Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 2

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

150
lượt xem 46
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

hất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể sử dụng ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng …  Phân loại chất mang : Tất cả chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm 2 nhóm : Chất mang polymer hữu cơ. Chất mang vô cơ. a. Chất mang là polymer hữu cơ Trong nhóm chất mang là polymer hữu cơ được chia làm 2 nhóm là polymer tổng hợp và polymer tự nhiên.  Chất mang là polymer tự nhiên (natural polymer)...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 2

11 + Chaát mang coù theå coù caáu truùc loã xoáp, sieâu loã, coù theå söû duïng ôû daïng haït, daïng maøng, daïng phim moûng …  Phaân loaïi chaát mang : Taát caû chaát mang duøng trong coá ñònh enzyme ñöôïc chia laøm 2 nhoùm : Chaát mang polymer höõu cô. Chaát mang voâ cô. a. Chaát mang laø polymer höõu cô Trong nhoùm chaát mang laø polymer höõu cô ñöôïc chia laøm 2 nhoùm laø polymer toång hôïp vaø polymer töï nhieân.  Chaát mang laø polymer töï nhieân (natural polymer)  Chaát mang laø polysaccharide (gluxit) : Laø nhoùm chaát mang ñang thònh haønh vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát hieän nay, ñoù laø cellulose, agarose, dextran, sephadex vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng. Agarose laø vaät lieäu oån ñònh, ñoàng nhaát deã daøng taïo haït. Tuy nhieân do vaán ñeà veà giaù caû neân agarose chæ thöôøng ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu vaø muïc ñích y hoïc (theo signa : 800 2000 USD/kg). Cellulose vaø caùc daãn suaát cuûa chuùng nhö CM Cellulose, DEAE Cellulose coù tính chaát cô lyù khaù toát, giaù reû nhöng laïi khoâng ñoàng nhaát vaø oån ñònh neân chæ söû duïng ôû daïng sôïi vaø daïng vi haït. Alginate vaø carrageenam laø hai loaïi vaät lieäu khaù môùi meû. Caû hai loaïi vaät lieäu naøy taïo gel trong dung dòch CaCl2 duøng ñeå nhoát teá baøo vaø enzyme. Tuy nhieân, hai loaïi vaät lieäu naøy coù moät nhöôïc ñieåm caên baûn laø gel khoâng oån ñònh trong moâi tröôøng coù phosphate. Tinh boät laø vaät lieäu phong phuù vaø reû tieàn. Töø laâu tinh boät, tinh boät khaâu maïch, diathanolamin tinh boät ñaõ ñöôïc duøng laøm chaát mang coá ñònh enzyme nhö lipase, glucoisomerase, tripsin, amilase. Tuy nhieân tinh boät coù nhöôïc ñieåm laø ñoä tröông coøn haïn cheá vaø thieáu caùc nhoùm chöùc naêng (functional groups). Vì vaäy khaû
12 naêng coá ñònh vaø hoaït tính enzyme coá ñònh coøn thaáp : ñeå khaéc phuïc nhöôïc ñieåm naøy tinh boät thöôøng ñöôïc gheùp copolymer vôùi caùc vinyl monomer öa nöôùc, acrylamide, acrylic acid vöøa caûi thieän tính chaát cô lyù, ñoä tröông, vöøa taïo caùc nhoùm chöùc naêng treân beà maët nhö [ NH2], [ COOH] laøm taêng dieän tích tieáp xuùc vaø khaû naêng coá ñònh enzyme. Chitin vaø chitosan laø vaät lieäu polymer coù nhieàu trieån voïng trong coá ñònh teá baøo vaø enzyme. Chitin laø moät polymer raát phoå bieán trong töï nhieân, chæ ñöùng thöù hai sau cellulose, chitin coù caáu truùc töông töï cellulose, laø polymer cuûa 2 acetomido deoxy D glucose. Chitin tham gia vaøo thaønh phaàn caáu truùc cuûa voû toâm cua, coân truøng, thaønh teá baøo vi sinh