Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobaccilus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:142

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra; xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu đạt hiệu quả cao trong phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobaccilus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ĐỖ TẤT ĐẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ĐỖ TẤT ĐẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN 2. PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ HÀ NỘI, 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Đỗ Tất Đạt i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và PGS.TS. Cù Hữu Phú đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Công ty CP thuốc thú y Marphavet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp và các cơ quan đoàn thể đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Đỗ Tất Đạt ii
MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục .............................................................................................................................. i Danh mục các chữ viết tắt................................................................................................. v Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ................................................................................................................. ix Trích yếu luận án .............................................................................................................. x Thesis abstract................................................................................................................. xii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................ 3 1.2.1. Mục tiêu chung ..................................................................................................... 3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................... 3 1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 3 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 4 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 4 1.5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 4 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................... 4 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin phòng bệnh ............................................................................................................ 5 2.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin phòng bệnh .......................................................................................................... 12 2.3. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi ở lợn............... 14 2.3.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae .......................................................................... 14 2.3.2. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ở lợn ....................... 17 2.4. Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh viêm phổi ở lợn ................................. 19 2.4.1. Vi khuẩn P. multocida ........................................................................................ 19 2.4.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra ........................................ 21 i
2.5. Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn ......................... 25 2.5.1. Vi khuẩn S. suis .................................................................................................. 25 2.5.2. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn ................................................................. 29 2.6. Các chất bổ trợ thường dùng trong sản xuất vacxin ........................................... 30 2.6.1. Chất bổ trợ của vacxin ........................................................................................ 30 2.6.2. Muối khoáng ....................................................................................................... 33 2.6.3. Chất nhũ tương ................................................................................................... 33 2.6.4. Cytokine .............................................................................................................. 35 2.6.5. Saponin ............................................................................................................... 35 2.6.6. Các chất cao phân tử ........................................................................................... 35 Phần 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................... 36 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 36 3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 36 3.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 36 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 37 3.4.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra .......................... 37 3.4.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................ 37 3.4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra................................................................................................................... 37 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 38 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. mutocida và S. suis gây ra ........ 38 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................. 41 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................. 43 ii
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 50 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 51 4.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra .................... 51 4.1.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pneumoniae gây ra ............................................................. 51 4.1.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra ................................................................ 54 4.1.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ........................................................................... 56 4.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ....................................................................................................... 59 4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ............................ 59 4.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra .......................................... 65 4.2.3. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra .................................................... 70 4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ....................................................................................................... 75 4.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra................................................................................................................... 75 4.3.2. Kết quả đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm ........................................... 77 4.3.3. Kết quả so sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis .......................................................................................... 83 4.3.4. Kết quả xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn ............................................... 90 4.3.5. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn ............................................................................... 92 iii
