Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột và kháng oxy hóa của cao chiết rau càng cua (Peperomia pellucida)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột và kháng oxy hóa của cao chiết rau càng cua (Peperomia pellucida)" trình bày các nội dung chính sau: Xác định được hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột như α-amylasevà α-glucosidase và khả năng kháng oxi hóa của cao chiết rau càng cua, từ đó định hướng ứng dụng sản xuất thực phẩm có tác dụng phòng ngừa và hỗ trợ ổn định đường huyết cho bệnh nhân tiểu đường tuýp 2.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột và kháng oxy hóa của cao chiết rau càng cua (Peperomia pellucida)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỖ NGUYỄN ANH THƯ Đỗ Nguyễn Anh Thư KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME THỦY PHÂN SINH HỌC THỰC NGHIỆM TINH BỘT VÀ KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT RAU CÀNG CUA (PEPEROMIA PELLUCIDA) LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Đỗ Nguyễn Anh Thư KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT VÀ KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT RAU CÀNG CUA (PEPEROMIA PELLUCIDA) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn : PGS.TS Võ Thanh Sang Thành phố Hồ Chí Minh - 2021
Lời cam đoan Tôi xin được cam đoan đề tài “Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột và kháng oxy hóa của cao chiết rau càng cua (Peperomia pellucida)” được tiến hành công khai, dựa trên sự cố gắng nổ lực của bản thân dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy PGS.TS. Võ Thanh Sang và sự hỗ trợ từ các phòng thí nghiệm của trường Đại học Nguyễn Tất Thành. Các số liệu nghiên cứu và kết quả trong đề tài là trung thực và hoàn toàn không sao chép hoặc sử dụng kết quả của bất kỳ đề tài nghiên cứu nào tương tự. Nếu phát hiện có sự sao chép kết quả của đề tài khác, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2021 Tác giả Đỗ Nguyễn Anh Thư
Lời cám ơn Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Võ Thanh Sang, người thầy đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt và cố vấn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học. Thầy cũng là người đã cho tôi rất nhiều bài học cả về chuyên môn lẫn cách làm việc thông qua các đề tài, dự án của mình và giúp tôi định hướng phát triển trong sự nghiệp. Một lần nữa tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy bằng tất cả tấm lòng và sự biết ơn của mình. Tôi cũng đồng thời xin gửi lời cám ơn đến Qúy Thầy, Cô Viện Sinh học nhiệt đới, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập. Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các bạn đồng nghiệp trường Đại học Nguyễn Tất Thành, gia đình tôi, người đã đồng hành cùng tôi vượt qua bao lần vấp ngã để có được thành quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cám ơn tất cả mọi người. Học viên Đỗ Nguyễn Anh Thư
1 MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................... 4 DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ 5 DANH MỤC HÌNH VẼ .................................................................................. 6 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 7 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 9 1.1. TỔNG QUAN VỀ RAU CÀNG CUA ................................................... 9 1.1.1. Giới thiệu rau càng cua ..................................................................... 9 1.1.2. Vai trò của rau càng cua trong trị bệnh dân gian ............................ 10 1.1.3. Các bài thuốc dân gian trị bệnh tiểu đường từ rau càng cua .......... 11 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HIỆN NAY VỀ RAU CÀNG CUA ...... 11 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước về rau càng cua ......................... 11 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................... 