhiều kinh phí. Vì vậy, để có thể từng bước khai thác các thông tin cần thiết từ hệ gen tôm sú, đặc biệt là khai thác các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống thì việc giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mãvới phương pháp xác định trình tự gen thế hệ mới NGS (Next generation sequencing), chú giải chức năng gen và sàng lọc các chỉ thị phân tử liên quan tới các tính trạng quan trọng như tăng trưởng nhanh, chống chịu bệnh tốt...để phục vụ công tác chọn giốnglà cách tiếp cận hợp lý và khả thi. Với những luận cứ nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ gen phiên mã (Transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống”. Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu chung: Nghiên cứu phân tích hệ gen phiên mã của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống. Mục tiêu cụ thể: 2
- Giải mã hệ gen phiên mã (transcriptome) từ 4 mô (mô cơ, môt tim, mô gan tụy, mô gốc mắt) của tôm sú (Penaeus monodon), thiết lập cơ sở dữ liệu hệ phiên mã phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Sàng lọc các gen giả định liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. - Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. - Xác định bộ SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Thu nhận mẫu tôm sú gia hóa và tôm sú tự nhiên từ vùng biển Việt Nam. - Kiểm tra, đánh giá, sàng lọc để lựa chọn các mẫu tôm sú không bị nhiễm một số bệnh nguy hiểm theo tổ chức sức khỏe động vật thế giới (World Organisation for Animal health – OIE) như bệnh đốm trắng (WSSV), hoại tử gan tụy cấp (IHHNV), đầu vàng (YHV), bệnh còi (MBV) và bệnh taura(TSV). - Tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tạo thư viện cDNA cho 4 mô (gan tụy, tim, cơ và gốc mắt). - Giải trình tự gen hệ phiên mã transcriptome từ 4 mô của tôm sú, phân tích và đánh giá chất lượng dữ liệu thu nhận được. - Xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú Việt Nam. - Sàng lọc các gen giả định từ hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng trưởng. - Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. - Xác định các SNP từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng trưởng. 3
- Xác định các SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Lần đầu tiên ở Việt Nam xây dựng được Cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên (http://www.tomsu.ibt.ac.vn)trên cơ cở giải mã và phân tích 04 mô (cơ, gan tụy, tim và gốc mắt). Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo ở tôm sú nuôi và tôm sú tự nhiên thu tại vùng biển Việt Nam. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học Các thông tin khoa học về hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên thu tại vùng biển Việt Nam có nghĩa khoa học lớn đối với các nghiên cứu tiếp theo về tôm sú. Kết quả khoa học nghiên cứu này (bài báo đăng trên tạp chí quốc tế Aquaculture) đã được hàng trăm công trình đọc, trích dẫn và các tác giả đã được mời báo cáo tham luận tại các hội nghị quốc tế về nuôi trồng thủy sản. Ý nghĩa thực tiễn Luận án tạo được cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã ở tôm sú tự nhiên và bước đầu phân tích hệ gen phiên mã tôm sú tăng trưởng nhanh và chậm, tìm kiếm các chỉ thị phân tử SNP chỉ có ở tôm tăng trưởng nhanh với mục tiêu có được bộ chỉ thị phân tử chất lượng để phát triển các chip sử dụng trong nghiên cứu tạo giống tôm sú bố mẹ sạch bệnh, sức sinh sản cao, tăng trưởng tốt bằng công nghệ “Nghiên cứu tương quan toàn phần hệ gen” (GWAS, Genome Wide Association Study). 4
CHƯƠNG I. T TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÔM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM SÚ Ở VIỆT T NAM 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Tôm sú là mộtt trong các loài tôm nuôi quan trọng tr thuộcc hhọ Penaeidae, và được phân loại(Holthuis, (Holthuis, 1980; Thái Trần Tr Bái, 2013)như sau:: Ngành: Arthropoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Bộ: Decapoda (Mười (Mư chân) Họ: Penaeidae (Tôm he) Chi: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên tiếng ng Anh: Black Tiger Shrimp Tên địaa phương: Tôm Sú Hình 1.1: Tôm sú thu đư được từ vùng biển Nghệ An, Việtt Nam. Về đặc điểm sinh học, h tôm sú là loài sống ở nơi chấtt đáy bùn pha với v cát ở độ sâu ven bờ đến n 40 m nước nư và độ mặn từ 5 – 34‰. ‰. Tôm sú sinh trư trưởng nhanh, trong 3 – 4 tháng có th thể đạt cỡ trung bình 40 – 50 g. Tôm sú thu thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước th lớn hơn con đực ở cùng đđộ tuổi. Tôm 5
