Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 4

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

199
lượt xem 47
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Clark dùng điện cực alcohol oxydoreductase để xác định nồng độ cồn. Ngoài ra enzyme còn có thể dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều qui trình sử dụng chế phẩm tế bào cố định để xử lý nước thải đạt hiệu quả. Các nghiên cứu về màng enzyme cố định ngày càng tăng, những kết quả đạt được cũng phụ thuộc...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 4

31 Clark duøng ñieän cöïc alcohol oxydoreductase ñeå xaùc ñònh noàng ñoä coàn. Ngoaøi ra enzyme coøn coù theå duøng vaøo nhieàu muïc ñích kh aùc nhau nhö: hoaït hoùa zymogen, nghieân cöùu caáu truùc phaân töû protein, söû duïng phöông phaùp saéc kyù aùi löïc ñeå tinh cheá moät soá chaát coù khaû naêng lieân keát ñaëc bieät vôùi enzyme. Ngaøy nay coù nhieàu qui trình söû duïng cheá phaåm teá baøo coá ñònh ñeå xöû lyù nöôùc thaûi ñaït hieäu quaû. Caùc nghieân cöùu veà maøng enzyme coá ñònh ngaøy caøng taêng, nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc cuõng phuï thuoäc nhieàu vaøo tính chaát cuûa maøng duøng ñeå gaén enzyme. Treân cô sôû nghieân cöùu tính chaát cuûa enzyme coá ñònh seõ goùp phaàn giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà lôùn khaùc nhau nhö : – Giaûi thích toaøn dieän hôn chöùc naêng xuùc taùc sinh hoïc trong teá baøo soáng vaø ñieàu hoøa hoaït ñoäng enzyme trong teá baøo. – Ñieàu hoøa tính thaám cuûa maøng vaø khueách taùn qua maøng. – Ñaëc tính cuûa phaûn öùng enzyme ôû giôùi haïn phaân caùch giöõa caùc phase cuûa maøng, trong moâi tröôøng kî nöôùc, moâi tröôøng nöôùc trong maøng teá baøo. Ngaøy nay, vieäc nghieân cöùu enzyme coá ñònh ñöôïc tieán haønh th eo höôùng ngaøy caøng phöùc taïp daàn, moâ hình töø moät enzyme rieâng leû ñeán heä thoáng nhieàu enzyme, seõ tieán ñeán taïo nhöõng caáu truùc treân phaân töû coù traät töï bao goàm nhieàu phöùc heä enzyme. Nghieân cöùu quaù trình xuùc taùc nhôø caùc heä thoáng phöùc taïp seõ giuùp hieàu bieát ñaày ñuû cô cheá caùc quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo. 2.4. CAÙC NGHIEÂN CÖÙU VEÀ ENZYME COÁ ÑÒNH 2.4.1. Caùc nghieân cöùu trong nöôùc Vieäc nghieân cöùu vaø öùng duïng enzyme coá ñònh ôû Vieät Nam chöa phoå bieán laém vaø vaãn coøn ñöôïc xem laø höôùng môùi meû, keát quaû thu ñöôïc coøn haïn cheá. Tuy nhieân, gaàn ñaây ñaõ coù moät soá cuoäc thöû nghieäm veà vaán ñeà coá ñònh enzyme ôû teá baøo vi sinh, enzyme trích töø ñoäng vaät, thöïc vaät trong ñoù noåi baät laø :