13 1.3. TỔNG QUAN BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TUÝP 2 ........................ 13 1.3.1. Khái niệm ........................................................................................ 13 1.3.2. Triệu chứng ..................................................................................... 14 1.3.3. Cách phòng ngừa và trị bệnh .......................................................... 15 1.3.4. Một số nhóm thuốc trong điều trị ................................................... 15 1.4. ENZYME ALPHA-AMYLASE VÀ ALPHA-GLUCOSIDASE ........ 16 1.5. GIỚI THIỆU VỀ TÁC NHÂN OXI HÓA VÀ KHÁNG OXI HÓA ... 17 1.5.1. Gốc tự do......................................................................................... 17 1.5.2. Chất chống oxi hóa ......................................................................... 18 1.5.3. Các hợp chất phenolic..................................................................... 19 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 20 2.1. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU CHUNG ............................................... 20 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 21 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 21 2.3.1. Tách chiết ........................................................................................ 21
2 2.3.2. Xác định độ ẩm mẫu ....................................................................... 22 2.3.3. Xác định hàm lượng tro toàn phần ................................................. 22 2.3.4. Xác định hàm lượng phenolic tổng................................................. 22 2.3.5. Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế α-amylase......................... 24 2.3.6. Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase ................... 24 2.3.7. Khảo sát khả năng kích thích chuyển hóa glucose vào trong tế bào ................................................................................................................... 25 2.3.8. Phương pháp khảo sát năng lực khử ............................................... 25 2.3.9. Phương pháp khảo sát bắt gốc tự do DPPH.................................... 26 2.3.10. Phương pháp khảo sát bắt gốc tự do ABTS+ ................................ 26 2.3.11. Khảo sát độc tính của cao chiết lên tế bào .................................... 27 2.3.12. Khảo sát độc tính cấp của rau càng cua trên mô hình chuột nhắt trắng .......................................................................................................... 28 2.3.13. Khảo sát khả năng làm giảm đường huyết của cao chiết rau càng cua ở chuột có đường huyết cao ............................................................... 28 2.3.14. Xử lý số liệu .................................................................................. 29 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 30 3.1. KẾT QUẢ VỀ TÁCH CHIẾT .............................................................. 30 3.2. KẾT QUẢ VỀ ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT PHENOLIC TỔNG TRONG CAO CHIẾT ETHANOL TỪ RAU CÀNG CUA ........................ 31 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ALPHA- AMYLASE VÀ ALPHA-GLUCOSIDASE ................................................ 32 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH CHUYỂN HÓA GLUCOSE VÀO TRONG TẾ BÀO.................................................. 34 3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT RAU CÀNG CUA........................................................................... 35 3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH HẠ ĐƯỜNG HUYẾT Ở CHUỘT TIỂU ĐƯỜNG CỦA RAU CÀNG CUA ..................................... 39 3.6.1. Kết quả xây dựng mô hình gây đái tháo đường ở chuột nhắt trắng 39 3.6.2. Kết quả thử nghiệm cao chiết rau càng cua trên chuột ĐTĐ do STZ ................................................................................................................... 43