4.3.6. Kết quả xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn............................................................................ 99 Phần 5. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 103 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 103 5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 104 Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án .......................... 105 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 106 Phụ lục.......................................................................................................117 iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ aa Amino acid A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae BHI Brain Heart Infusion BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Bp Base pair CI Confidence Interval CHLB Cộng hòa liên bang cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acide dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization HT Huyết thanh KHKT Khoa học kỹ thuật M. hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae NAD Nicotinamide adenine dinucleotide NXB Nhà xuất bản OIE Office International des Epizooties P. multocida Pasteurella multocida PCR Polymerase Chain Reaction PLLO Pleuropneumonia-like organism RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction S. suis Streptococcus suis TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam THB Todd Hewitt Broth TN Thí nghiệm TSB Tryptic Soy Broth TT Thông tư v
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ TYE Tryptone Yeast Extract Broth TW Tryptone water USA United States of America USD United States dollar VNUA Vietnam National University of Agriculture vi
DANH MỤC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang 3.1. Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. pleuropneumoniae .................. 39 3.2. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của Pasteurella multocida............................................................................................................... 40 3.3. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của Streptococcus suis theo tiêu chuẩn quốc gia- TCVN 8400-2:2010 ................................................................... 40 3.4. Thành phần phản ứng ........................................................................................... 40 3.5. Chu trình nhiệt ...................................................................................................... 40 3.6. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba loại độc tố Apx của A. pleuropneumoniae ............................................................................. 41 3.7. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của Streptococcus suis .................................................................................... 42 3.8. Trình tự các mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7, 9 của Streptococcus suis ........................................................................................................................ 42 4.1. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn A. pleuropneumoniae ...... 51 4.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm A. pleuropneumoniae............................................................................................ 52 4.3. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn P. multocida................ 54 4.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm P. multocida.......................................................................................................... 55 4.5. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn S. suis ......................... 56 4.6. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm S. suis ........ 58 4.7. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất A. pleuropneumoniae ..... 61 4.8. Kết quả xác định gen sản sinh độc tố của giống sản xuất A. pleuropneumoniae....... 62 4.9. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn A. pleuropneumoniae ...... 65 4.10. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất P. multocida ................... 67 4.11. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất P. multocida ....................... 68 4.12. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn P.multocida ............. 70 4.13. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất S. suis ............................. 72 4.14. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất S. suis ................................. 73 4.15. Kết quả xác định serotype của các chủng S. suis ................................................. 74 vii
4.16. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn S. suis ...................... 74 4.17. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp lên men sục khí ........................... 76 4.18. Kết quả kiểm tra đậm độ, thuần khiết và vô trùng của lô giống đơn giá.............. 77 4.19. Kết quả kiểm tra thuần khiết và vô trùng của vacxin đa giá bán thành phẩm ...... 78 4.20. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên chuột nhắt trắng ........ 79 4.21. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên lợn ............................ 79 4.22. Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế ................................................................................................................. 80 4.23. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin trên lợn bằng phương pháp trọng tài ............... 82 4.24. Kết quả kiểm tra kháng thể trên lợn tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng viêm phổi lợn kháng lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, serotype 5a, serotype 5b), P. multocida (serotype A, serotype B), và S. suis serotype 2 ......... 84 4.25. Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu bằng phương pháp ELISA ............................................................................................. 86 4.26. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu ....................................... 88 4.27. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu ................................................. 89 4.28. Kết quả xác định kháng thể ở lợn tiêm vacxin với liều tiêm khác nhau .............. 90 4.29. Kết quả thử hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 18 - 25oC trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế (Canh trùng tiêm: A.pp + P. multocida + S. suis) ............................................................................................................. 101 4.30. Kết quả thử hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 4o- 8oC trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế. ...................................................................... 102 viii
