Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:181

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng được nhu cầu của sản xuất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----------***---------- NGUYỄN THÚY ĐIỆP NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----------***---------- NGUYỄN THÚY ĐIỆP NGHIÊN CỨU TÍCH HỢP GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀO MỘT SỐ DÒNG/GIỐNG LÚA PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Khuất Hữu Trung 2. TS. Hoàng Hoa Long Hà Nội, 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của các Thầy hƣớng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Bộ môn Bệnh Học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thúy Điệp
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận án này, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, quan tâm và tận tình giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp. Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Khuất Hữu Trung và TS. Hoàng Hoa Long đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Bộ môn Bệnh Học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và thời gian cho tôi hoàn thành luận án này. Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các đồng nghiệp và bạn bè đã luôn quan tâm giúp đỡ, động viên tinh thần cho tôi trong thời gian làm luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thúy Điệp
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... xi 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 3 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 3 5. Những đóng góp mới của đề tài .............................................................................. 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5 1.1. Tổng quan về bệnh bạc lá ở lúa ........................................................................... 5 1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh ...................................................................................... 5 1.1.2. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ............................................................................ 6 1.1.3. Các chủng sinh lý trên thế giới và ở Việt Nam ................................................. 7 1.2. Tổng quan về gen kháng và bản chất của gen kháng bệnh bạc lá ..................... 10 1.3. Chỉ thị phân tử và vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng .......... 18 1.3.1. Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng............................... 18 1.3.2. Các chỉ thị phân tử DNA dùng phổ biến trong lai tạo và chọn giống............. 19 1.3.3. Phƣơng pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection - MAS) .................................................................... 22 1.4. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ............................ 26 1.4.1. Sàng lọc nguồn gen kháng bệnh bạc lá ...........................................................26 1.4.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới ..... 26 1.4.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam...... 29 1.5. Tổng quan về gen chất lƣợng và chỉ thị liên kết với gen chất lƣợng .................33 1.6. Khuynh hƣớng nghiên cứu quy tụ nhiều gen vào 1 giống lúa ........................... 39 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 41
iv 2.1. Vật liệu ...............................................................................................................41 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................41 2.1.2. Các loại hóa chất .............................................................................................43 2.1.3. Máy móc thiết bị sử dụng................................................................................44 2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................44 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................45 2.3.1. Phƣơng pháp xác định các gen ứng viên liên quan kháng bệnh bạc lá ...........45 2.3.2. Phƣơng pháp thiết kế các chỉ thị SSLP ...........................................................46 2.3.4. Phƣơng pháp PCR ........................................................................................... 