3 3.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA CAO CHIẾT RAU CÀNG CUA ............................................................................................................. 47 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 49 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 49 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 49 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 56 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 63
4 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ABTS 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate BHA Butylated hydroxyl anisole DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNS Acid dinitrosalicylic DPPH 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl ĐTĐ Bệnh đái tháo đường EtOAc Ethyl Acetate FBS Huyết thanh nhau thai bò HepG2 Tế bào gan MTT 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide PBS Dung dịch đệm Phosphate P-NPG 4-Nitrophenyl-β-D-glucuronic acid, Goldbio STZ Streptozotocine
5 DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1. Kết quả thu nhận cao chiết từ rau càng cua .................................. 30 Bảng 3.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylasecủa cao chiết rau càng cua .... 33 Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết rau càng cua ......................................................................................................................... 33 Bảng 3.4. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết rau càng cua ............ 38 Bảng 3.5. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ của cao chiết rau càng cua ........... 38 Bảng 3.6. Nồng độ đường huyết (mg/dL) ở chuột trước và sau tiêm STZ .... 41 Bảng 3.7. Trọng lượng chuột (g) trước và sau tiêm STZ ............................... 41 Bảng 3.8. Nồng độ đường huyết (mg/dL) ở chuột tiểu đường sau khi cho uống cao chiết rau càng cua ............................................................................ 44 Bảng 3.9. Sự thay đổi trọng lượng chuột (g) sau thời gian khảo sát .............. 45
6 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Hình cây rau càng cua (Peperomia pellucida) ................................. 9 Hình 2.1. Quy trình thí nghiệm .....................................................................20 Hình 3. 1. Đường chuẩn axit galic.................................................................. 32 Hình 3. 2. Giá trị IC50 về hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase của cao chiết rau càng cua và acarbose. ....................................................................... 34 Hình 3. 3. Khả năng kích thích chuyển hóa glucose vào trong tế bào gan của cao chiết rau càng cua. .................................................................................... 35 Hình 3. 4. Năng lực khử của cao chiết rau càng cua. ..................................... 36 Hình 3. 5. Giá trị IC50 về khả năng bắt gốc tự do của cao chiết rau càng cua và vitamin C. ................................................................................................... 39 Hình 3. 6. Sự thay đổi đường huyết của chuột sau khi tiêm STZ so với ban đầu. .................................................................................................................. 42 Hình 3. 7. Sự thay đổi trọng lượng của chuột sau khi tiêm STZ so với ban đầu. .................................................................................................................. 42 Hình 3. 8. Sự thay đổi đường huyết chuột trong thời gian thử nghiệm 7 ngày và 14 ngày. ...................................................................................................... 46 Hình 3. 9. Sự thay đổi trọng lượng chuột trong thời gian thử nghiệm 7 ngày và 14 ngày. ...................................................................................................... 46 Hình 3. 10. Khảo sát độc tính của cao chiết rau càng cua trên dòng tế bào gan. ......................................................................................................................... 47 Hình 3. 11. Sự thay đổi trọng lượng chuột sau thời gian uống cao chiết ....... 48