trưởng thành tối đa với con cái có chiều dài từ 220 – 250 mm, trọng lượng đạt từ 100 – 300 g, con đực dài từ 160 – 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 – 200 g. Tôm có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác. Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ (Nguyễn Văn Chung và Phạm Thị Dự, 1995; Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và trọng lượng. Sau mỗi lần lột xác, tôm sú tăng trưởng về chiều dài và trọng lượng trung bình từ 10-15% so với trước khi lột xác. Quá trình này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và các giai đoạn phát triển của cá thể (Nguyễn Văn Chung và Phạm Thị Dự, 1995; Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng. Có hai đặc điểm cần chú ý trong vòng đời tôm sú: tăng trưởng ở giai đoạn hậu ấu trùng xảy ra ở vùng cửa sông (đặc trưng bởi vùng nước lợ); sự thành thục sinh dục, kết cặp xảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối dao động từ 28-34 ‰ và ổn định. Sau khi trứng tôm sú được đẻ 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-280C sẽ nở thành ấu trùng. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ. Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) chuyển sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tôm giống (juvenile) và bơi ra biển tiếp tục chu trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản của chúng (Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). 6
1.1.2. Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và Việt Nam 1.1.2.1. Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới Tổng quan lịch sử phát triển của ngành nuôi tôm, có hai đối tượng quan trọng là: tôm sú - bắt đầu từ các nước châu Á, ngay đầu những năm của thập niên 80 và tôm he Nam Mỹ - từ những năm giữa thập niên 80. Ngành nuôi tôm sú của thế giới phát triển nhanh chóng vào cuối những năm 1980 đến đầu những năm 2000 với sản lượng cao nhất là 700.000 tấn vào năm 2003 (Aziz và cs., 2011). Ở Châu Á, nghề nuôi tôm đã có từ lâu với mô hình nuôi truyền thống, năng suất thấp và chỉ tiêu thụ nội địa. Việc xuất khẩu sản phẩm tôm nuôi chỉ hình thành trong những năm giữa thập kỷ 70. Với những tiến bộ về kỹ thuật nuôi và công nghệ chế biến thức ăn thủy sản thì công nghiệp nuôi thủy sản bắt đầu phát triển mạnh ở những thập kỷ tiếp theo. Năm 1975, sản lượng tôm nuôi công nghiệp chỉ chiếm 2,5% tổng sản lượng tôm của thế giới. Trong những năm của thập kỷ 90, sản lượng tôm nuôi công nghiệp đã tăng lên 30%. Ngày nay, sản lượng tôm nuôi chiếm 3-4% tổng sản lượng thủy sản nuôi nhưng chiếm 15% tổng giá trị của thế giới. Các nước châu Á như Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Ấn độ, Việt Nam là những nước sản xuất tôm chủ yếu, sản xuất 80% sản lượng tôm và Nam Mỹ sản xuất khoảng 20% sản lượng. Theo một khảo sát gần đây,tôm thẻ chân trắng chiếm tỷ trọng 80% và tôm sú 20%, mặc dù trước năm 2003 tỷ lệ này là 60:40 và giữa những năm của thập niên 90 thì tỷ lệ đó là 25:75. Tôm thẻ chân trắng đã được du nhập vào các nước châu Á một cách ồ ạt để thay thế tôm sú. Sản lượng tôm thẻ chân trắng của Trung Quốc, Thái Lan, Indonexia đã vượt trên 1,5 triệu tấn (Nguyễn Hữu Ninh, 2010). 7
Các chuyên gia cho rằng, sở dĩ tôm chân trắng được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới là do công nghệ gia hoá thành công cũng như tạo được đàn lớn tôm bố mẹ sạch bệnh. Cùng lúc, sản lượng tôm sú (có nguồn gốc chủ yếu từ châu Á) lại liên tục giảm, mặc dù hơn 20 năm qua, kinh nghiệm và kết quả nuôi tôm sú của các nước châu Á đã thu được nhiều thành công đáng kể, giá cả luôn cao hơn và được nhiều thị trường ưa chuộng hơn. Sự giảm sút sản lượng cũng như việc các nước châu Á từ bỏ đối tượng bản địa quan trọng này, theo các chuyên gia, chủ yếu là do chưa gia hoá và kiểm soát được dịch bệnh nên không đảm bảo chất lượng tốt của con giống. Trong lịch sử phát triển tôm sú, có ba quốc gia và vùng lãnh thổ là Đài loan, Trung Quốc, Thái Lan đã từng đạt đỉnh cao của công nghệ nuôi tôm sú, sản lượng cao nhất nhưng cuối cùng cũng bịthất bại và chuyển sang nuôi tôm chân trắng. Tuy nhiên, Việt Nam vẫn duy trì tốt tỷ trọng nuôi tôm sú và đã trở thành quốc gia nuôi tôm sú đứng đầu thể giới (Nguyễn Bích, 2013). Hình 1.2:Sản lượng tôm sú của một số nước trên thế giới vào năm 2011(Nguyễn Bích, 2013) Trong số các hướng nghiên cứu về lĩnh vực nuôi tôm được thực hiện trong ba thập niên qua, có lẽ nghiên cứu công nghệ sản xuất tôm giống nhằm 8