47 2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá tính kháng/nhiễm bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo .....49 2.3.6.Thí nghiệm đồng ruộng ....................................................................................51 2.3.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...............................................................................53 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 54 3.1. Xác định gen kháng bệnh bạc lá và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá ...................................................................................................... 54 3.1.1. Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có trong các giống lúa bản địa của Việt Nam .................................................................. 54 3.1.1.1. Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên xa5 ........................... 54 3.1.1.2. Xác định và thiết kế mồi nhận diện các gen ứng viên xa13 ......................... 60 3.1.2. Xác định các gen kháng bệnh bạc lá có trong các nguồn vật liệu thu thập nhờ sử dụng các chỉ thị liên kết ........................................................................................ 64 3.1.2.1. Kiểm tra gen ứng viên xa5 và xa13 ở các dòng/giống thu thập nhờ sử dụng các cặp mồi thiết kế ................................................................................................... 64 3.1.2.2. Kiểm tra gen/gen ứng viên Xa4, Xa7 và Xa21 ở các dòng/giống bố mẹ ..... 65 3.2. Đánh giá khả năng kháng/nhiễm bệnh bạc lá của các nguồn vật liệu................ 69 3.3. Tạo nguồn vật liệu mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá .................... 72 3.3.1. Xác định các con lai ở thế hệ BC1F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá ......................................................................................................................... 73
v 3.3.2. Xác định các con lai ở thế hệ BC2F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá ......................................................................................................................... 78 3.3.3. Xác định các con lai ở thế hệ BC3F1 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá ......................................................................................................................... 82 3.3.4. Xác định các cá thể BC3F2 mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá và gen chất lƣợng (Waxy, BADH2) ...................................................................................... 86 3.4.1. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống An dân 11 ...................................................................... 99 3.4.2. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống DT39 ............................................................................ 104 3.4.3. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 ...................................................................... 111 3.4.4. Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7 .............................................................................. 115 3.4.5. Chọn tạo các dòng/giống lúa triển vọng .........................................................120 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 128 1. Kết luận ............................................................................................................... 128 2. Đề nghị ................................................................................................................ 128 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................. 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 131 PHỤ LỤC 1. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI KHUẨN ......... 149 PHỤ LỤC 2. MỘT SỐ HÌNH ẢNH KIỂM TRA GEN/GEN ỨNG VIÊN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ ...................................................................................................... 150 PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU IRRISTAT ......................................... 164