7 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) còn được gọi là bệnh tiểu đường là một căn bệnh mạn tính với biểu hiện lượng đường trong máu tăng cao bất thường. Nguyên nhân dẫn đến căn bệnh này có thể là do cơ thể người bệnh thiếu hụt hay đề kháng với insulin, dẫn đến rối loạn cơ chế chuyển hóa đường trong máu. Lượng đường trong máu cao lâu ngày sẽ gây tổn thương tới các mạch máu và dây thần kinh trong cơ thể, dẫn đến rối loạn hay suy giảm chức năng nhiều cơ quan, đặc biệt là tim, mắt, thận, và thần kinh [1]. Cùng với bệnh ung thư và tim mạch, ĐTĐ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 3 chỉ sau tim mạch và ung thư. Theo thống kê của Bộ Y tế, năm 2015 trên thế giới có 415 triệu người mắc bệnh và ước tính đến năm 2040 có trên 615 triệu người mắc bệnh ĐTĐ. Tại Việt Nam, hiện có khoảng 3,5 triệu người bị ĐTĐ, gấp 10 lần so với 10 năm trước đây và dự báo con số này sẽ tăng lên 6,1 triệu vào năm 2040. Trong 10 năm, tỉ lệ tiền tháo đường cũng tăng lên gấp đôi từ 7,7% lên 14%. Tại Việt Nam, ở nhóm tuổi 20-79 tỷ lệ bệnh ĐTĐ là 5,7%, rối loạn dung nạp glucose là 8,2%, chưa được chẩn đoán là 53,4%. Mỗi năm ước tính 30.096 người tử vong do các nguyên nhân liên quan ĐTĐ. Chi phí điều trị khá cao trên 300 usd/ 01 người mắc bệnh ĐTĐ. Do đó, việc tìm ra những bài thuốc mới từ thiên nhiên vừa có công dụng hạ đường huyết hoặc là chất thay thế insulin vừa không gây tác dụng phụ và giá thành phù hợp với thu nhập người dân nước ta là rất cần thiết. Rau càng cua được phân bố ở nhiều nước Nam Mỹ, Châu Á và các nước châu Phi [2]. Một số báo cáo cho rằng, trong rau càng cua có các chất alkaloid, saponin, tannin, cardennolit, flavonoid, tinh dầu và carotol [3, 4]. Rau càng cua được sử dụng để điều trị đau, áp-xe, mụn trứng cá, nhọt, đau bụng, mệt mỏi, bệnh gút, nhức đầu, thận rối loạn và đau khớp thấp khớp [2, 4, 5]. Ở Việt Nam, rau càng cua được sử dụng nhiều trong các món ăn và được làm các bài thuốc trong dân gian nhằm điều trị phế nhiệt, viêm họng hoặc khô cổ khản tiếng, tiểu đường, đau lưng cơ co rút, thiếu máu, mụn nhọt…. Gần đây, rau càng cua được tin truyền trong dân gian với khả
8 năng trị bệnh ĐTĐ, tuy nhiên minh chứng khoa học chưa được kiểm chứng cụ thể. Vì vậy, việc đánh giá hoạt tính kháng ĐTĐ của rau càng cua là điều cần thiết nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu sơ bộ về hoạt tính kháng ĐTĐ của nó, đồng thời tạo cơ sở cho việc phát triển sản phẩm nhằm phục vụ cộng đồng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ĐTĐ. Mục tiêu của đề tài Xác định được hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột như α-amylasevà α-glucosidase và khả năng kháng oxi hóa của cao chiết rau càng cua, từ đó định hướng ứng dụng sản xuất thực phẩm có tác dụng phòng ngừa và hỗ trợ ổn định đường huyết cho bệnh nhân tiểu đường tuýp 2. Đối tượng nghiên cứu - Rau càng cua thu mua ở cửa hàng rau sạch Quận 7, TP HCM. Phạm vi nghiên cứu - Rau càng cua được bán tại cửa hàng rau sạch Quận 7, TP HCM - Mô hình khảo sát kháng đái tháo đường in vitro và in vivo. - Thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm của trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Tp. Hồ Chí Minh. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Nghiên cứu này sẽ giúp làm rõ được vai trò có lợi của rau càng cua đối với việc hỗ trợ làm giảm đường huyết, từ đó nhận thấy được vai trò và tác dụng của các loại rau ăn hàng ngày đối với việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ĐTĐ. Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho nghiên cứu lâm sàng để tiến đến sản xuất sản phẩm phục vụ nhu cầu cộng đồng trong việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ĐTĐ.
9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ RAU CÀNG CUA 1.1.1. Giới thiệu rau càng cua Rau càng cua (Peperomia pellucida) là một loại rau thuộc họ Hồ tiêu (Pellucida). Đây là loại rau hoang dại, mọc nhiều nơi, sống trong vòng một năm, phân bố ở những khu vực có khí hậu nhiệt đới (Hình 1.1). Rau sống thích hợp ở những nơi ẩm ướt, sức sống mạnh, hạt rất nhỏ nên dễ phân tán nơi xa, khi gặp điều kiện thích hợp sẽ lên cây và lan rộng ra. Rau càng cua còn được biết đến với nhiều tên gọi như rau tiêu hay còn có tên là đơn kim, đơn buốt, cúc áo, quỷ châm thảo, thích châm thảo, tiểu quỷ châm, cương hoa thảo. Hình 1. 1 Hình cây rau càng cua (Peperomia pellucida) Rau càng cua thuộc loại thân thảo, thân mộng nước có thể đạt đến 30 – 60 cm cao, láng, toàn thân nhớt, trong suốt màu xanh lá cây nhạt, thân tròn, trong, không màu thường khoảng 5-7 mm đường kính. Lá mọc cách, đơn và nguyên, không lá chét, có cuống, phiến dạng màng, trong suốt, hình tam giác
10 - trái xoan, hình tim ở gốc, hơi tù và nhọn ở chóp, dài 15-20mm, rộng gần bằng đài. Hoa mọc thành chùm dài ở đầu cây hợp thành bông dạng sợi có cuống ở ngọn, dài gấp 2-3 lần lá, quả mọng hình cầu, đường kính 0,5mm, có mũi nhọn cứng ngắn ở đỉnh. Rễ chùm phát triển mạnh trong diều kiện môi trường sống ẩm ướt, mát mẻ. Rau càng cua được coi là cây thuốc được sử dụng bởi nhiều nước trên thế giới. Tại Ấn Độ, thân rau càng cua được báo cáo là có giá trị dược liệu tốt trong y học cổ truyền. Hiệu suất tách chiết bằng methanol và nước thu được lần lượt là 7,25% và 15,05%. Trong đó có sự xuất hiện của carbohydrate, alkaloids, tannin, flavonoid, triterpenoids, steroid, … và không có saponin và protein đối với các chiết xuất methanol, đây là những chất có khả năng kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm, chống oxy hóa, giảm đau … Tuy nhiên không xác định rõ hàm lượng của từng chất trong quá trình nghiên cứu [6]. Năm 2019, Nayara Sabrina F. Alvesa và cộng sự khẳng định lại trong rau càng cua có các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, độc tế bào, chống oxy hóa, chữa lành gãy xương, chống ĐTĐ và chống tăng cholesterol máu thông qua thu thập thông tin từ các nghiên cứu trước. Tuy nhiên, hầu hết các báo cáo chưa xác định được các hợp chất hoạt động. Điều này nói lên được tiềm năng dược liệu của rau càng cua và cần phải nghiên cứu sâu hơn đặc tính dược lý và các thành phần hóa thực vật của loại cây này [7, 8]. 1.1.2. Vai trò của rau càng cua trong trị bệnh dân gian Trong y học dân gian, P. pellucida được báo cáo rộng rãi như một loại thuốc trong nhiều nền văn hóa. Ở khu vực Đông Bắc của Brazil, loài này thường được sử dụng để điều trị áp xe, mụn nhọt, vết loét trên da, viêm kết mạc, tăng huyết áp. Ở Nam và Trung Mỹ, nó được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm của địa phương cộng đồng vì nó kích thích sự thèm ăn và tiêu hóa [7]. Loại thảo mộc này cũng đóng một vai trò quan trọng trong y học của một số nước châu Á. Ở Sri Lanka, rau càng cua dùng cho điều trị tiêu chảy, kiết lỵ, nhiễm trùng họng, tê liệt, động kinh, co giật, niêm mạc và ung thư. Ở
11 Bangladesh, cây thường được dùng để chữa bệnh đường tiêu hóa như các rối loạn kiết lỵ, tiêu chảy, khó tiêu, đau bụng, chua, táo bón, đầy bụng, thèm ăn và đau bao tử. Ở bán đảo Malaysia, P. pellucida được sắc uống để chữa phong thấp mệt mỏi. Bên cạnh đó, nước sắc của toàn bộ cây được sử dụng để điều trị đau khớp ở Singapore. Người Karens ở Trung Adaman, Ấn Độ, sử dụng cây này như một phương pháp điều trị vết cắt, vết thương, nhức đầu, sốt và suy nhược. Ở Việt Nam, cây được dùng làm thuốc đắp ấm chống sốt rét, nhức đầu, thương tích, bỏng, đau dạ dày, hạ huyết áp, viêm họng, viêm ruột thừa, viêm gan truyền nhiễm [7]. 