vaät. Chitosan laø daãn xuaát cuûa chitin khi xöû lyù baèng kieàm ñaëc. Chitin, chitosan coù caáu truùc s ieâu loã, deã taïo maøng, taïo haït, khaû naêng haáp thuï toát, tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh, thöôøng ñöôïc duøng coá ñònh enzyme qua caàu noái glutaraldehyde. Tuy nhieân caû chitin vaø chitosan ñeàu coù moät nhöôïc ñieåm laø tính chaát kî nöôùc, ñoä tröông keùm, dieän tích beà maët tieáp xuùc nhoû. Ñeå khaéc phuïc nhöôïc ñieåm naøy, hieän nay ñang coù xu höôùng gheùp copolymer vôùi monomer öa nöôùc nhö acrylamide, acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate. Hieän nay, cuõng coù xu höôùng chung laø caùc vaät lieäu töï nhieân ñöôïc gheùp copolymer vôùi caùc polymer toång hôïp ñeå caûi thieän tính chaát cô lyù.  Chaát mang laø Protein : Chaát mang laø protein thöôøng duøng laø getalin, keratin, albumin. Vaät lieäu thuoäc nhoùm naøy thöôøng deã taïo maøng, taïo haït, coù nhoùm chöùc naêng laø nhoùm NH2 vaø vì vaäy thöôøng duøng söû duïng nhoát enzyme trong khuoân gel vôùi taùc nhaân khaâu maïch laø glutaraldehyde. Nhoùm chaát mang naøy laø protein coù nhöôïc ñieåm laø thöôøng keùm beàn, deã nhieãm khuaån.
13  Chaát mang laø caùc polymer toång hôïp : Hieän nay coù raát nhieàu polymer toång hôïp ñöôïc söû duïng laøm chaát mang coá ñònh enzyme nhö polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen gheùp vôùi vinyl monomer, …Öu ñieåm chung cuûa caùc polymer toång hôïp laø beàn, tính chaát cô lyù toát, hoaøn toaøn trô vôùi söï taán coâng cuûa vi khuaån, ñoä tröông toát, moät soá polymer coù theå ñieàu chænh ñöôïc kích thöôùc sieâu loã, … – Polyhydroxyethylmethacrylate : khaû naêng töông hôïp sinh hoïc keùm vaø moät nhöôïc ñieåm quan troïng nöõa laø do quaù beàn vöõng, khoâng phaân huûy trong töï nhieân. Vì vaäy gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Ñaây laø vaán ñeà quan troïng ñoøi hoûi con ngöôøi caàn quan taâm giaûi quyeát. – Polyacrylamide laø moät polymer raát ñoàng nhaát, ñoä tröông toát, kích thöôùc loã gel coù theå ñieàu chænh ñöôïc vaø dieän tích beà maët tieáp xuùc lôùn. Polyacrylamide vaø polyacrylate thöôøng ñöôïc naïp vaøo coät, vaø coù raát nhieàu daïng khaùc nhau nhö polymer coù nhoùm amin hoaëc aldehyde. Phöông phaùp coá ñònh chuû yeáu laø nhoát enzyme teá baøo trong khuoân gel khi ñöôïc polymer baèng hoùa chaát nhö ammoniumpersulphate, böùc xaï gamma, tia rônghen, thöôøng thì ñeå taêng khaû naêng khaâu maïnh cuûa gel poly acrylamide, caàn phaûi boå sung theâm N, N methylenbisacrylamide laøm chaát khaâu maïch (crosslinking agent). Ngoaøi ra coøn coù theå coá ñònh enzyme treân caùc vaät lieäu naøy baèng phöông phaùp haáp thuï, lieân keát coäng hoùa trò vaø microcapsule. b. Chaát mang voâ cô Ngoaøi caùc polymer ñöôïc söû duïng laøm chaát mang, coøn coù moät soá chaát mang voâ cô ñaõ ñöôïc söû duïng thöông maïi nhö sôïi boâng thuûy tinh (contra pore glass), oxyde silica, oxyde nhoâm, oxyde magie. Ñaây laø nhöõng daïng oxyde coù caáu truùc loã vaø coù khaû naêng haáp thuï toát. Moät soá vaán ñeà caàn chuù yù khi duøng caùc vaät lieäu coù nguoàn goác töø silic laø khaù ñaét tieàn, neân chæ söû duïng trong saéc kyù loïc gel vaø coá ñòn h nhöõng enzyme ñaëc bieät. Nhöôïc ñieåm cuûa caùc vaät lieäu naøy laø tan trong kieàm, coù pH > 7.5.
