Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 3

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

180
lượt xem 76
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhược điểm Enzyme có thể bị mất hoạt tính vì cấu trúc của enzyme bị thay đổi do quá trình liên kết. Giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất do đó làm giảm hoạt tính enzyme cố định. Vật liệu cố định không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho các enzyme ổn định hoạt tính khi cố định.  Enzyme cố định có thể tạo ra bằng hai cách – Nối đồng hóa trị liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một liên hợp cao phân tử không hòa tan....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 3

21  Nhöôïc ñieåm Enzyme coù theå bò maát hoaït tính vì caáu truùc cuûa enzyme bò thay ñoåi do quaù trình lieân keát. Giaûm khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát do ñoù laøm giaûm hoaït tính enzyme coá ñònh. Vaät lieäu coá ñònh khoâng taùi söû duïng ñöôïc, phöông phaùp naøy aùp duïng cho caùc enzyme oån ñònh hoaït tính khi coá ñònh.  Enzyme coá ñònh coù theå taïo ra baèng hai caùch – Noái ñoàng hoùa trò lieân keát caùc phaân töû enzyme rieâng bieät laïi thaønh moät lieân hôïp cao phaân töû khoâng hoøa tan. Ñaây laø phöông phaùp khoâng söû duïng chaát mang. Caùc phaân töû enzyme seõ lieân keát vôùi nhau qua caùc caàu noái trung gian ñeå trôû thaønh daïng khoâng hoøa tan. Caùc caàu noái trung gian thöôøng duøng laø glutaraldehyte. – Keát hôïp phaân töû enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh khoâng hoøa tan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Ñieàu cheá caùc enzyme coá ñònh loaïi 1, khi duøng caùc taùc nhaân löôõng chöùc nhö bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid vaø moät soá hôïp chaát khaùc. Ñaëc bieät ngöôøi ta thöôøng duøng glutaraldehyte laøm taùc nhaân ñeå ñính caùc phaân töû enzyme laïi vôùi nhau. Caùc enzyme coá ñònh loaïi 2 thöôøng ñöôïc ñieàu cheá phoå bieán hôn. Chaát mang ñeå coá ñònh enzyme phaûi thoûa maõn nhöõng ñoøi hoûi nhaát ñònh sau : Coù ñoä hoøa tan thaáp vaø beàn vöõng ñoái vôùi caùc taùc ñoäng cô hoïc vaø hoùa hoïc nhaát ñònh … Khoâng gaây taùc duïng kìm haõm ñeán enzyme. Khoâng taïo ra hieän töôïng haáp thuï khoâng ñaëc hieäu ñoái vôùi caùc protein. Vì phaûn öùng enzyme thöôøng xaûy ra trong moâi tröôøng nöôùc, neân vaät lieäu coá ñònh toát hôn caû laø coù chaát öa nöôùc.
22 Trò soá vaø daáu ñieän tích cuûa vaät lieäu coá ñònh cuõng coù vai troø nhaát ñònh. Vieäc gaén enzyme coù hieäu quaû hôn caû khi ñieän tích cuûa enzyme vaø cuûa vaät lieäu coá ñònh coù daáu ngöôïc nhau. Vì leõ ñieän tích cuøng daáu coù theå ngaên caûn söï lieân keát. Quaù trình coá ñònh enzyme coù theå xaûy ra qua moät giai ñoaïn neáu vaät lieäu coá ñònh coá ñònh coù chöùa caùc nhoùm coù khaû naêng tham gia töông taùc tröïc tieáp vôùi nhoùm amin cuûa enzyme. Tröôøng hôïp ngöôïc laïi quaù trình xaûy ra qua 2 giai ñoaïn :  Giai ñoaïn hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh baèng caùch ñöa vaøo caùc nhoùm chöùc naêng coù khaû naêng phaûn öùng hôn.  