Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:135

Thêm vào BST

Báo xấu

81
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh. Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắcxin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC- XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Công Hoạt PGS.TS. Lê Văn Năm Hà Nội, năm 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Công Hoạt (Bộ Khoa học và Công nghệ), PGS. TS. Lê Văn Năm (Hội đồng chức danh giáo sư nhà nước), PGS.TS Phạm Thị Tâm (Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế, Viện Đại học Mở Hà Nội) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính, cơ sở vật chất, trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này. Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thanh ii
MỤC LỤC Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................... vii Danh mục bảng................................................................................................. ix Danh mục hình .................................................................................................. x MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú ....................................................... 4 1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú ....................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm phân bố.................................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng .............................................................................. 5 1.1.4. Đặc điểm sinh sản ................................................................................... 6 1.1.5. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú ......................................................... 6 1.2. Ýnghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú ..................................................... 7 1.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam10 1.3.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển....................................10 1.3.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới ................ 12 1.3.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam .......... 15 1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá ................ 17 1.4. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ...................................... 21 1.5. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú .................... 25 1.6. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá27 1.6.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh .................................. 27 1.6.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới ................ 30 1.6.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam ............... 34 CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 37 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................ 37 iii
2.2. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................38 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38 2.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú ................................................................................................ 38 2.3.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu ........................................................... 38 2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học ................................................................. 38 2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào....... 39 2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số ................................................. 40 2.3.1.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)..............................41 2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose ................................................... 41 2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: ............................................................... 41 2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV).............................................................................................................. 45 2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1................ 45 2.3.2.2. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú ......................... 46 2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1 ................................................................................................ 47 2.3.2.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú................................................................................................... 48 2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp ............................... 48 2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen ................. 48 2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+.......................................................... 49 2.3.3.3 Chuyển gen vào E. coliJM109 ............................................................ 49 2.3.3.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn. .................................................................. 50 2.3.3.5 Nuôi cấy E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4............ 51 2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE ...................................................... 51 2.3.3.7. Phương pháp Western blot ................................................................. 52 iv