1.1.3. Các bài thuốc dân gian trị bệnh tiểu đường từ rau càng cua - Rau càng cua 100g rửa sạch bóp giấm (có thể dùng chanh), ếch 1 con (100g), lột da, làm sạch bỏ đầu, lấy thịt tẩm bột, rán chín vàng. Tất cả trộn đều, ăn tuần 2-3 lần. - Người bị bệnh tiểu đường có thể ăn món rau càng cua đều đặn mỗi tuần 3 lần để giữ lượng đường huyết ổn định trong cơ thể bằng cách nấu nước uống hoặc sử dụng như rau. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HIỆN NAY VỀ RAU CÀNG CUA 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước về rau càng cua - Về hoạt tính kháng tiểu đường Hoạt tính kháng ĐTĐ của rau càng cua được đánh giá ở chuột mắc bệnh ĐTĐ do alloxan gây ra. Chuột được cho ăn ở chế độ có bổ sung P. pellucida 10% và 20% có thể làm giảm 64% và 68% đường huyết so với nhóm chứng âm được cho ăn bằng nước, trong khi nhóm chứng dương có dùng thuốc thương mại là glibenclamide (600 µg/kg thể trọng) làm giảm 62%. Bên cạnh đó, rau càng cua còn làm tăng hoạt động của các enzyme kháng oxi hóa như superoxide dismutase, catalase và glutathione [9]. Thử nghiệm dung nạp glucose qua đường miệng ở chuột mắc bệnh tiểu đường do alloxanind gây ra cho thấy rằng chuột được cho ăn với 500 mg/kg chiết xuất rau càng cua làm giảm nồng độ đường huyết đáng kể ở 90 và 120 phút so với nhóm chứng âm. Quá trình sàng lọc thành phần hóa học của các chất chiết
12 xuất từ lá và thân cho thấy sự hiện diện của flavonoid, glycoside, saponin và carbohydrate nhưng âm tính với tannin [10]. Đáng chú ý, hợp chất chống ĐTĐ mới, 8,9-đimetoxy ellagic axit, được phân lập từ etyl axetat từ lá của rau càng cua Indonesia bằng phương pháp tách sắc ký trên silica gel 60 (Merck). Hợp chất này đã làm giảm 33,7% lượng đường huyết ở chuột tiểu đường do alloxan gây ra khi so sánh với nhóm chứng âm [11]. Mặc dù nghiên cứu về hoạt tính kháng tiểu đường của rau càng cua đã được khảo sát trên thế giới, nhưng số lượng các nghiên cứu còn rất hạn chế. - Về hoạt tính kháng oxi hóa của rau càng cua Một số nghiên cứu đã công bố tiềm năng kháng oxi hóa của rau càng cua. Rau càng cua ở các nồng độ 0,1 mg/mL và 0,2 mg/mL có thể làm giảm 97,9% và 98,6% gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH), cao hơn so với axit ascorbic tiêu chuẩn (90,9% và 68,7%), butylated hydroxyl anisole (BHA) (95,4% và 94,3%) và a-tocopherol (15,4% và 12,4%) [12]. Trong nghiên cứu khác, chiết xuất EtOAc và methanol có khả năng bắt gốc tự do DPPH tại giá trị IC50 lần lượt là 74 µg/ml và 150 µg/ml [13]. Chiết xuất methanol rau càng cua từ Malaysia có khả năng thu dọn gốc tự do mạnh nhất tại giá trị IC50 = 83,0 µg/ml so với BHT (IC50 = 27 µg/ml (Mutee và cộng sự, 2010). Wei và các đồng nghiệp đã cho thấy rằng chiết xuất methanol từ lá của rau càng cua tại Malaysia có thể bắt 30% gốc DPPH tại nồng độ 625 μg/ml [14]. - Về các hoạt tính khác của rau càng cua Một số hoạt tính sinh học của rau càng cua như kháng khuẩn, kháng ung thư đã được khảo sát. Al-Madhagi và cộng sự đã khảo sát được hoạt tính bắt gốc tự do đáng kể của cao chiết methanol và dichloromethane của rau càng cua. Trong khi đó, cao phân đoạn petroleum ether có thể ức chế tốt đối với sự sinh trưởng của các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư bạch cầu WE-HI [15]. Tương tự, Idris và cộng sự cũng chứng minh được khả năng kháng một số dòng vi khuẩn của cao phân đoạn hexan như Escherichia coli ATCC