32  Nhoùm nghieân cöùu cuûa GS TS Nguyeãn Vaên Uyeån thöû nghieäm saûn xuaát coàn baèng kyõ thuaät coá ñònh teá baøo naám men Saccharomyces Cerevisiae treân gel calcium alginate. Phöông phaùp naøy khoâng ñoøi hoûi thieát bò phöùc taïp vaø co ù theå thöïc hieän nhanh choùng. Öu ñieåm phöông phaùp saûn xuaát lieân tuïc neân naêng suaát taïo coàn taêng, ít ñaàu tö voán, naám men hoaït ñoäng lieân tuïc (100 ngaøy) thay vì phaûi caáy vaø nhaân gioáng haøng ngaøy neáu theo qui trình cuõ.  Nhoùm nghieân cöùu cuûa Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi keát hôïp vôùi boä moân sinh hoùa tröôøng Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï nhieân naêm 1994 nghieân cöùu thöû nghieäm taïo pepsin coá ñònh vaø naêm 1995 thöû nghieäm taïo pancreatin coá ñònh treân cytochrom. Keát quaû thu ñöôïc môû ra höôùng nghieân cöùu tieáp theo cho caùc enzyme khaùc.  Phoøng nghieân cöùu coâng ngheä böùc xaï Vieän Nghieân Cöùu Haït Nhaân Ñaø Laït coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu enzyme coá ñònh treân teá baøo vi sinh vaø caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc baèng kyõ thuaät böùc xaï nhö coá ñònh glucoamylase, protease, vi khuaån taû (Vibrio Cholerae), teá baøo naám men (Saccharomyces Serevisae), vi khuaån xöû lyù nöôùc thaûi (Pseudomonas Maltophila) vaø progesteron treân caùc giaù theå polymer toång hôïp.  Nghieân cöùu cuûa Nguyeãn Anh Duõng taïi Vieän Nghieân Cöùu Haït Nhaân Ñaø Laït naêm 1999 öùng duïng kyõ thuaät böùc xaï theo 2 höôùng chính laø : cheá taïo vaät kieäu töông hôïp sinh hoïc vaø coá ñònh caùc chaát coù hoaït chaát sinh hoïc leân caùc vaät lieäu polymer gheùp baèng böùc xaï. Ñeå cheá taïo vaät lieäu töông hôïp sinh hoïc thöôøng duøng phöông phaùp copolymer hoùa caùc monomer vôùi polymer vaø phöông phaùp khaâu maïch böùc xaï. Ñeå coá ñònh caùc chaát coù hoaït chaát coù hoaït tính sinh ho ïc baèng caùch taïo lieân keát vôùi polymer hoaëc nhoát trong polymer. Taùc giaû ñaõ coá ñònh ñöôïc trypsin trong gel chitosan g.co HEMA traùnh söï taùc ñoäng tröïc tieáp cuûa böùc xaï coù theå ñaùp öùng ñöôïc yeâu caàu öùng duïng trong coâng nghieäp.
33 2.4.2. Caùc nghieân cöùu ngoaøi nöôùc  Enzyme coá ñònh ñaõ ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc quan taâm vaø ñöa ra nhieàu höôùng nghieân cöùu töø raát laâu. Naêm 1916 khi Nelson vaø Griffin quan saùt khaû naêng thuûy phaân ñöôøng saccharose baèng invertase ôû naám men haáp thuï treân than hoaït tính.  Sau ñoù ñeán naêm 1953, Grubhofer vaø Schleith coá ñònh carboxipeptidase, pepsin, ribonuclease baèng lieân keát coäng hoùa trò treân nhöïa polyaminostyren ñöôïc diazo hoùa.  Vaøo naêm 1963 Bernfeld vaø Wan ñaõ moâ taû phöông phaùp nhoát. Caùc enzyme trypsin, papain, amylase vaø ribonuclease trong gel polyacrylamide.  Vaøo naêm 1964, Richard laàn ñaàu tieân duøng glutaraldehyde 1% ñeå ñieàu cheá ra carboxypeptidase axit amin ôû daïng tinh theå khoâng tan, sau khixöû lyù enzyme vaãn khoâng thay ñoåi hình daïng vaø giöõ ñöôïc 30% hoaït ñoä ban ñaàu. Cuøng naêm naøy Chang ñaõ nhoát enzyme hydratase trong caùc vi haït.  Naêm 1970, Mosbach ñaõ coá ñònh 3 loaïi enzyme : galactosidase, hexokinase vaø gluco 6 phosphate dehydrogenase ñöôïc gaén baèng lieân keát ñoàng hoùa trò leân haït sephadex vaø hieäu quaû cuûa phaûn öùng ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme lieân keát laø cao hôn nhieàu.  