Giai ñoaïn hai giai ñoaïn keát hôïp enzyme. Tröôøng hôïp khoâng caàn hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh theå hieän roõ trong tröôøng hôïp copolymer cuûa maleic alhydric vaø ethylen. Copolymer ñöôïc duøng phoå bieán laøm vaät lieäu coá ñònh ñeå ñieàu cheá caùc daãn xuaát khoâng tan cuûa protease vaø moät soá enzyme khaùc. Tröôøng hôïp hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh :  Hoaït hoùa chaát mang baèng cyanogen halogenur : Caùc chaát mang coù baûn chaát laø polysaccharide ( OH) thöôøng ñöôïc hoaït hoùa sô boä baèng cyanogen halogenur. Phaûn öùng hoaït hoùa xaûy ra trong moâi tröôøng kieàm. Chaát mang hoaït hoùa coù khaû naêng lieân keát coäng hoùa trò vôùi [ NH2] cuûa protein cuûa enzyme. Porath vaø Bar Eli laàn ñaàu tieân hoaït hoùa cellulose, agarose vaø dextran baèng phöông phaùp naøy. Quaù trình dieãn ra nhö sau: Khi xöû lyù polysaccharide baèng BrCN seõ taïo ra imidocarbonate. Carbonate beàn vöõng, coøn imidocarbonate töông taùc vôùi [ NH2]
23 OH OH CN N O CNBr C NH OH OH O + ENZYME + ENZYME NH O O C NH ENZYME O C NH ENZYME OH OH  Hoaït hoùa baèng ethyl chloroformate : Khi söû duïng phöông phaùp hoaït hoùa baèng cyanogenbromide, Cyanogenbromide vaø caùc saûn phaåm trung gian raát ñoäc. Chloroformate coù theå ñöôïc söû duïng ñeå taïo ra caùc saûn phaåm trung gian töông töï nhöng khoâng coù ñoäc tính. Phöông phaùp ñöôïc thöïc hieän nhö sau : O OH O ClO 2 C2 H 5 O C NH ENZYME ENZYM CO OH O OH  Hoaït hoùa baèng carbodiimide Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm carboxyl, coù theå ñöôïc hoaït hoùa baèng caùc daãn xuaát carbodiimide. Phaûn öùng xaûy ra trong moâi tröôøng acid yeáu (pH = 5), neân phöông phaùp hoaït hoùa naøy phuø hôïp vôùi caùc enzyme amylas e, pepsin, cellulase …
24 R O NH O O R N C N R' ENZYM CO C COH C NH ENZYM N R'  Hoaït hoùa baèng glutaraldehyde Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm NH2 nhö polyacrylamide,chitin, chitosan, cellulose, tinh boät gheùp acrylamide ñeàu coù theå söû duïng phöông phaùp naøy. Glutaraldehyde laø chaát coù chöùa hai nhoùm aldehyde hoaït hoùa. Moät nhoùm seõ gaén vôùi NH2 cuûa chaát mang, nhoùm coøn laïi seõ gaén vaøo NH2 cuûa enzyme. CH O CH 2 CH O CH O CH O CH 2 CH C CH 2 CH 2 CH C CH 2 CH 2 CH C CH 2 CH 2 CH 2 + ENZYM CH O CH O CH N ENZYM CH O CH CH CH 2 CH 2 CH CH 2 CH 2 CH CH 2 CH 2 NH ENZYM  Hoaït hoùa baèng 3 aminopropyltriethoxysilane Hoaït hoùa baèng trialkoxysilane cho pheùp hoaït hoùa nhöõng vaät lieäu trô nhö thuûy tinh coù theå gaén vôùi enzyme. Thöïc hieän nhö sau :
25 O O O Si OH O Si O Si (CH 2 )3 NH 2 (C 2 H 5 O) 3 Si(CH 2 ) 3 NH 2 O O O O Si OH O Si O Si (CH 2 )3 NH 2 Glass S CCl 2 O O Si O Si (CH 2 )3 NCS O O O Si O Si (CH 2 )3 NCS + ENZYM O S O Si O Si (CH 2 )3 NH C NH ENZYM O O S O Si O Si (CH 2 )3 NH C NH ENZYM  Hoaït hoùa baèng azide Hieän nay phöông phaùp naøy ñöôïc xem laø phöông phaùp haøng ñaàu. Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm chöùc COOH nhö CM Cellulose, polyacrylamide vaø nylon coù theå hoaït hoùa baèng phöông phaùp naøy. Tröôùc heát laø ester hoùa CM Cellulose. Sau ñoù chuyeån ester thaønh hydrazide, roài azide. Azide trong moâi tröôøng kieàm seõ phaûn öùng [ NH2] cuûa enzyme. Phaûn öùng xaûy ra theo sô ñoà :