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Giải thích thuật ngữ tiếng Giải thích thuật ngữ tiếng tắt Anh Việt AC Amylose Content Hàm lƣợng amylose AFLP Amplified Fragment Length Sự đa hình các đoạn Polymorphism khuếch đại BADH2 Betaine aldehyde - dehydrogenase BC Backcross Lai trở lại hay lai hồi giao CAPs Cleaved Amplified Trình tự đa hình khuếch đại Polymorphic sequence bị cắt CTAB Cetyltrimethyl Amonium - Bromide Cs - Cộng sự CSDL - Cơ sở dữ liệu dCAPs Derived Cleaved Ampliﬁed Đoạn dẫn xuất trình tự đa Polymorphic sequence hình khuếch đại bị cắt DNA Deoxyribo Nucleic Acid Axit đêôxiribônuclêic ddNTPs Dideoxynucleotit 2',3'dideoxynucleotide Triphosphate (ddGTP, ddATP, ddTTP và ddCTP) EDTA Ethylenediaminetetra Acetic - Acid EtBr Ethidium bromide - InDels Insertions or Deletions Đoạn thêm/bớt IRRI International Rice Research Viện nghiên cứu lúa quốc tế Institute MABC Marker-assisted Lai hồi giao nhờ chỉ thị phân backcrossing tử MAS Marker-assisted selection Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử NCBI National Center for Trung tâm thông tin Công Biotechnology Information nghệ Sinh học quốc gia
vii NILs Near-isogenic lines Dòng cận đẳng gen NST - Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PSA Potato semi-synthetic agar Môi trƣờng nƣớc chiết khoai medium tây SDS Sodium Dodecyl Sulfate - SNPs Single nucleotit Chỉ thị nucleotit đơn polymorphisms SSLP Single Sequence Length Kỹ thuật đa hình độ dài các Polymorphism chuỗi đơn giản SSR Simple sequence repeat Chỉ thị phân tử vi vệ tinh hay chỉ thị “microsatellite” STMS Sequence tagged Vị trí vi vệ tinh đƣợc đánh microsatellite site dấu bởi trình tự STS Sequence Tagged Site Vị trí đƣợc đánh dấu bởi trình tự TAE Tris-Acetic acid-EDTA - TE Tris-EDTA - RFLP Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn phân Polymorphisms cắt giới hạn Xoo Xanthomonas oryzae pv. - Oryzae
viii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang bảng 1.1 Tổng hợp các gen kháng đã đƣợc xác định ở các giống lúa 14 1.2 Các giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá đƣợc chọn tạo nhờ sự 28 hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) và đã thƣơng mại hóa ở Châu Á 2.1 Danh sách 36 giống lúa bản địa đã giải trình tự hệ gen 41 2.2 Nguồn gốc của một số dòng/giống lúa ƣu tú sử dụng trong nghiên 42 cứu 2.3 Danh sách các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 43 2.4 Thang điểm đánh giá cấp bệnh bạc lá theo phƣơng pháp của IRRI, 50 2014 3.1 Thống kê số lƣợng và tỉ lệ nucleotit vùng CDS (Coding DNA 54 Sequence) của gen ứng viên xa5 ở một số giống lúa có trình tự tƣơng đồng với gen tham chiếu xa5 đã công bố 3.2 Thống kê số lƣợng và tỉ lệ (%) axit amin vùng CDS của gen ứng 56 viên xa5 ở một số giống lúa có trình tự tƣơng đồng với gen tham chiếu xa5 đã công bố 3.3 Thống kê số lƣợng và nucleotit vùng CDS (Coding DNA 61 Sequence) của gen ứng viên xa13 ở một số giống lúa có trình tự tƣơng đồng với gen tham chiếu xa13 đã công bố 3.4 Thống kê số lƣợng và tỉ lệ (%) axit amin vùng CDS của gen ứng 62 viên xa13 ở một số giống lúa có trình tự tƣơng đồng với gen tham chiếu xa13 đã công bố 3.5 Bảng tổng hợp các dòng/giống mang gen ứng viên kháng bệnh bạc 68 lá 3.6 Đánh giá khả năng kháng/nhiễm của các dòng/giống lúa nghiên 71 cứu bằng lây nhiễm nhân tạo (vụ Xuân 2014- Thạch Thất, Hà Nội) 3.7 Danh sách các tổ hợp lai thiết kế 72 3.8 Thống kê kết quả xác định các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 77 lá và chọn lọc các cá thể BC1F1, tạo BC2F1 (vụ Xuân 2015- Tây Tựu, Hà Nội) 3.9 Thống kê kết quả xác định các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 81
ix lá và chọn lọc các cá thể BC2F1, tạo BC3F1 (vụ Mùa 2015 - Tây Tựu, Hà Nội) 3.10 Thống kê kết quả xác định các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc 84 lá và chọn lọc các cá thể BC3F1, tạo BC3F2 (vụ Xuân 2016 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.11 Kiểu gen của các cá thể BC3F2 của một số tổ hợp lai mang 2 gen 88 ứng viên Xa4+xa5 3.12 Kiểu gen của các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai mang 3 gen ứng viên 89 xa5+Xa7+xa13 3.13 Kiểu gen của các cá thể BC3F2 của một số tổ hợp lai mang 2-3 90 gen/gen ứng viên Xa4+Xa7/Xa4+Xa7+Xa21 3.14 Kiểm tra và chọn lọc các cá thể ở thế hệ BC3F2 của các tổ hợp lai 93 mang gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (vụ Mùa 2016) 3.15 Một số đặc điểm hình thái của các cá thể BC3F2:3 mang gen/gen 94 ứng viên kháng bệnh bạc lá (vụ Mùa 2016 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.16 Xác định gen BADH2 và Waxy ở các giống lúa nghiên cứu 97 3.17 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các 100 dòng BC3F3 có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ Xuân 2017- Thạch Thất, Hà Nội) 3.18 Đặc điểm sinh trƣởng của các cá thể BC3F3 mang gen ứng viên 102 kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.19 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen ứng 104 viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các 107 dòng BC3F3 có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân 2017- Thạch Thất, Hà Nội) 3.21 Một số đặc điểm sinh trƣởng của các dòng BC3F3 mang gen kháng 108 bệnh bạc lá có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.22 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen 109 kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân
x 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.23 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các 112 dòng BC3F3 có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.24 Đặc điểm sinh trƣởng của các cá thể BC3F3 mang gen/gen ứng 113 viên kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.25 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen 114 kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.26 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá (lây nhiễm nhân tạo) của các 117 dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh bạc lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.27 Đặc điểm sinh trƣởng của các dòng BC3F3 mang gen kháng bệnh 118 bạc lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7 (Vụ Xuân 2017 - Thạch Thất, Hà Nội) 3.28 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC3F3 mang gen 119 kháng bệnh bạc lá thuộc tổ hợp lai Bắc thơm số 7/IRBB62 (Vụ Xuân 2017- Thạch Thất, Hà Nội) 3.29 Phản ứng của các dòng/giống lúa đối với bệnh bạc lá 120 3.30 Mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng khảo nghiệm (ngoài đồng 122 ruộng, vụ Mùa 2017) 3.31 Đặc điểm sinh trƣởng của các dòng khảo nghiệm (vụ Mùa 2017) 123 3.32 Yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống khảo 124 nghiệm (vụ Mùa 2017) 3.33 Phân tích, đánh giá một số tính trạng chất lƣợng của dòng 125 KTDT18 3.34 Bảng tổng hợp một số đặc điểm sinh trƣởng, yếu tố cấu thành 126 năng suất và năng suất của dòng triển vọng KTDT18
xi DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang hình 2.1 Sơ đồ thiết kế mồi SSLP tổng quát 46 2.2 Sơ đồ lai tạo tổng quát của các tổ hợp lai đã thiết kế 51 3.1 Trình tự một đoạn gen ứng viên kháng bệnh bạc lá xa5 của một số 58 giống lúa bản địa (đoạn mất 35 nucleotit) 3.2 Sơ đồ thiết kế cặp mồi xa5add35 58 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5 ở các 60 dòng/giống lúa bản địa sử dụng cặp mồi xa5add35 3.4 Trình tự một đoạn gen ứng viên kháng bệnh bạc lá xa13 của một số 61 giống lúa bản địa (đoạn mất 4 nucleotit) 3.5 Sơ đồ thiết kế cặp mồi xa13add4 63 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa13 ở các giống 64 lúa bản địa của Việt Nam sử dụng cặp mồi xa13add4 3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5 (a) và xa13 65 (b) ở các dòng/giống lúa ƣu tú sử dụng cặp mồi xa5add35 và xa13add4 tƣơng ứng 3.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa7 ở các 66 dòng/giống lúa ƣu tú (a) và giống lúa bản địa (b) với cặp mồi P3 3.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa21 ở các 67 dòng/giống lúa nghiên cứu sử dụng cặp mồi pTA248 3.10 Khuẩn lạc cấy trên môi trƣờng PSA đặc 70 3.11 Đánh giá khả năng kháng/nhiễm của một số dòng/giống lúa nghiên 70 cứu 3.12 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4 (a), xa5 (b) 74 đối với các cá thể BC1F1 của tổ hợp lai Thủ đô 1*2/Chấn thơm sử dụng cặp mồi MP1-2, xa5add35 tƣơng ứng 3.13 Tạo hạt lai ở thế hệ BC2F1 của các tổ hợp lai (vụ Xuân 2015) 75 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b) và Xa21 76 (c) đối với các cá thể BC1F1 của tổ hợp lai Bắc thơm số 7*2/IRBB62 3.15 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4 (a) 78 và xa5 (b) đối với các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai DT39*3/Chấn