14 Ñeå haïn cheá ñieàu naøy pore glass, pore silics ñöôïc phuû lôùp ziconia ñeå taïo moät lôùp oån ñònh vôùi kieàm, hoaëc ñeå traùnh vaán ñeà naøy coù theå s öû duïng ceramic xoáp ñeå coá ñònh enzyme. Gaàn ñaây moät soá vaät lieäu voâ cô ñöôïc giôùi thieäu thöông maïi hoùa laø caùc saûn phaåm diatomic, coù teân thöông maïi laø celite. Ñaây laø moät vaät lieäu khoâng ñoàng nhaát, chöùa nhieàu ion kim loaïi, laø loaïi vaät lieäu reû tieàn, nhöng coù raát nhieàu öùng duïng trong coâng nghieäp, ñaëc bieät laø trong coá ñònh enzyme vaø trong coâng nghieäp. Vaät lieäu töø tính (magnetic materials) coù raát nhieàu daïng ñaõ ñöôïc söû duïng trong coá ñònh enzyme. Burns ñaõ so saùnh daïng haït cuûa vaät lieäu töø tính vôùi caùc vaät lieäu khaùc vaø vôùi söï caûi tieán cuûa toå hôïp alginite/ vi haït töø tính. Alginite thöôøng söû duïng ôû daïng coäng hoùa trò vì ligand vôùi enzyme hôn laø ôû daïng nhoát. Vi haït (microphere) cuûa vaät lieäu alginite/ vi haït töø tính coù tính chaát cô lyù toát, dieän tích beà maët vaø ñoä phaân taùn toát, caùc khaû naêng coá ñònh baèng phöông phaùp coäng hoùa trò cao. Nhöõng öùng duïng cuûa vaät lieäu naøy voâ cuøng phong phuù. 2.2.3. Caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme Hieän nay coù 4 phöông phaùp chính ñieàu cheá enzyme coá ñònh döïa treân cô sôû lyù hoùa hoïc nhö sau : – Phöông phaùp haáp thuï vaät lyù enzyme leân caùc vaät lieäu coá ñònh khoâng hoøa tan coù mang hoaëc khoâng mang ñieän tích. – Phöông phaùp nhoát enzyme ôû beân trong polymer taïo thaønh xung quanh enzyme moät heä thoáng löôùi coù loã nhoû ñeå khoâng cho phaân töû enzyme ñi khoûi maøng, nhöng caùc loã ñuû lôùn ñeå cô chaát vaø saûn phaåm taïo ra ñi qua ñöôïc deã daøng. – Phöông phaùp hoùa hoïc : lieân keát coäng hoùa trò vaø lieân leát ion. – Phöông phaùp khaâu maïch. a. Phöông phaùp haáp thuï vaät lyù (Physical Absortion) Phöông phaùp naøy coù öùng duïng roäng raõi, ñaëc bieät laø trong giai ñoaïn ñaàu cuûa vieäc nghieân cöùu enzyme coá ñònh. Quaù trình thöïc hieän haáp thuï khaù ñôn giaûn : chaát
15 haáp thuï vaø enzyme ñöôïc troän laãn vôùi nhau, uû moät thôøi gian roài loïc, röûa phaàn enzyme khoâng haáp thuï. Enzyme gaén ñöôïc treân giaù theå nhôø töông taùc cuûa caùc li eân keát yeáu nhö lieân keát : ion, kî nöôùc, hydrogen vaø löïc Vander Waals. Khaû naêng haáp thuï cuûa enzyme phuï thuoäc vaøo caùc ñieàu kieän moâi tröôøng nhö : nhieät ñoä, noàng ñoä enzyme, dieän tích beà maët tieáp xuùc cuûa vaät lieäu coá ñònh. Vaät lieäu coá ñònh höõu cô chuû yeáu ñöôïc söû duïng laø caùc daãn xuaát cuûa polysacchride töï nhieân nhö : cellulose vaø dextran. Theo Mitz