Cuøng naêm naøy Bernty ñaõ duøng glucooxidase gaén baèng lieân keát ñoàng hoùa trò ôû trong coät polystirol ñeå xaùc ñònh töï ñoäng glucose.  Naêm 1971, ngöôøi ta ñaõ thaønh coâng trong vieäc duøng chymotrypsin lieân keát ñoàng hoùa trò vôùi caùc carboximethyl cellulose ñeå laøm ñoâng tuï söûa thay cho renin ñaét tieàn.  Naêm 1974, Ichiro Chibata vaø 1976 Koro Yamoto laàn ñaàu tieân thaønh coâng trong vieäc saûn xuaát enzyme coá ñònh ñem öùng duïng trong saûn xuaát coâng nghieäp, taïo ra saûn xuaát laø L– malic vaø acid fumaric ngöôøi ta duøng vaät lieäu coá ñònh laø polyacryllamide vaø carrageenan ñöôïc hoaït hoùa bôûi glutaraldehyde vaø hexamethyl enediamine ñeå coá ñònh teá baøo vi sinh. Duøng carrageenan ñeå coá ñònh nhieàu loaïi teá
34 baøo vi sinh thì coù keát quaû toát hôn duøng gel polyarylamide trong saûn x uaát coâng nghieäp.  Naêm 1978 Sten Ohlsan, Per Olof Larsson vaø Klaus Mosbach coá ñònh teá baøo vi sinh Artbrobacter simplex baèng gel calcium alginate.  Naêm 1979 Yodogawaku (Japan) ñaõ söû duïng teá baøo B. Flavum coá ñònh treân carrageenan ñeå thöïc hieän phaûn öùng chuyeån töø L– fumaric taïo ra saûn phaåm L – malic vôùi hieäu suaát thu saûn phaåm cao hôn.  Ngaøy nay, nhöõng enzyme ñaét tieàn ñang ñöôïc chuù yù ñaëc bieät ñeå nghieân cöùu vaø ñöa vaøo öùng duïng trong saûn xuaát coâng nghieäp vôùi da ïng enzyme coá ñònh. Ngoaøi vieäc coá ñònh teá baøo vi sinh, ngöôøi ta coøn coá ñònh luïc laïp, ty theå, treân caùc vaät lieäu coá ñònh khaùc nhau. Töø ñoù môû ra moät höôùng môùi trong vieäc söû duïng teá baøo vi sinh vaät vaø cao hôn nöõa laø cô quan cuûa thöïc vaät, ñoäng vaät ñeå saûn xuaát caùc hôïp chaát thöù caáp coù hoaït tính sinh hoïc vaø coù giaù trò kinh teá hôn. 2.5. GIÔÙI THIEÄU TOÅNG QUAN VEÀ ENZYME AMYLASE 1,4 amylase coù khaû naêng phaân caét caùc lieân keát glucoside naèm phía trong phaân töû cô chaát moät caùch ngaãu nhieân khoâng theo moät traät töï naøo caû. Quaù trình thuûy phaân tinh boät bôûi amylase laø moät quaù trình ña giai ñoaïn. ÔÛ giai ñoaïn ñaàu (giai ñoaïn dextrin hoùa) chæ moät soá phaân töû cô chaát bò thuûy phaân taïo thaønh moät löôïng lôùn dextrin phaân töû thaáp ( dextrin), ñoä nhôùt cuûa hoà tinh boät giaûm nhanh. Sang giai ñoaïn hai (giai ñoaïn ñöôøng hoùa) caùc dextrin phaân töû thaáp vöøa ñöôïc taïo thaønh bò thuûy phaân tieáp tuïc taïo ra caùc tetra trimaltose khoâng baét maøu vôùi iodine. Caùc chaát naøy bò thuûy phaân raát chaäm bôûi amylase cho tôùi di vaø monosaccharide. Döôùi taùc duïng cuûa amylase, tinh boät bò phaân giaûi khaù nhanh thaønh oliigosaccharide goàm 6 7 goác glucose. Sau ñoù caùc polyglucose naøy laïi bò phaân caét tieáp neân caùc maïch polyglucose colagen cöù ngaén daàn vaø bò phaân giaûi chaäm ñeán maltotetrose vaø matotriose. Qua moät thôøi gian taùc duïng daøi, saûn phaåm thuûy phaân bôûi amylase chöùa 13% glucose vaø 87% maltose, taùc duïng cuûa