xii thơm sử dụng cặp mồi MP1-2 và xa5add35 tƣơng ứng 3.16 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b), Xa21 (c) 80 đối với các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai Thủ Đô 1*3/IRBB62 sử dụng cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 tƣơng ứng 3.17 Tạo hạt lai ở thế hệ BC3F1 của các tổ hợp lai (vụ Mùa 2015) 82 3.18 Ruộng thí nghiệm chọn lọc các cá thể BC3F1 mang gen kháng bệnh 84 bạc lá, tạo BC3F2 (vụ Xuân 2016 - Thạch Thất, Hà Nội)) 3.19 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên xa5 (a), Xa7 (b), 85 xa13 (c) đối với các cá thể BC3F1 của tổ hợp lai An Dân 11*4/Hom râu sử dụng cặp mồi xa5add35, P3, xa13add4 tƣơng ứng 3.20 Hạt tự thụ (BC3F2) của các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 mang gen 87 kháng bệnh bạc lá của 1 số tổ hợp lai 3.21 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen ứng viên Xa4 (a), xa5(b) 91 đối với các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai Thủ đô 1/Chấn thơm sử dụng cặp mồi MP1-2, xa5add35 tƣơng ứng 3.22 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b), Xa21 (c) 92 đối với các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai Thủ Đô 1/IRBB62 sử dụng cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 tƣơng ứng 3.23 Ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 (a), Xa7 (b), Xa21 (c) 92 đối với các cá thể BC3F2 của tổ hợp lai Bắc thơm 7/IRBB62 sử dụng cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 tƣơng ứng 3.24 Ảnh điện di sản phẩm PCR gen chất lƣợng (BADH2 (a), Waxy (b)) ở 96 các dòng BC3F2 mang đa gen/gen ứng viên bạc lá 3.25 Sơ đồ lai tạo của tổ hợp lai An dân 11/Hom râu 99 3.26 Đánh giá lây nhiễm nhân tạo khả năng kháng bệnh bạc lá của các 101 của các dòng BC3F3 có nền di truyền của giống An Dân 11 (Vụ Xuân 2017) 3.27 Các cá thể BC3F3:4 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di 103 truyền của giống An Dân 11 3.28 Sơ đồ lai tạo của tổ hợp lai DT39/Chấn thơm 105 3.29 Đánh giá lây nhiễm nhân tạo khả năng kháng bệnh bạc lá của các 106 của các dòng BC3F3 có nền di truyền của giống DT39 (Vụ Xuân 2017)
xiii 3.30 Các cá thể BC3F3:4 mang gen ứng viên kháng bệnh bạc lá có nền di 110 truyền của giống DT39 3.31 Sơ đồ lai tạo của tổ hợp lai Thủ đô 1/Chấn thơm (a) và Thủ đô 111 1/IRBB62 (b) 3.32 Các cá thể BC3F3:4 của các dòng mang gen ứng viên kháng bệnh bạc 115 lá có nền di truyền của giống Thủ Đô 1 3.33 Sơ đồ lai tạo của tổ hợp lai Bắc thơm số 7/IRBB62 (b) 116 3.34 Các cá thể BC3F3:4 của các dòng mang gen ứng viên kháng bệnh bạc 119 lá có nền di truyền của giống Bắc thơm số 7 3.35 Các dòng khảo nghiệm tại Văn Lâm, Hƣng Yên (Vụ Mùa 2017) 124 3.36 Hình dạng hạt gạo, cơm dòng KTDT18 127
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh bạc lá gây ra bởi Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất ở lúa, gây thiệt hại đến năng suất của nhiều giống lúa trên khắp thế giới. Bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa. Mức độ nhiễm bệnh cũng nhƣ những ảnh hƣởng về năng suất tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây, độ mẫm cảm với mầm bệnh và các yếu tố môi trƣờng. Bệnh bạc lá lúa đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 và cho đến nay bệnh đã thành dịch hại ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là các nƣớc trồng lúa ở Châu Á. Bệnh bạc lá lúa có nguy cơ gây hại cả ở vụ xuân và vụ mùa. Hiện nay, việc sử dụng các chất hóa học để kiểm soát bệnh bạc lá vẫn chƣa có hiệu quả, gây ô nhiễm môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và chất lƣợng nông sản. (Khuất Hữu Trung và cs, 2015). Ngƣời ta nhận thấy rằng việc tăng cƣờng tính kháng di truyền là phƣơng pháp hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh bạc lá lúa. Do đó, việc phát triển các dòng/giống lúa mang gen kháng bệnh thông qua các ứng dụng chọn giống phân tử kết hợp với phƣơng pháp chọn giống truyền thống hiện đang là một trong những chiến lƣợc quan trọng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa. Ngày nay, nhờ công cụ giải mã hệ gen thế hệ mới, việc giải mã một hệ gen hoàn chỉnh chỉ trong vài ngày cho phép xây dựng cơ sở dữ liệu hệ gen để khai thác một cách hiệu quả các nguồn gen, đặc