vaø Schlueter thì caùc enzyme coù tính acid nhö pepsin deã daøng keát hôïp vôùi DEAE Cellulose, coøn caùc enzyme coù tính kieàm nhö trypsin vaø chymotrypsin thì keát hôïp deã daøng vôùi CM cellulose, phosphate cellulosehoaëc citrate cellulose. Caùc daãn xuaát cellulose naøy coù theå gaén ñöôïc 2 50% enzyme. Vaät lieäu coá ñònh voâ cô nhö: thuûy tinh xoáp, silicagel, cytochrom cuõng ñöôïc söû duïng, caùc vaät lieäu naøy coù öu ñieåm laø chuùng coù khaû naêng thay ñoåi ñoä xoáp lôùn vaø coù khaû naêng haáp thuï cao ñoái vôùi protein. Phöông phaùp naøy coù nhöôïc ñieåm laø quaù trình giaûi haáp thuï enzyme (enzyme coá ñònh trôû thaønh deã hoøa tan) deã daøng xaûy ra khi thay ñoåi pH, nhieät ñoä vaø thaønh phaàn ion.  Yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng coá ñònh cuûa vaät lieäu Noàng ñoä enzyme : noàng ñoä enzyme caøng cao thì söï haáp thuï caøng nhieàu, theo coâng thöùc cuûa Freundlick. K1.C K 2 m Vôùi : K1, K2 haèng soá. m soá löôïng enzyme coù khaû naêng haáp thuï leân beà maët vaät lieäu. C : Noàng ñoä enzyme Coâng thöùc cuûa Langmuiz : K1.K 2 .C m 1 K 2 .C
16 Thôøi gian tieáp xuùc : cho enzyme tieáp xuùc vôùi beà maët cuûa vaät lieäu coá ñònh, toác ñoä haáp thuï phuï thuoäc vaøo ñaëc tính lyù hoùa cuûa chaát haáp thuï vaø enzyme. Kích thöôùc cuûa vaät lieäu coá ñònh : toác ñoä haáp thuï caøng taêng khi kích thöôùc caøng giaûm. Nhieät ñoä : khi nhieät ñoä taêng, toác ñoä haáp thuï taêng, quaù trình haáp thuï xaûy ra raát nhanh chæ sau vaøi phuùt thì enzyme seõ haáp thuï leân treân beà maët. pH : quaù cao hoaëc quaù thaáp ñeàu laøm giaûm khaû naêng haáp thuï, thoâng thöôøng söï haáp thuï toái ña ôû pH ñieåm ñaúng ñieän. Thaønh phaàn moâi tröôøng : caùc chaát laøm giaûm tính hoøa tan cuûa enzyme trong pha nöôùc, seõ laøm taêng khaû naêng haáp thuï. Nhö vaäy muoán haáp thuï caøng nhieàu, caøng laøm giaûm tính hoøa tan cuûa enzyme. b. Phöông phaùp “nhoát” enzyme (Entrapment Method) Ñaây laø phöông phaùp ñôn giaûn, enzyme ít bò bieán ñoåi bôûi quaù trình coá ñònh. Phöông phaùp naøy coù theå coá ñònh nhieàu enzyme cuøng moät luùc. Giôùi haïn cuûa phöông phaùp naøy laø haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát, do ñoù hoaït tính enzyme thöôøng thaáp, nhaát laø trong tröôøng hôïp cô chaát coù troïng löôïng phaân töû lôùn. Enzyme ñöôïc bao boïc trong moät maøng khoâng thaåm thaáu ñoái vôùi enzyme vaø caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû cao, nhöng laïi cho cô chaát vaø saûn phaåm thaåm thaáu qua moät caùch deã daøng. Phöông phaùp naøy cho pheùp giöõ enzyme trong dung dòch gaàn gioáng vôùi töï nhieân vaø söû duïng enzyme nhieàu laàn vì coù theå taùch vaø thu noù deã daøng khoûi saûn phaåm cuûa quaù trình phaûn öùng baèng caùch loïc. Caùc phöông phaùp nhoát enzyme trong maøng baùn thaám : E E E Hình 2.8: Nhoát Enzym trong sôïi coù loã nhoû