13 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC 34089, Salmonella typhi ATCC 22648, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và Pseudomonas aeruginosa tại MIC 25 µg/ml [16]. Bên cạnh đó, hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu rau càng cua trên một số dòng vi khuẩn khác cũng được nghiên cứu như Enterobacter cloacae, Mycobacterium smegmatis, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, và Vibrio paraheamolyticus [17]. Chiết xuất ete dầu mỏ làm giảm đáng kể tình trạng viêm ở liều 1000 mg/kg so với indomethacin (10 mg/kg) [18]. Tương tự, liều 200 và 400 mg/kg dịch chiết nước từ lá cho thấy hoạt tính chống viêm 49,1% và 51,1% trên chuột phù nề do carrageenan gây ra [19]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước về dược tính rau càng cua vẫn còn rất hạn chế. Theo nghiên cứu của Phùng Bích Hòa, thân và lá rau càng cua tươi có chứa protein (9,02g/100g), đường khử (0,98g/100g), glucid (4,84g/100g), lipid (22,03g/100g), và vitamin C (42,24mg/100g). Dịch chiết từ thân và lá rau càng cua có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Staphylococcus aureus [20]. Trong một nghiên cứu khác, Hà Quang Thanh và Nguyễn Thị Thu Hương đã chứng minh được rằng rau càng cua có tác dụng chống loãng xương ở chuột nhắt trắng [21]. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng ĐTĐ và kháng oxi hóa vẫn chưa được triển khai thực hiện ở Việt Nam. Vì vậy, nghiên cứu này được đề xuất nhằm khảo sát được hoạt tính kháng oxi hóa và kháng ĐTĐ tiềm năng của cao chiết rau càng cua trên mô hình thí nghiệm in vitro. 1.3. TỔNG QUAN BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TUÝP 2 1.3.1. Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong các căn bệnh mãn tính, nguy hiểm và thường gặp nhất ở Việt Nam. Đây là hậu quả của sự rối loạn chuyển hóa carbohydrate do sự thiếu hay giảm insulin hoạt động trong tuyến tụy của cơ thể. Biểu hiện đặc trưng căn bệnh này là lượng đường trong máu tăng bất thường và gây nhiều rối loạn phức tạp dễ đưa đến các biến chứng cấp tính. Ở
14 những người bị bệnh ĐTĐ, tuyến tuỵ không sản xuất đủ insulin hoặc cơ thể kháng insulin, lượng đường không đưa vào bên trong tế bào mà ở lại trong máu và tăng cao, khi thận không giữ được nữa thì đường sẽ theo nước tiểu đi ra ngoài. Do đó, căn bệnh này mới có tên là đái tháo đường [1]. ĐTĐ tuýp 2 không phụ thuộc vào insulin. Trường hợp này khá phổ biến chiếm phần lớn gần 90 % số lượng bệnh nhân mắc ĐTĐ và diễn biến phức tạp. Có hai yếu tố chính liên hệ mật thiết là sự đề kháng isulin và rối loạn tiết insulin. Khởi đầu của bệnh là sự kháng insulin do béo phì, tuổi tác hay ít vận động làm cho insulin bị giảm hiệu quả trong việc chuyển đường glucose từ máu vào gan, cơ vân. Do đó, đòi hỏi tụy tạng phải tăng cường việc tiết ra insulin, dễ dàng gây tổn thương tụy tạng, lượng insulin được tiết ra giảm. Cộng hưởng giữa việc kháng insulin và giảm tiết insulin làm đường huyết tăng cao đã gây nên căn bệnh này. Khi protein của tế bào tổng hợp kém thì không tổng hợp được các thụ thể để bắt giữ insulin. Dù tuyến tụy vẫn tiết insulin bình thường nhưng glucose không được đưa vào trong tế bào. Hầu như những người béo phì hay người lớn tuổi dễ bị mắc ĐTĐ tuýp 2 do nguyên nhân trên [2]. 1.3.2. Triệu chứng ĐTĐ cấp có các triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu đêm và có thể tiểu dầm ở trẻ em, hay khát nước, ăn nhiều hoặc chán ăn, ăn nhiều đồ ngọt hơn bình thường hay cơ thể mệt mỏi, sụt cân bất thường. Ngoài ra, thời kì tiền ĐTĐ cũng có các triệu chứng cần lưu ý để sớm chuẩn đoán bệnh và chữa trị như mờ mắt hay hoa mắt, rối loạn chức năng tình dục ở nam, tê và ngứa ran vùng tay chân, thay đổi màu da hay các tình trạng nhiễm trùng kéo dài và tái phát (nhiễm trùng da, viêm đường hô hấp, nhiễm trùng vùng tiểu, …). ĐTĐ là căn bệnh nguy hiểm nên nếu không có sự kiểm soát, theo thời gian, bệnh sẽ dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng, ảnh hưởng xấu sức khỏe con người. Hôn mê là biến chứng cấp tính thường gặp nhất ở bệnh ĐTĐ do nhiều nguyên nhân như nhiễm ceton, tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ glucose huyết, acid lactic tăng cao trong máu. Tăng nồng độ glucose máu dẫn đến biến chứng mãn tính của ĐTĐ đặc biệt là biến chứng mạch máu. Chính vì thế trên thế