35 amylase khoâng phaân caét ñöôïc lieân keát 1,6 glucoside ôû choã maïch nhaùnh trong phaân töû amylopectin neân duø coù chòu taùc duïng laâu daøi thì trong saûn phaåm cuoái cuøng, ngoaøi caùc ñöôøng noùi treân (72% maltose, 19% glucose) coøn coù dextrin phaân töû thaáp vaø izomaltose (8%).toùm laïi döôùi taùc duïng cuûa amylase, tinh boät coù theå chuyeån thaønh maltotetrose, maltose, glucose vaø dextrin phaân töû thaáp. 2.5.1 Ñaëc tính Trung taâm hoaït ñoäng cuûa amylase coù chöùa nhoùm [ COOH] vaø [NH2]. amylase deã tan trong nöôùc, trong caùc dung dòch muoái vaø röôïu loaõng. Protein cuûa amylase coù tính acid yeáu vaø tính chaát cuûa globulin. Ñieåm ñaúng ñieän naèm trong vuøng pH 4.2–5.7. Phaân töû löôïng cuûa amylase töø caùc nguoàn goác khaùc nhau raát khaùc nhau (cuûa naám moác 45.000 50.000, cuûa malt 59.000) (Knin 1956; Fisher, Stein 1970). amylase laø moät metaloenzyme (enzyme cô kim). Caùc amylase ñeàu chöùa töø 1 30 nguyeân töû gam Ca/mol. Song khoâng ít hôn 1 6 nguyeân töû gam Ca/mol. Khi taùch hoaøn toaøn Ca ra khoûi protein cuûa enzyme thì amylase maát heát khaû naêng thuûy phaân cô chaát. Vaø Ca tham gia vaøo söï hình thaønh vaø oån ñònh caáu truùc baäc ba cuûa enzyme, duy trì caáu hình hoaït ñoäng cuûa enzyme (Molodova, 1956) . Ca coøn coù taùc duïng ñaûm baûo cho amylase coù ñoä beàn cöïc lôùn ñoái vôùi caùc taùc ñoäng gaây bieán tính vaø söï phaân huûy bôûi caùc enzyme phaân giaûi protein. amylase beàn nhieät hôn so vôùi caùc loaïi amylase khaùc. Ngöôøi ta cho raèng ñaëc tính naøy cuûa amylase coù lieân quan ñeán haøm löôïng cuûa Ca trong phaân töû cuûa noù ( amylase cuûa caùc vi khuaån öa nhieät coù chöùa Ca nhieàu hôn amylase cuûa naám moác 3 4 laàn neân noù beàn nhieät hôn). Taát caû nhöõng amylase ñeàu bò kìm haõm bôûi nhöõng kim loaïi naëng nhö : Cu 2+, Li+, Mg2+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+,…
36 amylase töø caùc nguoàn goác khaùc nhau coù thaønh phaàn amino acid khaùc nhau. Moãi loaïi amylase coù moät toå hôïp amino acid ñaëc hieäu rieâng song chuùng ñeàu khaù giaøu tyrosine vaø tryptophan. Caùc glutamic acid vaø aspatic chieám ¼ toång löôïng amino acid caáu thaønh phaân töû enzyme. Trong amylase raát ít methionine vaø chæ coù khoaûng 7 10 goác cysteine, tröø amylase cuûa Bac. Subtilis khoâng coù caùc lieân keát sulfhydryl vaø disulfhydryl. Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau cuõng khaùc nhau. pH toái thích cho hoaït ñoäng cuûa amylase töø naám sôïi laø 4,5 4,8 (coù theå hoaït ñoäng toát trong vuøng pH 4,5 4,8) cuûa ñaïi maïch naåy maàm laø 5,3 vaø cuûa vi khuaån laø 5,8 6,0 (hoaït ñoäng toát trong vuøng pH 5,8 7,0). Ñoä beàn ñoái vôùi taùc duïng acid cuõng khaùc nhau. amylase cuûa naám sôïi beàn vöõng vôùi acid toát hôn laø cuûa malt vaø vi khuaån. ÔÛ pH 3,6 vaø 00C amylase cuûa malt bò voâ hoaït hoaøn toaøn sau 15–30 phuùt, amylase cuûa vi khuaån bò voâ hoaït 50% trong khi ñoù hoaït löïc cuûa amylase cuûa naám sôïi haàu nhö khoâng giaûm bao nhieâu (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989). ÔÛ pH