17 E E E Hình 2.9: Enzym ñöôïc nhoát trong sôïi maõûnh E E E Hình 2.10: Nhoát enzym trong gel Hình 2.11: Nhoát enzym trong micro – capsule  Nhoát trong caáu truùc maïng Gel Enzyme ñöôïc nhoát trong caáu truùc maïng gel cuûa caùc polymer nhö poly sacchride, protein, polymer toång hôïp nhö polyacrylamide, polyhydroethylacrylate … Caùc polysaccharide thöôøng duøng laø gel alginate vaø carrageenan laø caùc poly anion deã daøng taïo haït trong dung dòch muoái Ca, K vaø khoâng beàn trong moâi tröôøng coù phosphate. Khaéc phuïc nhöôïc ñieåm naøy baèng caùch cho gel khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde. Gel chitosan oån ñònh hôn, chitosan ñöôïc taïo haït trong dung dòch khaâu maïch laø polyphosphate, K4Fe(CN)6 thöôøng ñöôïc söû duïng nhoát teá baøo vaø enzyme. Protein thöôøng duøng laø gelatin, enzym ñöôïc troän vôùi gel gelatin sau ñoù ñöôïc khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde hoaëc aldehyte collagen laø vaät lieäu protein coù theå duøng ñeå nhoát enzyme trong gel cuûa noù, nhôø khaû naêng khaâu maïch cuûa gel trong dung dòch khaâu maïch glutaraldehyde khi ñöôïc khaâu maïch haït gel khoâng tan vaø oån ñònh cao.
18  Giôùi thieäu veà gel alginate thöông phaåm Laø loaïi vaät lieäu thích hôïp nhoát enzyme. Phöông phaùp taïo haït raát ñôn giaûn. Hoãn hôïp enzyme vaø alginate ñöôïc nhoû xuoáng dung dòch CaCl2 ñeå taïo haït gel bao boïc laáy enzyme. Saûn phaåm khi hoøa tan hoaøn toaøn trong nöôùc seõ taïo thaønh daïng gel lieân keát thaønh moät chuoãi caùc polyanion vôùi söï saép xeáp cuûa 2 thaønh phaàn: mannuronate vaø glucuronate coù theå laø moät chuoãi (M M M) (G G G) hoaëc coù theå ñoù laø (M G M G). Tæ leä cao cuûa glucuronate laøm gia taêng söï beàn vöõng cuûa gel. Caáu truùc lieân keát do Phillips, Wedlock and Williams ñöa ra : Khi cho hoãn hôïp enzyme vaø sodium alginate nhoû töøng gioït xuoáng dung dòch CaCl2 seõ taïo thaønh nhöõng haït keát tuûa coù caáu truùc beàn vöõng (0.5 4mm) chöùa enzyme beân trong. Enzyme ñöôïc bao boïc trong moät maøng khoâng thaåm thaáu ñoái vôùi enzyme vaø caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû cao, nhöng laïi cho cô chaát vaø saûn phaå m thaåm thaáu qua moät caùch deã daøng. Ñieàu naøy cho pheùp giöõ enzyme trong dung dòch gaàn gioáng vôùi töï nhieân vaø söû duïng enzyme nhieàu laàn. Enzyme + alginate CaCl2 Haït Calcium alginate vôùi enzyme coá ñònh