2.3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp ............................................................................................. 53 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 57 3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam ..... 57 3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học ........................................................................................... 57 3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR .................................................................................................. 59 3.1.3. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào ..................................................... 62 3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV. ......................... 67 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú ........................................................................................................ 72 3.2.1. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào mẫn cảm72 3.2.2. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú ............ 73 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1. ............................................................................ 75 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú ........................................................................................ 77 3.3. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. ....................................................... 80 3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 ................................................ 80 3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh85 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV ............................................................................................. 85 3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp ............................. 87 3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh......................................................................... 92 3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp ....................................................... 95 v
3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp ........... 97 3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ .................................................................................................................... 97 3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú ............................................................................................... 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 104 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ ........................................................................................... DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................... vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích aa Amino axit BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá bơn) bp Base pair (cặp bazơ) BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò) cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào) CNS Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương) cs Cộng sự Da Dalton DAB Diamino bezidine (kit làm hiện màu) DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch liên kết enzyme) EtBr Ethidium Bromide FCS fetal calf serum (Huyết thanh bào thai bê) HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) kb kilobase KDa Kilodalton GAA Global Aquaculture Alliance (Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu) GS Grouper spleen (tế bào lách cá mú) IPTG isopropyl β-D- thiogalactoside Ig Immunoglobulin (kháng thể) vii
LB Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào) LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) NCR Non coding region ND Not done (không đánh giá) NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh) nt nucleotid OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel polyacrylamide) PCR Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime) PVDF Polyvinylidene Fluoride RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú chấm đỏ) RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược) SDS Sodium dodecyl sulphase SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá măng sọc) TAE Tris - acetate - EDTA TBS Tris Buffer Saline TBST TBS - Tween TCID50 Tissue culture infective dose 50% (liều gây chết 50% tế bào) TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá nóc hổ) UV Ultraviolet light VLPs Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút) VNN Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh) viii
DANH MỤC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang bảng Vùng địa lý và sự phân bố một số loài cá mú có biểu hiện 1.1 13 bệnh hoại tử thần kinh 1.2 Các kiểu gen của Betanodavirus 23 1.3 Thuận lợi và tồn tại của vắc-xin DNA 33 1.4 Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú 34 3.1 Kiểm tra vi rút bằng phương pháp mô bệnh học 58 Kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp 3.2 60 RT-PCR 3.3 Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 65 So sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4 thu được 3.4 70 với các trình tự của GenBank Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào 3.5 73 GS1 3.6 Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú 74 3.7 Phát hiện gen mã hoá kháng nguyên T4 của NNV trên cá mú 75 Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở nhiệt độ 28oC cả 3.8 78 ngày và đêm Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và 3.9 79 24oC ban đêm Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần 3.10 97 kinh ở mô hình in vitro Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần 3.11 99 kinh ở mô hình in vivo Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV 3.12 101 trên mô hình in vitro ix
DANH MỤC HÌNH Thứ tự Tên hình Trang hình 1.1 Hình thái ngoài cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) 4 1.2 Sản lượng cá mú nuôi ở một số quốc gia trên thế giới 8 1.3 Dấu hiệu bệnh lý của cá mú bị VNN 11 1.4 Cấu trúc không gian của Betanodavirus 22 1.5 Cấu trúc gen của Betanodavirus 22 2.1 Quy trình thực hiện phương pháp mô bệnh học 39 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây 2.2 47 nhiễm của vi rút trên tế bào Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây 2.3 48 nhiễm của vi rút trên cá mú 3.1 Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá 57 Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm 3.2 61 nghi nhiễm NNV 3.3 Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV 63 Mức độ gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) khi gây 3.4 66 nhiễm NNV trên tế bào GS1 3.5 Thiết kế vector tái tổ hợp pGEM-T-T4 68 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp 69 So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với 3.7 71 đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1 3.8 Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV 76 3.9 Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+-T4 81 Cắt vector pGEM-T-T4 (A) và cắt vector pET32a+(B) 3.10 82 bằng enzyme EcoRI Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector 3.11 83 pET32a+ x