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu .................... 44 4.1. Một số bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm A.pleuropneumoniae ............. 52 4.2. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn A. pleuropneumoniae ................ 53 4.3. Một số bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm P. multocida ......................... 55 4.4. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn P. multocida .............................. 56 4.5. Một số triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm S. suis ... 58 4.6. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định S. suis ....................................................... 59 4.7. Khuẩn lạc A. pleuropneumoniae và thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi ........ 60 4.8. Sản phẩm PCR xác định độc tố Apx của A. pleuropneumoniae .......................... 63 4.9. Vi khuẩn A1 là A. pleuropneumoniae và có chứa gen apxIICA, apxIIICA, apxIBD và apxIIIBD ............................................................................................ 63 4.10. Vi khuẩn A2 là A. peuropneumoniae và có chứa gen apxICA, apxIICA và apxIBD ................................................................................................................. 63 4.11. Vi khuẩn A3 là A. pleuropneumoniae và có chứa gen apxIIICA, apxIBD và apxIIIBD ............................................................................................................... 64 4.12. Khuẩn lạc P. multocida và thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi ...................... 66 4.13. Sản phẩm của phản ứng PCR xác định serotype của P. multocida ...................... 68 4.14. Mẫu P4 là vi khuẩn P. multocida thuộc Serotype A ............................................ 69 4.15. Mẫu P5 là vi khuẩn P. multocida thuộc Serotype D ............................................ 69 4.16. Khuẩn lạc S. suis và thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi ................................ 71 4.17. Vi khuẩn St là vi khuẩn S. suis và có chứa gen sly, mrp và arcA ....................... 73 ix
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Đỗ Tất Đạt Tên luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra. Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu đạt hiệu quả cao trong phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và giám định đặc tính sinh hóa. - Phương pháp PCR xác định Actinobacillus pleuropneumoniaevà các độc tố của vi khuẩn. - Phương pháp PCR xác định Pasteurella multocida và các serotype của vi khuẩn. - Phương pháp PCR xác định Streptococcus suis serotype 2 và các độc tố của vi khuẩn. - Phương pháp đánh giá độc lực vi khuẩn trên chuột và lợn. - Phương pháp chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu. - Phương pháp kiểm nghiệm vacxin. - Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả chính và kết luận Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra Các chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis được lựa chọn để gây bệnh thực nghiệm trên lợn đều có độc lực cao, gây chết lợn trong thời gian ngắn. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn gây nhiễm Actinobacillus pleuropneumoniae bao gồm: sốt, khó thở, ho, hắt hơi, bỏ ăn, x
viêm dính phổi và thành ngực, bọt khí nhầy lẫn máu nhiều trong khí quản. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn gây nhiễm Pasteurella multocida bao gồm: sốt, ho, thở khó, da đỏ tím và viêm phổi thùy. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn gây nhiễm Streptococcus suis bao gồm: sốt, ho, thở khó, có triệu chứng thần kinh, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra Giống sản xuất của các chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis được kiểm tra sự ổn định về đặc tính sinh học và đều đạt tiêu chuẩn về đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh hóa cũng như yếu tố độc lực. Kết quả nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra Quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bao gồm các bước như sau: - Sản xuất kháng nguyên Actinobacillus pleuropneumoniae - Sản xuất kháng nguyên Pasteurella multocida - Sản xuất kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2 - Pha trộn các loại kháng nguyên với nhũ dầu IMS để chế tạo bán thành phẩm - Kiểm nghiệm bán thành phẩm với các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực Quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn như sau: - Lợn từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa: tiêm 1 mũi 1 duy nhất: 2 ml/con cho lợn 21 đến 28 ngày tuổi. - Lợn nái chửa: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau: + Mũi 1: 2 ml/con, tiêm cho lợn nái chửa trước khi đẻ 1 tháng + Mũi 2: 2 ml/con, sau mũi 1: 7 đến 10 ngày - Lợn đực giống: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau: + Mũi 1: 2 ml/con + Mũi 2: 2 ml/con cách mũi tiêm 1 từ 7 đến 10 ngày. xi
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Do Tat Dat Thesis title: Study on pathological features of swine pneumonia caused by Actinobaccilus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis and vaccine development. Major: Veterinary pathology and therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 9.64.01.02 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Identify pathological characteristics of pigs infected with Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis. Building the process of producing and using inactivated multiple oil-emulsion vaccine with oil emulsions, which are the most effective. Materials and Methods - Bacterial culturing and biochemical characterization tests - PCR for determining Actinobacillus pleuropneumoniaeand bacterial toxins - PCR for determining Pasteurella multocida and bacterial serotypes - PCR for determining Streptococcus suis serotype 2 and bacterial toxins - Virulent tests in mice and pigs - Producing inactivated multiple vaccine with oil emulsifiers - Vaccine testing method - Data analysis Main findings and conclusions Research results of clinical symptoms, gross lesions of pigs infected by Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis The strains of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis selected to cause experimental disease in pigs are highly pathogenic and cause death in a short time. Clinical symptoms and general lesions of pigs infected with Actinobacillus pleuropneumoniaeinclude: Fever, breathing difficulty, cough, sneezing, anorexia, pleurisy, mucous and blood bubbles in the trachea. Clinical symptoms and general lesions of pigs infected with Pasteurella multocida include fever, cough, breathing difficulty, purple-red skin and lobar pneumonia. Clinical symptoms and general xii