19 Phöông trình phaûn öùng : 2 Na( A lg inate) Ca Ca( A lg inate) 2 2 Na  Ñaëc ñieåm cuûa gel alginate Gel alginate coù khaû naêng nhoát moät löôïng lôùn teá baøo vaø enzyme, hieäu suaát nhoát enzyme cao, thao taùc vaø kyõ thuaät tieán haønh ñôn giaûn. Haït gel coù kích thöôùc coù thay ñoåi töø 0.5 4mm. Haït coù caáu truùc beàn vöõng. Ñeå oån ñònh haït gel coù theå cho haït gel khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde hoaëc caùc chaát khaâu maïch khaùc. Tuy nhieân gel naøy laïi khoâng beàn trong moâi tröôøng coù phosphate.  Phöông phaùp nhoát gel trong heä sôïi Naêm 1972, Dinelli ñaõ tieán haønh moät thí nghieäm k haù ñoäc ñaùo laø nhoát enzyme trong heä sôïi vaø nhöõng nghieân cöùu naøy ñöôïc keát thuùc naêm 1978. Theo keát quaû nghieân cöùu cuûa Dinelli, enzyme khi ñöôïc nhoát vaøo heä sôïi phaùt huy khaû naêng xuùc taùc raát toát. Phöông phaùp nhoát enzyme trong heä sôïi coù khaû naêng xuùc taùc phaûn öùng toát hôn phöông phaùp nhoát enzyme trong gel. Caùc sôïi söû duïng ñeå nhoát enzyme thöôøng laø sôïi nhaân taïo. Caùc loaïi sôïi naøy coù ñoä beàn vôùi acid, kieàm, caùc loaïi ion vaø caùc loaïi dung moâi hoøa tan. Tính chaát treân phuï thuoäc raát nhieàu vaøo baûn chaát hoùa hoïc cuûa caùc polymer taïo ra loaïi sôïi naøy.  Phöông phaùp taïo vi nang (microcapsule) Khaùc vôùi phöông phaùp nhoát trong gel, ôû phöông phaùp naøy enzyme ñöôïc nhoát trong moät maøng baùn thaám, nhöng cô chaát vaø saûn phaåm deã daøng ñi qua. Vì hoaït ñoäng trong moâi tröôøng dung dòch, neân khaû naêng tieáp xuùc giöõa cô chaát vaø enzyme lôùn hôn trong tröôøng hôïp nhoát trong khuoân gel.
20 Pha nöôùc Monomer öa nöôùc polymer hoù a polymer Pha höõu cô Monomer kî nöôùc Hình 2.12: Qui trình nhoát enzyme trong microcapsule  Phöông phaùp sieâu loïc (ultrafilitration) Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy cuõng töông töï phöông phaùp micro capsule. Enzyme ñöôïc giöõ laïi trong caùc maøng, sôïi sieâu loïc. Phöông phaùp naøy ñaõ ñöôïc öùng duïng coá ñònh glucose amylase, glucose isomerase, galactosidase. c. Phöông phaùp hoùa hoïc  Lieân keát coäng hoùa trò Coá ñònh enzyme baèng lieân keát coäng hoùa trò vôùi caùc polymer ñaõ ñöôïc hoaït hoùa, laø moät trong nhöõng phöông phaùp coá ñònh enzyme phoå bieán nhaát, ñaû m baûo lieân keát vöõng chaéc cuûa enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh.  Öu ñieåm Do lieân keát chaët cheõ vôùi vaät lieäu coá ñònh baèng lieân keát coäng hoùa trò, neân enzyme khoâng bò ly giaûi trong suoát quaù trình söû duïng. Enzyme deã daøng tieáp xuùc cô chaát do enzyme ñöôïc gaén treân beà maët vaät lieäu coá ñònh. Enzyme coù khaû naêng oån ñònh vôùi söï thay ñoåi nhieät ñoä.