Đĩa khuẩn lạc thu được sau khi chuyển gen pET32a+-T4 3.12 84 vào E. coliJM109 Kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 trong vi 3.13 84 khuẩn E. coliJM109 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong 3.14 85 vector tái tổ hợp Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+-T4 vào E. 3.15 86 coliBL21 Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E. 3.16 86 coliBL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp 3.17 vector tái tổ hợp pET32a+-T4 vào chủng E. 87 coliBL21(DE3) Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng vi 3.18 89 khuẩn số 1 và 2 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng vi 3.19 90 khuẩn số 3 và số 4 3.20 Kết quả Westen blot của protein T4 tái tổ hợp 91 3.21 Lượng protein T4 tái tổ hợp được tổng hợp theo thời gian 93 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến khả năng biểu hiện 3.22 94 protein T4 tái tổ hợp Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến mức độ biểu hiện 3.23 95 protein T4 tái tổ hợp 3.24 Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE 96 xi
MỞ ĐẦU Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanh chóng, dần khẳng định vị trí của mình và trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam. Nghề nuôi cá biển được đánh giá là nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một trong những loài nuôi chủ lực. Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế rất cao do hàm lượng dinh dưỡng giàu axit béo không no, thịt cá thơm ngon bổ dưỡng cho nên được thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng. Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá mú phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít khó khăn bởi dịch bệnh gây ra trên cá. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá mú thường là vi rút, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy -VER) do Betanodavirus gây ra. Vi rút có thể tấn công và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn phát triển từ ấu trùng, cá giống đến cá thương phẩm. Khi bị bệnh cá có biểu hiện rối loạn thần kinh như bơi mất thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới hoặc treo trên mặt nước hay nằm dưới đáy bể, đáy lồng. Cá bệnh có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100%. Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi cá trên cả nước. Mùa vụ xuất hiện bệnh từ tháng 5 đến tháng 10 khi nhiệt độ nước từ 24 đến 30ºC. Tỷ lệ chết do VNN gây ra dao động từ 50 - 100% tùy thuộc theo loài và giai đoạn xuất hiện bệnh (Đỗ Thị Hoà và cs, 2004) [2]. Hiện tại, ở Việt Nam mặc dù chưa có báo cáo tổng quát về bệnh hoại tử thần kinh gây ra cho cá mú nuôi, nhưng các số liệu từ nghiên cứu của trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh cao lên tới 82% mẫu cá bệnh thu thập (Nguyễn Ngọc Du và cs, 1
2005; Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh, 2004; Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên, 2008) [1][13][3]. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch khá tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó việc nghiên cứu tạo nguyên liệu để sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá đang là vấn đề cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)”. Mục tiêu của đề tài luận án: - Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh. - Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc- xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: - Mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh được thu từ các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa, Bình Thuận. - Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú được xác định - Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú - Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: tháng 7 năm 2012 đến tháng 5 năm 2015 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: - Tính khoa học: Luận án đã xác định được vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú và một số đặc tính sinh học của chúng. Đồng thời luận án đã sản xuất kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp của vi rút gây bệnh, bước đầu 2
đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch làm cơ sở cho việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú. Dữ liệu khoa học của luận án sẽ cung cấp thêm tư liệu giảng dạy và nghiên cứu về bệnh ở cá mú cũng như định hướng sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú nuôi hiện nay. - Tính thực tiễn: Đề tài đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp và đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm khi được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp này. Trên cơ sở đó có thể dùng kháng nguyên protein tái tổ hợp làm nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh, tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá mú ở nước ta. Đóng góp mới của đề tài luận án: - Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú với một số đặc tính sinh học như khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và trên cá mú, đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và trên cá mú. - Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và bảo hộ cho cá mú cho đến ngày thứ 90 sau khi tiêm. Đây là cơ sở khoa học vững chắc để sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú 1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers. Giống Epinephelus gồm 99 loài, khu vực Ấn Độ, Thái Bình dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống Epinephelus. Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển nước ta có khoảng 30 loài cá mú (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]. Ngành Chordata Lớp Pisces Bộ Perciformes Họ Serranidae Giống Epinephelus Hình 1.1 Hình thái ngoài cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) 1.1.2. Đặc điểm phân bố Cá mú là loài cá sống tại những vùng nước ấm, phân bố chủ yếu ở những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy ở vùng biển ôn đới. Nhiệt độ thích hợp cho các loài cá mú phát triển là từ 22-32ºC, thích hợp nhất là 25- 30ºC. Cá chịu được độ mặn từ 11- 41‰. Môi trường sống của chúng thay đổi tuỳ theo loài, chẳng hạn như loài E. akaara, Cephalopholis miniata sống ở những nơi nước có độ trong cao, có chất đáy là rạn đá ngầm, san hô (ngoài khơi). Các loài E. merra, E. fuscogustatus, E. bleekeri sống chủ yếu ở vùng biển cạn, nơi có bờ đá và rạn san hô, độ mặn cao và ổn định. Cá con thường tìm thấy ở trong các đám rong, cỏ biển. Các loài E. tauvina, E. malabaricus, E. coioides, E. sexfasciatus thường sống cả ở vùng nước lợ và nước mặn nơi có độ mặn 4