15 giới có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của kiểm soát glucose máu đối với các biến chứng mãn tính. Các biến chứng này bao gồm biến chứng mạch nhỏ (bệnh võng mạc, bệnh thận và thần kinh) và các biến chứng mạch máu lớn (xơ vữa động mạch tim mạch, bệnh mạch máu não và mạch máu ngoại biên) [3]. 1.3.3. Cách phòng ngừa và trị bệnh - Chế độ ăn uống: Chế độ ăn uống là phương pháp trị liệu cơ bản nhất với các nguyên tắc tiêu thụ năng lượng trong phạm vi thích hợp. Chế độ ăn cần giữ được sự cân bằng về dinh dưỡng; bổ sung năng lượng và vitamin; tránh ăn quá nhiều hoặc ăn uống thất thường. Chế độ ăn tốt sẽ kiểm soát được lượng glucose máu và ngăn ngừa các biến chứng xấu xảy ra [4]. - Vận động: Vận động cơ thể phải phù hợp với lứa tuổi, tình trạng sức khỏe và sở thích cá nhân và đúng cách. Đối với người mắc bệnh ĐTĐ, những môn rèn luyện sự dẻo dai bền bỉ cần được ưu tiên hơn những môn cần sử dụng nhiều thể lực. Hoạt động thể lực thường xuyên hàng ngày giảm 5% trọng lượng cơ thể làm giảm 55 % tỷ lệ ĐTĐ mới mắc trên nhóm đối tượng nguy cơ cao. Việc tập luyện thể lực thường xuyên làm giảm nồng độ glucose huyết tương ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2, duy trì sự bình ổn của lipid máu, huyết áp, cải thiện tình trạng kháng insulin và cải thiện tích cực về tâm lí [3]. 1.3.4. Một số nhóm thuốc trong điều trị Cho đến nay, nhiều loại thuốc đã được thương mại và đang được sử dụng trên thị trường để góp phần hỗ trợ chữa trị tình trạng ĐTĐ [5, 22, 23]. Dưới đây là một số liệu pháp phổ biến như: - Nhóm Insulin: Tác dụng chủ yếu của insulin là xúc tiến quá trình oxy hoá glucose, chuyển glucose thành lipid, kìm hãm sự phân giải glycogen ở gan, kìm hãm sự sản sinh thể ceton. Khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúp glucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạt động của các tế bào. Dựa vào nguồn gốc có thể chia insulin làm hai loại là insulin có nguồn gốc động vật và
16 insulin người; dựa vào dược động học có thể chia làm 3 loại là insulin tác dụng nhanh, insulin tác dụng thường và insulin tác dụng trung gian. - Nhóm Sulphonylurea: Tolbutamide, Chlorpropamide, Glibenclamide, Gliclazide, Glimepiride, Glipizide, Glinide thuộc nhóm Sulfonylurea là những thuốc điều trị bệnh. Cơ chế hoạt động là kích thích bài tiết insulin, làm tế bào beta nhạy cảm với các chất kích thích tiết insulin khác, tăng giải phóng insulin để đáp ứng với nồng độ cao của đường trong máu. Hạ glucose trong máu quá thấp thường hay gặp khi dùng thuốc Chlorpropamide và Glibenclamide, nhất là ở những bệnh nhân già, bệnh nhân có bệnh gan hoặc thận. - Thuốc Glucobay (Acarbose): Glucose huyết tăng sau bữa ăn khá phổ biến ở các bệnh nhân bệnh ĐTĐ tuýp 2. Enzym α-glucosidase có vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu thức ăn ở niêm mạc ruột non. Đây là loại thuốc gây ức chế hoạt động của αamylase và α-glucosidase nên làm chậm quá trình hấp thu carbohydrate ở đường tiêu hóa, làm giảm hấp thu đường, gây giảm glucose trong máu sau ăn. Thuốc có tác dụng phụ như gây tiêu chảy, đau bụng, nổi ngứa, vàng da. 1.4. ENZYME ALPHA-AMYLASE VÀ ALPHA-GLUCOSIDASE Alpha-amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác việc phân giải các liên kết α (1,4) glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước. Enzyme này có nhiệm vụ phân giải tinh bột thành các sản phẩm có độ dài mạch liên kết ngắn hơn như dextrin, maltose, glucose… [24]. Alpha-glucosidase là một glucosidase nằm trong đường viền của ruột non tác động lên các liên kết α-(1→4) [25]. Alpha-glucosidase phá vỡ tinh bột và disacharide thành glucose. Alpha-glucosidase thủy phân các dư lượng α- glucose liên kết không khử (1→4) để giải phóng một phân tử α-glucose duy nhất. Như vậy hai emzyme trên đều có vai trò trong việc làm tăng đường huyết sau ăn, và vì thế chúng được xem là một trong những mục đích cần hướng đến trong liệu pháp điều trị đái tháo đường [26]. Acarbose là một trong những loại thuốc thương mại phổ biến được dùng trong điều trị đái tháo