lesions of pigs infected with Streptococcus suis include fever, cough, breathing difficulty, neurological symptoms, pneumonia, arthritis, meningitis. Results of evaluating the stability of biological properties of the working seeds of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis Working seeds of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis tested for biological stability all met the criteria of culture, morphology, biochemistry as well as virulence factors. Results of research on process of producing inactivated oil-emulsion polyvalent vaccine to prevent respiratory disease in pigs caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis The process of manufacturing inactivated multiple vaccines includes the following steps: - Producing antigen of Actinobacillus pleuropneumoniae - Producing antigen of Pasteurella multocida - Producing antigen of Streptococcus suis serotype 2 - Mix antigens with IMS oil emulsion to make semi-finished products - Testing of semi-finished products for sterility, purity, safety and potency The process of using inactivated oil emulsion multiple vaccines to prevent pneumonia in pigs is as follows: - Pigs from 21 days of age, after weaning: Only onetime injection: 2ml/pig of 21 to 28 days old. - Pregnant sows: 2 injections a year, each is seperated into 2 different injections: + The 1st injection: 2 ml/pig, give pregnant sows a month before farrowing + The 2nd injection: 2 ml/pig after 7 - 10 days - Boars: 2 injections a year, each is seperated into 2 different shots: + The 1st injection: 2 ml/pig + The 2nd injection: 2 ml/pig after 7 - 10 days xiii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong ngành công nghiệp chăn nuôi ở Việt Nam thì chăn nuôi lợn đóng vai trò quan trọng. Tính đến đầu năm 2020, mặc dù ngành chăn nuôi lợn nước ta đã phải trải qua đợt dịch tả lợn Châu Phi gây thiệt hại nặng nề, tổng số lợn trong cả nước vẫn còn khoảng 20 triệu lợn (Tổng cục Thống kê, 2020). Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn vẫn luôn phải gánh chịu nhiều thiệt hại do những bệnh truyền nhiễm khác gây ra, vì vậy việc phòng chống bệnh nhằm giảm thiệt hại, nâng cao năng suất chăn nuôi luôn cần được coi trọng, phòng bệnh bằng vacxin là một trong những giải pháp quan trọng. Trong các bệnh thường gặp trên lợn, những bệnh về đường hô hấp được xếp vào nhóm bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bệnh đường hô hấp ở lợn hiện nay nguyên nhân do nhiều mầm bệnh gây ra, trong đó có cả sự kết hợp của virus và vi khuẩn gây bệnh, khiến việc điều trị bệnh gặp không ít khó khăn. Trong số những vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp ở lợn, vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae), Pasteurella multocida (P. multocida) và Streptococcus suis (S. suis) thường gây viêm phổi kế phát, giết chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn sau cai sữa, gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta (Cù Hữu Phú & cs., 2005). Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công ty khác nhau nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra, như vacxin Porcilis phòng bệnh phổi cho lợn do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae), P. multocida serotype A, D và Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) gây ra của Intervet sản xuất, vacxin M+ PAC và vacxin Myco Shield phòng bệnh do vi khuẩn M. hyopneumoniae gây ra của Intervet sản xuất, vacxin Bayovac SuiShot của hãng Bayer chế tạo là vacxin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi cho lợn trên 5 tuần tuổi đã sử dụng 2 chủng A.pleuropneumoniae serotype 2, 5 và 1 chủng P. multocida serotype D; Vacxin Coglapix phòng bệnh viêm phổi cho lợn do A. pleuropneumoniae nhưng không ghi rõ là serotype sử dụng chế vacxin; vacxin Hyogen phòng viêm phổi địa phương do M. hyopneumoniae ... vv. Như vậy, các vacxin nhập ngoại đã và đang được sử dụng tại các trang trại chăn nuôi lợn ở nước ta là vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn 1
được chế tạo từ chủng vi khuẩn Actinobacillus hoặc M. hyopneumoniae, P. multocida nhưng các chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin chưa hoàn toàn phù hợp với những nguyên nhân gây bệnh viêm phổi ở lợn tại thực địa, đồng thời vacxin nhập ngoại lại có giá thành cao. Tại Việt Nam vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P.multocida gây ra là kế thừa và phát triển từ đề tài cấp Nhà nước kết quả nghiên cứu của Dự án SXTN đã được nghiệm thu năm 2014 và đưa vào sản xuất của Viện Thú y. Hiện nay ở nước ta duy nhất có công ty Marphavet sản xuất và được phép lưu hành vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ keo phèn để phòng viêm phổi cho lợn từ 4 tuần tuổi trở lên trên phạm vi cả nước. Vacxin được chế tạo là vacxin đa giá vô hoạt bao gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida là nguyên nhân chủ yếu chủ yếu gây bệnh viêm phổi ở lợn. Tuy nhiên việc sử dụng bổ trợ keo phèn trong chế tạo vacxin vẫn có những hạn chế nhất định về hiệu lực, khả năng gây đáp ứng và độ dài miễn dịch chưa cao. Hiện nay tại Việt Nam chưa có vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis. Vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu sẽ làm tăng hiệu lực phòng bệnh của vacxin, liều vacxin tiêm giảm, đặc biệt là thời gian miễn dịch của vacxin được kéo dài hơn nhiều nhờ phức hợp nhũ kháng nguyên. Trong quá trình điều tra nghiên cứu vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn của tác giả Cù Hữu Phú (2011), Nguyễn Thị Thu Hằng & cs. (2009), Lê Văn Dương (2013) đã xác định được những vi khuẩn gây bệnh viêm phổi ở lợn tại nước ta chủ yếu là do những vi khuẩn sau: (1) vi khuẩn A. pleuropneumoniae gồm 3 chủng: 2, 5a, 5b; (2) vi khuẩn P. multocida gồm 2 chủng A, D và (3) vi khuẩn S. suis serotype 2. Xuất phát từ tình hình thực tiễn của sản xuất, đáp ứng được cơ sở khoa học cho việc phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn, việc nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis và sử dụng vacxin phòng chống bệnh là yêu cầu cần thiết, nhằm đưa ra các giải pháp phòng trị bệnh viêm phổi ở lợn hiệu quả cao, giảm thiệt hại cho nghành chăn nuôi lợn. 2
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bằng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. - Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho người chăn nuôi. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu - Bộ giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b ; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được sử dụng làm giống gốc (Master seed) lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet. - Lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu các đặc tính vi sinh vật hóa học, cấu trúc kháng nguyên, độc lực và khả năng sử dụng làm chủng giống sản xuất vacxin của các vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet. Địa điểm nghiên cứu gồm: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn GMP WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020 3