37 Trong kyõ ngheä tinh boät : Termamyl ñöôïc duøng cho vieäc dòch hoùa lieân tuïc tinh boät trong noài hôi hoaëc trong nhöõng thieát bò töông töï hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä töø 105 1100C vaø vì vaäy lôïi duïng ñöôïc tính oån ñònh nhieät ñoä cao cuûa enzyme. Trong kyõ ngheä naáu coàn : Termamyl ñöôïc duøng ñeå phaân taùn tinh boät khi nghieân cöùu vaø chöng caát. Vaø ôû giai ñoaïn naøy, cuõng lôïi duïng ñöôïc ñoä oån ñònh nhieät cuûa enzyme Trong kyõ ngheä naáu bia : Termamyl ñöôïc duøng ñeå giuùp cho vieäc dòch hoùa ñöôïc deã daøng. Do ñoä oån ñònh nhieät ñoä cao cuûa enzyme. Trong kyõ ngheä ñöôøng : Termamyl ñöôïc söû duïng ñeå phaù vôõ löôïng tinh boät hieän dieän trong mía. Trong kyõ ngheä deät : Termamyl ñöôïc söû duïng ôû toác ñoä cao, nhieät ñoä cao ñeå ruû hoà tröôùc khi nhuoäm. Loaïi enzyme kyõ thuaät ñöôïc aùp duïng cho coâng ngheä naøy. b. Hoaït tính cuûa enzyme thöông phaåm Caùc thoâng soá veà hoaït tính AÛnh höôûng cuûa pH vaø nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme trong ñieàu kieän thöû nghieäm : 900C – Chaát neàn : 0,5% 300 600C tinh boät. 0 37 C – Chaát oån ñònh : 225 Hoaït tính (Knu/g) 30 – 60 ppm Ca. 150 75 6 8 10 4
38 Hình 2.13: AÛnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa enzyme Termanyl taïi caùc nhieät ñoä
39 % hoaït tính – Chaát neàn : 0,5% töông ñoái 100 tinh boät. – Chaát oån ñònh : 75 30 – 60 ppm Ca. 50 – pH : 5.7 25 0 C 40 50 60 70 80 90 Hình 2.14: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa enyme Termamyl Ñoä oån ñònh cuûa Termamyl AÛnh höôûng cuûa calci Trong boät nhaõo, tính oån ñònh cuûa Termamyl ñöôïc thoûa maõn vôùi söï hieän dieän 70 ppm ion Ca2+. töø 50 Ngoaøi ra hoaït tính cuûa enzyme cuõng coù theå bieåu thò baèng toác ñoä gia taêng ban ñaàu cuûa DE (ñöông löôïng Dextrose) vôùi noàng ñoä enzyme ñaõ cho saún. Toác ñoä gia taêng trung bình ñöông löôïng DE treân moät thôøi gian cho saún seõ tuøy thuoäc vaøo ñoä oån ñònh toác ñoä ban ñaàu ñoái vôùi haøm löôïng Termamyl 0.1% treân troïng löôïng nhö sau : 900C 950C 1000C 1050C Nhieät ñoä Ñoä gia taêng ban ñaàu ñöông löôïng DE/giôø 5.1 5.5 5.9 6.2 Ñoä gia taêng trung bình ñöông löôïng DE 5.1 5.3 5.3 4.3 sau 1 giôø ñaàu tieân (ñieàu kieän tieâu chuaån)
40 Phaàn 3. VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 3.1. VAÄT LIEÄU  Enzyme – amylase Trong quaù trình tieán haønh thí nghieäm, söû duïng enzyme amylase thöông phaåm: Termamyl do haõng Novo saûn xuaát.  Gel calcium alginate Alginate söû duïng trong quaù trình thí nghieäm laø muoái sodium alginate do haõng Kanto cuûa Nhaät saûn xuaát. Saûn phaåm ôû daïng boät mòn hoøa tan hoaøn toaøn trong nöôùc. 3.2. PHÖÔNG PHAÙP THÍ NGHIEÄM 3.2.1. Phöông phaùp coá ñònh enzyme a. Chuaån bò duïng vuï & hoùa chaát coá ñònh enzyme Duïng cuï – Bercher 500ml, 1000ml. – Pipet. – Que khuaáy. – Xilanh taïo gioït. Hoùa chaát – Sodium alginate daïng boät mòn do Nhaät saûn xuaát. – CaCl2 0.2M – Enzyme Termamyl thöông phaåm daïng loûng. b. Qui trình coá ñònh enzyme –Taïo dung dòch sodium alginate 3%. –Troän ñeàu enzyme vaø dung dòch sodium alginate theo tæ leä 1:1 taïo ra hoå hôïp enzyme–sodium alginate