biệt các nguồn gen lúa hoang dại và lúa bản địa. Với sự phát triển mạnh mẽ của tin sinh học, việc phân tích hệ gen, sàng lọc, phát hiện các gen/QTL kháng ngày càng nhiều và nhanh chóng. Tính đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra đƣợc 43 gen kháng bệnh bạc lá ở cây lúa trồng và lúa hoang dại, trong đó có 27 gen trội và 16 gen lặn (Yogesh et al, 2017; Suk, 2018). Trong số 43 gen đã đƣợc tìm thấy thì có 15 gen đã đƣợc phân lập, lập bản đồ vật lý và 6 gen kháng đã đƣợc tách dòng, nhân bản và giải trình tự (Basabdatta et al., 2014; Mueen et al., 2015; Ranjith et al., 2016; Yogesh et al., 2017; Suk, 2018). Các gen kháng này hoạt động theo cơ chế gen đối gen và là nguồn gen chính để cải tiến di truyền ở các giống lúa kháng với Xanthomonas. Mức độ biểu hiện tính kháng của các gen rất
2 khác nhau và biểu hiện ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây lúa, những gen chính kháng theo cơ chế hoàn toàn, những gen phụ kháng theo từng phần và đƣợc kiểm soát bởi QTL/gen (Khuất Hữu Trung và cs, 2015). Tuy nhiên, với sự phát triển của các chủng Xanthomonas mới và sự biến đổi đa dạng quần thể bệnh đã làm phá vỡ tính kháng của nhiều giống lúa (Yogesh et al, 2017). Để kiểm soát sự phá vỡ tính kháng, khuynh hƣớng quy tụ nhiều gen vào một giống đã đƣợc áp dụng và mang lại hiệu quả đáng kể. Mặt khác, mỗi gen chính thƣờng chỉ kháng đƣợc với một chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ đƣợc vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra đƣợc dòng lúa kháng đƣợc nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại, cải thiện tính kháng ngang từ tính kháng dọc, tạo ra tính kháng bền vững và ổn định. Việc phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử kết hợp với các chỉ thị chức năng cho phép lai qui tụ nhiều gen kháng một cách chính xác đã mở ra cơ hội mới cho các nhà chọn tạo giống trong việc tạo ra các giống kháng bệnh bạc lá phổ rộng, kháng ở mọi giai đoạn phát triển của cây lúa, kháng bền vững với các nòi gây bệnh. Việc chọn tạo các giống lúa mang đa gen với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp chọn lọc các cá thể mang các tính trạng mong muốn với độ tin cậy cao, có thể chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầu của cá thể, phân biệt đƣợc kiểu gen dị hợp tử, chọn lọc đƣợc các alen lặn và giúp quy tụ đƣợc nhiều gen vào cùng một giống, giúp đẩy nhanh sự phát triển các dòng trong chƣơng trình chọn tạo giống (Guvvala et al, 2013; Pradhan et al, 2015). Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tích hợp gen kháng bệnh bạc lá vào một số dòng/giống lúa phục vụ chọn tạo giống” nhằm sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để nhanh chóng đƣa các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá vào các giống lúa ƣu tú, phục vụ cho các chƣơng trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và trực tiếp cho sản xuất. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng chỉ thị phân tử trong lai trở lại nhằm tích hợp các gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21) vào một số dòng/giống lúa
3 ƣu tú, tạo đƣợc các nguồn vật liệu mang 2-3 gen kháng bệnh bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa; - Tạo ra dòng triển vọng có năng suất cao, chất lƣợng tốt, có khả năng kháng bền vững với các chủng gây bệnh bạc lá của Việt Nam để phát triển thành giống, đáp ứng đƣợc nhu cầu của sản xuất. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học: - Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin về phân tích hệ gen lúa bản địa và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá; - Kết quả của đề tài góp phần quan trọng trong việc tạo nguồn vật liệu là các dòng/giống mang đa gen/gen ứng viên kháng bệnh bạc lá phục vụ cho công tác nghiên cứu tính kháng và chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá. * Ý nghĩa thực tiễn: - Tạo đƣợc 2-3 nguồn vật liệu có khả năng bệnh kháng bệnh bạc lá có nền di truyền là các giống lúa ƣu tú; - Tạo ra đƣợc 1-2 dòng triển vọng trong khảo nghiệm có năng suất cao, chất lƣợng tốt, kháng bệnh bạc lá, có khả năng phát triển trong sản xuất. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu - Các dòng/giống lúa ƣu tú đang đƣợc trồng phổ biến ở phía Bắc Việt Nam, các giống lúa bản địa, các dòng NIL mang gen kháng bệnh bạc lá nhập nội từ IRRI; - Cơ sở dữ liệu hệ gen của 36 giống lúa bản địa của Việt Nam và các chỉ thị phân tử có liên quan ứng dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống. * Phạm vi nghiên cứu - Đề tài ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định đƣợc các gen ứng viên kháng bệnh bạc lá, từ đó thiết kế chỉ thị chức năng để nhận biết các gen mục tiêu, phục vụ cho nghiên cứu tính kháng và công tác chọn tạo giống lúa;