26 O O CH3OH NH 2 NH 2 OCH 2 COOH OCH 2 C OCH 3 OCH 2 C NH NH 2 OH OH OH HNO2 O O ENZYM OCH 2 C NH ENZYM OCH 2 C N3 OH OH  Hoaït hoùa baèng phaûn öùng diazo Nhöõng chaát mang coù nhoùm amine coù theå söû duïng phöông phaùp naøy. Muoái diazo cuûa chaát mang hoaït hoùa coù theå phaûn öùng khoâng chæ vôùi nhoùm amin maø caû nhoùm phenol, imidizol cuûa protein cuûa enzyme. Phaûn öùng coäng hoùa trò vôùi enzyme xaûy ra nhanh choùng ôû nhieät ñoä thöôøng vaø moâi tröông nöôùc trung bình. Quaù trình hoaït hoùa vaø gaén enzyme nhö sau : O CH 2 NH 2 O CH 2 N N NaNO 2 , HCl OH OH + ENZYM O CH 2 N N ENZYM OH
27  Phöông phaùp lieân keát ion Döïa treân khaû naêng taïo lieân keát giöõa chaát mang vôùi enzyme. Lieân keát ion thöôøng khoâng beàn baèng söï haáp thuï giöõa enzyme vôùi chaát mang. Naêm 1956, Mitz laø ngöôøi ñaàu tieân thöïc hieän phöông phaùp lieân keát ion ñeå gaén enzyme vaøo chaát mang. OÂng ñaõ söû duïng DEAE ñeå gaén enzyme vaøo. Naêm 1966, Tosa ñaõ söû duïng DEAE sephadex nhö moät chaát mang ñeå gaén aminoacrylase trong qui trình coâng nghieäp saûn xuaát amino acid, sau ñoù laø haøng loaït nghieân cöùu theo phöông phaùp naøy vaø ñöôïc aùp duïng khaù thaønh coâng ôû qui moâ coâng nghieäp. d. Phöông phaùp khaâu maïch (cross linking) Nhöõng hôïp chaát coù hai hoaëc ña nhoùm chöùc naêng nhö glutaraldehyde, diisocyanate ñöôïc duøng laøm caàu noái khaâu maïch taïo thaønh ñaïi phaân töû khoâng tan trong nöôùc. Phöông phaùp naøy thöôøng cho hoaït tính thaáp laø do caùc hôïp chaát khaâu maïch coù theå lieân keát vaøo trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Treân ñaây laø moät soá phöông phaùp coá ñònh enzyme, söï löïa chon ñuùng phöông phaùp thích hôïp cho töøng enzyme vaø vaät lieäu coá ñònh chuyeân bieät laø moät yeáu toá toái quan troïng ñeå thu ñöôïc cheá phaåm enzyme coá ñònh coù hoaït tính cao. Ñoàng thôøi caàn xaùc ñònh caùc ñieàu kieän hoaït ñoäng thích hôïp cho enzyme coá ñònh. Vì vaäy ñeå cho quaù trình coá ñònh coù keát quaû neân löu yù : Enzyme phaûi oån ñònh trong nhöõng ñieàu kieän dieãn ra phaûn öùng. Caùc chaát tham gia phaûn öùng taïo lieân keát ngang chuû yeáu chæ töông taùc vôùi nhöõng nhoùm chöùc naêng naèm ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng enzyme hoaëc taïo lieân keát ngang coù kích thöôùc lôùn khoâng cho pheùp noù xaâm nhaäp vaøo trung taâm hoaït ñoäng enzyme. Trung taâm hoaït ñoäng phaûi luoân ñöôïc “baûo veä” baèng nhieàu phöông phaùp khaùc nhau nhö : Enzyme chöùa nhoùm SH thì caàn phaûi xöû lyù sô boä noù baèng glutathinon hay cystein vaø chæ taùi hoaït hoùa enzyme sau khi ñaõ gaén noù vaøo vaät