dao động từ 10-32‰, chất đáy rất đa dạng từ đáy cứng, cát đến đáy bùn. Cá con thường tìm thấy ở vùng triều ven bờ, cửa sông và rừng ngập mặn. Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển Việt Nam có khoảng 30 loài, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế, giá trị xuất khẩu cao như: cá mú chấm đỏ (E. akaara), cá mú vạch (E. brunneus), cá mú chấm tổ ong (E. merra), cá mú mỡ (E. tauvina), cá mú đen (E. heeberi), cá mú cáo (E. megchir), cá mú chấm nâu (E. coioides). Vùng biển Bắc bộ có cá mú mỡ, cá mú đen, cá mú cáo, cá mú chấm nâu. Vùng biển Trung bộ có cá mú đỏ, vùng biển Đông và Tây Nam bộ có cá mú đỏ, cá mú mỡ. Ngoài ra cũng có nhiều loại có giá trị cao nhưng chưa được đưa vào nuôi phổ biến, chủ yếu là do đánh bắt như cá mú nghệ (E. lanceolatus) (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]. 1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng Sự tăng trưởng cá mú khác nhau giữa các loài. Cá nuôi sau 1 năm, với cá mú chấm đỏ (E. akaara) đạt khoảng từ 0,3 - 0,4 kg, cá mú chấm xanh (E. malabaricus), cá mú chấm nâu (E. coioides) là 0,8 kg, cá mú mỡ (E. tauvina) là 1,0 - 1,2 kg; cá mú nghệ (E. lanceoratus) là 3 - 4 kg, đây cũng là loài lớn nhất trong họ cá mú. Hiện nay đã khai thác được cá mú ngoài tự nhiên có những con đạt khối lượng tới 150 kg. Cá bột sau 1 ngày tuổi có chiều dài trung bình 2,18 mm, miệng đóng, chưa có sắc tố, khối noãn hoàng vẫn còn. Sau 3 ngày tuổi, miệng mở, cá bắt đầu ăn thức ăn ngoài, lúc này ống tiêu hoá chưa hoàn chỉnh. Khi cá đạt 12 ngày tuổi, dài 3,57 mm; miệng, mắt, ống tiêu hoá hoàn chỉnh, bắt đầu phát triển sắc tố thân. Sau 18 ngày tuổi, chiều dài cá từ 5-8 mm, gai lưng thứ 2 dài, giai đoạn này cá rất nhạy cảm với các yếu tố bên ngoài, thời điểm này tỷ lệ hao hụt rất lớn. Cá 32 ngày tuổi, chiều dài 8-10 mm; vây phát triển hoàn thiện và có sắc tố đen trên tất cả các tia vây, gai lưng thứ 2 và cơ thể ngắn lại. Cá 39 ngày tuổi dài 10-12 mm, các vây hoàn chỉnh, tỷ lệ gai lưng thứ 2 giảm đáng kể. Cá 54 ngày tuổi dài 16,5 mm, gai lưng ngắn, hình dáng và sắc tố giống cá trưởng thành. Thông thường cá mú chấm đỏ (E. akaara) lúc 1 5
tuổi dài 18 cm, 2 tuổi dài 18 -24 cm, 3 tuổi dài 23-28 cm, khối lượng 0,5 kg, 4 tuổi dài 26- 33 cm khối lượng 0,7-1,0 kg, 5 tuổi dài 31-34 cm (Nguyễn Thị Vui, 2012) [14]. 1.1.4. Đặc điểm sinh sản Cá mú có khả năng chuyển đổi giới tính, thông thường lúc nhỏ là cá cái, khi trưởng thành chuyển thành cá đực. Cá thường sinh sản vào ban đêm theo tuần trăng. Trứng đẻ ra được thụ tinh ngay trong môi trường nước, đường kính trứng khoảng 0,76-0,82 mm và có giọt dầu nhỏ giúp trứng nổi trong nước. Trứng sau khi thụ tinh sẽ xảy ra quá trình phân cắt tế bào và sự phát triển phôi. Ở độ mặn 30‰, hàm lượng oxy trên 5 mg/l, nhiệt độ 26- 30oC và sau thời gian từ 15 đến 25 giờ trứng sẽ nở ra cá bột. 1.1.5. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú Ở cá xương nói chung và cá mú nói riêng có các hàng rào cơ học như dịch nhờn, da và mang bảo vệ giúp cơ thể cá chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]. Cá mú có hệ miễn dịch không đặc hiệu gồm: các yếu tố ức chế sinh trưởng như tranferin, interferon, lisin có trong bổ thể, protein có trong phản ứng C và lectin. Bên cạnh đó cá mú còn có hàng rào bảo vệ cấp tế bào như: đại thực bào, bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, bạch cầu ái kiềm. Cá mú có hệ miễn dịch đặc hiệu, cơ thể cá có khả năng sinh miễn dịch khi được tiếp xúc với các kháng nguyên và tạo được kháng thể có khả năng bảo hộ với mầm bệnh tương ứng. Cơ thể cá mú có các tế bào tham gia vào quá trình bảo vệ đặc hiệu như cơ quan lympho, trong đó thận được xem là cơ quan lympho ngoại vi của cá, là nơi xảy ra quá trình bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứng miễn dịch của cá mú. Các tế bào lympho tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch cũng có nguồn gốc và chức năng gần giống như động vật trên cạn. 6
Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể ở cá: khi kháng nguyên xâm nhập vào trong cơ thể cá thì được đưa vào hệ thống tế bào bạch cầu, chủ yếu là đại thực bào vây bắt và trình diện kháng nguyên, xử lý và trình diện yếu tố quyết định kháng nguyên lên bề mặt làm kích hoạt các tế bào lympho T. Tế bào lympho T kích thích lên tế bào lympho B chuyển thành tương bào sản sinh kháng thể. Tương bào xuất hiện và tăng số lượng trong lách và thận sau một tuần từ khi có kháng nguyên kích thích. Kháng thể trong huyết thanh thường xuất hiện khi số lượng tương bào đạt giá trị cao nhất sau khoảng 10-15 ngày; lượng Immunoglobin (Ig) tăng lên mạnh mẽ và đạt cực đại vào 20-30 ngày sau khi tiêm kháng nguyên. So với động vật có vú, pha mẫn cảm ở cá kéo dài hơn và thời gian duy trì hàm lượng kháng thể cũng dài hơn. Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở mang: mang cá có vai trò hấp thụ kháng nguyên, đặc biệt kháng nguyên không hòa tan. Mang cá có khả năng sản xuất kháng thể tại chỗ cho nên mang có vai trò quan trọng đối với cá. Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da: Immunoglobulin đã được phát hiện trong dịch nhớt được tiết ra trên da cá. Sự có mặt của lympho, tương bào và đại thực bào ở biểu bì đã khẳng định có sự đáp ứng miễn dịch cục bộ trên da cá (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]. Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở dịch nhầy: dịch nhầy có chứa globulin miễn dịch chủ yếu là IgM và các yếu tố hòa tan khác như ngưng kết tự nhiên, lysin, lysozym, bổ thể. Khi tiến hành ngâm hoặc cho tiếp xúc với kháng nguyên bằng cách cho ăn sẽ hình thành kháng thể trong dịch nhầy song không làm tăng kháng thể trong huyết thanh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]. 1.2. Ýnghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú Theo Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu (GAA), sản lượng cá mú nuôi trên toàn thế giới năm 2009 ước đạt hơn 70.000 tấn, sản lượng tăng dần trong những năm gần đây và năm 2018 dự kiến đạt gần 160.000 tấn [67]. Hiện nay có khoảng 22 loài cá mú được nuôi ở các nước Đông Nam Á và 7