4 - Đề tài tập trung nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại để tích hợp nhiều gen kháng bệnh bạc lá vào cùng một giống lúa, nhằm tạo ra nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống. * Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm đƣợc triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp; Viện Bảo vệ Thực vật; Trạm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Văn Lâm, Hƣng Yên và Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng khoa học kĩ thuật giống cây trồng nông nghiệp Thanh Hóa thuộc Trung tâm Khảo kiểm nghiệm Giống, sản phẩm Cây trồng Quốc gia; khu đồng ruộng thí nghiệm thuộc xã Tây Tựu, Bắc Từ Liêm, Hà Nội; xã Đại Đồng, Thạc Thất, Hà Nội. - Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2014 đến năm 2017. 5. Những đóng góp mới của đề tài - Lần đầu tiên ứng dụng công cụ tin sinh học để khai thác trình tự hệ gen đầy đủ của các giống lúa bản địa của Việt Nam, xác định đƣợc các gen ứng viên xa5 và xa13, từ đó thiết kế các chỉ thị chức năng và ứng dụng chỉ thị phân tử nhằm tích hợp nhiều gen kháng vào các dòng/giống lúa ƣu tú, phục vụ lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá và công tác nghiên cứu tính kháng; - Tạo ra 10 nguồn vật liệu mang 2-3 gen/gen ứng viên (Xa4+xa5/ Xa4+Xa7/ xa5+Xa7/xa5+xa13/xa5+Xa7+xa13 - có nguồn gốc từ dòng NIL của IRRI) hoặc 2-3 gen ứng viên (Xa4+Xa7/Xa4+Xa21/Xa7+Xa21/Xa4+Xa7+Xa21 - có nguồn gốc từ các giống lúa bản địa) có khả năng kháng bệnh bạc lá, phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lƣợng tốt, kháng bệnh bạc lá; - Tạo ra 01 dòng triển vọng (KTDT18) có năng suất, chất lƣợng, mang 2 gen ứng viên Xa4+xa5 (có nguồn gốc từ giống lúa bản địa), có khả năng kháng bệnh bạc lá, để phát triển phục vụ cho sản xuất.
5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh bạc lá ở lúa 1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh bạc lá lúa đƣợc phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884. Ban đầu ngƣời ta lầm tƣởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất. Nhƣng không lâu sau đó, ngƣời ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên. Năm 1911, Bokura đã phân lập một loại vi khuẩn và sau khi nghiên cứu về hình thái và sinh lý đã đặt tên là Bacillus oryzae. Năm 1922, Ishiyama đã nghiên cứu sâu hơn về bệnh bạc lá và đã đặt tên lại là Pseudomonas oryzae theo hệ thống Migula. Sau nhiều nghiên cứu tiếp theo, ngƣời ta đặt tên nó là Bacterium oryzae và sau này là Xanthomonas oryzae. Theo sửa đổi của Bộ luật quốc tế về danh mục vi khuẩn (ICNB), ủy ban phân loại vi khuẩn của Hiệp hội Thực vật Quốc tế đã thông qua tên Xanthomonas campestris pv. oryzae Dye. Năm 1990, tác nhân gây bệnh bạc lá đã đƣợc phân loại là loài và đƣợc đặt tên là Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Trích theo Pranamika Sharma et al., 2017). Xanthomonas oryzae pv. oryzae tồn tại chủ yếu trong cây lúa và trên vật chủ là cỏ dại, đáng chú ý là Leersia oryzoides, Zizania latifolia Leptocholoa chinensis, L. panicea và Cyperus rotundis. Ở Úc, vi khuẩn đƣợc biết là tồn tại trong các loài Oryza hoang dã (O. rufipogon và O. australiensis). Xoo cũng có thể tồn tại thời gian ngắn trên hạt bị nhiễm bệnh và trong đất, nhƣng chúng chƣa đƣợc chứng minh là nguồn quan trọng trong việc lây nhiễm mầm bệnh. Ở những vùng nhiệt đới, vi khuẩn cũng có thể tồn tại trong nƣớc tƣới (Trích theo Pranamika Sharma et al., 2017). Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nƣớc trồng lúa ở Châu Á nhƣ: Ấn Độ (1990), Philippin (1918), Indonesia (1950), Trung Quốc (1957). Bệnh bạc lá lúa có xu hƣớng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân (David O. N et al., 2006). Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nƣớc trồng lúa trên thế giới.