28 lieäu coá ñònh hoaëc boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng cô chaát ñaõ ñöôïc baõo hoøa bôûi enzyme. Caàn choïn bieän phaùp thích hôïp ñeå taùch “enzyme khoâng ñöôïc gaén” leân vaät lieäu coá ñònh, maø khoâng gaây aûnh höôûng xaáu ñeán enzyme ñöôïc gaén. Khi löïa choïn heä coá ñònh caàn ñeå yù ñeán phaûn öùng cuï theå vaø thaät v oâ nghóa neáu ñöa enzyme vaøo vaät lieäu coá ñònh maø baûn chaát vaät lieäu coá ñònh laø polymer bò phaân giaûi bôûi enzyme naøy xuùc taùc hoaëc ñaëc bieät neáu enzyme bò öùc cheá bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng taïo ra. 2.3. ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYME COÁ ÑÒNH [3] 2.3.1. Trong coâng nghieäp Ngaøy nay, nhieàu qui trình öùng duïng enzyme coá ñònh trong coâng nghieäp nhö coâng nghieäp saûn xuaát röôïu bia, nöôùc giaûi khaùt, cheá bieán söõa, saûn xuaát da, hoùa chaát. Röôïu bia : caùc enzyme amylase, teá baøo naám men coá ñònh enzyme ñöôïc söû duïng vôùi qui moâ lôùn. Cheá bieán söõa : Enzyme lactase coá ñònh ñeå thuûy phaân lactose trong söõa. Naêm 1969 Wilson ñaõ saûn xuaát lieân tuïc glucose baèng glucoamylase coá ñònh. Naêm 1971 ñaõ duøng chymotrysin lieân keát coäng hoùa trò vôùi carboximethyl cellulase laøm ñoâng tuï söõa thay cho renin ñaét tieàn.  Thu nhaän hoãn hôïp glucose fructose Naêm 1973 haõng Clinton Corn (Myõ) ñöa vaøo saûn xuaát coâng nghieäp glucoisomerase chuyeån hoùa glucose thaønh fructose vôùi tæ leä 1:1, thoâng thöôøng ñöôïc gaén vôùi caùc polymer voâ cô qua caùc lieân keát ñoàng hoùa trò.  Taùch hoãn hôïp aminoacid nhôø aminocylase Coâng trình ñöôïc söû duïng ñaàu tieân ôû Nhaät Baûn ñeå saûn xuaát methionine. Haõng Snam Progetti (YÙ) nhoát aminoacid trong sôïi cellulose triacetat. Haõng Tanaka Cuaky (Nhaät) söû duïng phöông phaùp haáp thuï aminoacid treân DEAE Cellulose.
29  Thu nhaän l asparric acid Aspartase coá ñònh xuùc taùc quaù trình gaén nhoùm NH3 vaøo fumaric acid ñeå nhaän ñöôïc L aspartic acid (1973) hieäu suaát chuyeån hoùa laù 80%. Aspartic coá ñònh thu nhaän baèng caùch nhoát teá baøo trong gel polyacrylamide.  Thu nhaän l succinic acid Fumarase coá ñònh chuyeån hoùa fumaric acid thaønh L succinic acid ñöôïc thöïc hieän ôû qui moâ coâng nghieäp naêm 1974, phaûn öùng xaûy ra cho ñeán khi 80% fumaric acid ñöôïc chuyeån hoùa. Fumarase coá ñònh ñöôïc thu nhaän baèng caùch nhoát teá baøo trong gel polyacrylamide hoaëc sôïi triacetate cellulose.  Thu nhaän 6 amino penicillinic acid 6 APA laø baùn saûn xuaát ñeå toång hôïp caùc loaïi penicilin khaùc nhau, laàn ñaàu tieân ñöôïc haõng Snam Progetti 1975 ñaõ söû duïng penicillinamiolase coá ñònh ñeå saûn xuaát penicillin.  Thuûy giaûi lactose Lactose hay coøn goïi laø “ñöôøng söõa” coù ñoä ngoït vaø ñoä hoøa tan thaáp, bò thuûy giaûi bôûi lactase thaønh glucose vaø galactose. Caùc cheá phaåm lactase coá ñònh ñaõ ñöôïc cheá taïo theo phöông phaùp khaùc nhau: nhoát trong sôïi triacetate cellulose, lieân keát ñoàng hoùa trò vôùi caùc polymer chöùa silic, haáp thuï treân caùc chaát trao ñoåi ion.  Thu nhaän töø tinh boät Ñeå thu nhaän glucose phaûi söû duïng hai enzyme laø amylase vaø glucoamylase phaân caét tinh boät thaønh caùc oligosaccharide, coøn glucoamylase phaân caét tinh boät vaø taïo thaønh glucose. Hieän nay ngöôøi ta chuù yù taïo glucoamylase coá ñònh. Haõng Corning Glass ñaõ söû duïng glucoamylase coá ñònh ñeå saûn xuaát 450 kg glucose/ngaøy. Cheá phaåm glucoamylase coá ñònh ñöôïc thu nhaän baèng caùch gaén enzyme treân silicagel, nhoát trong sôïi triacetate cellulose haáp thuï treân DEAE Cellulose.
30 Ngoaøi ra, hieän nay voâ soá enzyme ñaét tieàn khaùc ñang ñöôïc tieán haønh coá ñònh vaø nghieân cöùu söû duïng ôû qui moâ coâng nghieäp. 2.3.2. Trong y hoïc Enzyme coá ñònh ñöôïc öùng duïng nhieàu trong y hoïc, ñeå chöõa caùc beänh di truyeàn do thieáu enzyme hoaëc hoaït ñoä enzyme yeáu. Naêm 1954 Chung ñaõ taïo ñöôïc vi tieåu caàu baùn thaám coù gaén enzyme, nhôø theá enzyme coù theå toàn taïi treân cô theå laâu daøi vì enzyme bò bieät laäp vôùi moâi tröôøng xung quanh. Nhôø theá maø cô theå taïo ñöôïc noàng ñoä cao cuûa enzyme thieáu maø khoâng bò aûnh höôûng ñeán caùc phaûn öùng phuï. Urease coá ñònh ñöôïc duøng ñeå loaïi urea trong maùu cuûa thaän nhaân taïo. Caùc tieåu caàu coù gaén catalase duøng trò thieáu catalase cô. Enzyme coá ñònh coøn ñöôïc duøng trong chaån ñoaùn beänh, ngoaøi caùc öùng duïng ñieän cöïc enzyme, trong phaân tích caùc chæ tieâu sinh hoùa cuûa maùu nhö löôïng glucose, urea, cholesterol… enzyme horse radish peroxidase coá ñònh treân polystyren cuøng vôùi khaùng theå giuùp chaån ñoaùn nhanh vaø chính xaùc (kyõ thuaät ELLISA). Enzyme 1 asparaginase coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa khoái u aùc tính, neáu ñöa tröïc tieáp enzyme naøy vaøo cô theå thì bò ñöa ra ngoaøi nhanh choùng vaø gaây hieän töôïng dò öùng, nhöng neáu ñöa caùc vi tieåu caàu coù gaén enzyme vaøo cô theå seõ coù hieäu quaû hôn. 2.3.3. Trong nghieân cöùu khoa hoïc Tröôùc tieân enzyme coá ñònh laø coâng cuï nghieân cöùu hoùa sinh raát quan troïng. Naêm 1967, ñieän cöïc enzyme ñaàu tieân ñaõ ñöôïc cheá taïo ñeå xaùc ñònh noàng ñoä glucose nhôø glucooxydase coá ñònh. Ñieän cöïc enzyme laø ñieän cöïc oxy treân beà maët coù gel poly acrylamide. Nhuùng ñieän cöïc vaøo dung dòch coù glucose thì cô chaát vaø oxy seõ khueách taùn vaøo gel chöùa enzyme. Nhö vaäy, söï bieán ñoåi doøng ñieän trong heä thoáng ñieän cöïc phuï thuoäc vaøo toác ñoä cuûa phaûn öùng vaø noàng ñoä glucose. Kaetsu ñaõ duøng ñieän cöïc urease ñeå ño noàng ñoä urea trong maùu, duøng cholesterol oxidase ño noàng ñoä cholesterol.