Luận văn công nghệ sinh học: Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (wssv) trên tôm sú (penaeus monodon)

Chia sẻ: Nguyen Khanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:42

Thêm vào BST

Báo xấu

206
lượt xem 56
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn công nghệ sinh học: Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (wssv) trên tôm sú (penaeus monodon).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn công nghệ sinh học: Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (wssv) trên tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005
LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường.  TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.  Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii
TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005. Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2). Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon). Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độ khác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV. Sau khi sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virus WSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thí nghiệm. Đánh giá tác dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm. Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D2, B, M: Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml): Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus. Hợp chất B và D2 có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml). iv
MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ......................................................................................................... iii Tóm tắt ..............................................................................................................vi Mục lục .............................................................................................................. v Danh sách các hình ......................................................................................... viii Danh sách các bảng và sơ đồ ............................................................................ix PHẤN 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................... 1 1.2 Mục đích, yêu cầu ............................................................................. 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới ................................................ 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam. ...................................4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú .......................................... 6 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú ....................................................... 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................ 7 2.4.2 Khu vực phân bố...................................................................7 2.4.3 Ký chủ .................................................................................. 8 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền ............................... 8 2.4.5 Cơ chế xâm nhập ..................................................................9 2.4.6 Bệnh lý ................................................................................. 9 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay....... 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến ............................................. 10 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR ................. 10 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật...................................................... 11 2.6.1 Alkaloid .............................................................................. 11 v
2.6.2 Flavonoid............................................................................ 12 2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản.............................. 12 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 15 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ...................................................... 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 15 3.2.1 Vật liệu sinh học ................................................................. 15 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất ........................................................... 15 3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm.......... 15 3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt ... 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 16 3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus ...................... 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm .............................. 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu ......................................................... 16 3.3.4 Phương pháp PCR .............................................................. 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính ................................... 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng ................................ 17 3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường ................ 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................ 18 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng ............................... 18 3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm ............................ 19 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................... 20 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng .................................................. 20 4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2 .................................. 20 4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B.................................... 21 4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M ................................... 23 vi
4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và hợp chất D2, B ở các nồng độ khác nhau ................................. 23 4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D2 ......................................... 27 4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B........................................... 29 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 32 vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ ........................ 20 Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ ......................... 21 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ ........................ 22 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 trước thí nghiệm ......................... 28 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 sau thí nghiệm ............................. 28 H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm ........................... 30 H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm .............................. 30 viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG ...............................................................................................TRANG Bảng 2.1 Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng .................... 3 Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng bằng các phương pháp khác nhau...................................................................................................... 10 Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm .......................... 24 Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm ..................................................................................................... 25 Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ ...............................................................................................TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). .................................. 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau. ....................................................................................... 19 ix
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề. Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản không thể đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng giảm do khai thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là một nhu cầu cần thiết. Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần đây, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20 năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm. Một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( White Spot Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến 100 % quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp phòng trị bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn tồn tại nhiều mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao. Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất phong phú. Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong y học và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản là hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướng dẫn, chúng tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)”
2 1.2 Mục đích yêu cầu - Sàng lọc một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). - Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trong điều kiện thí nghiệm.
3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới. Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam. Trong các đối tượng nuôi thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất. Theo công bố của Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO), sản lượng tôm thế giới trong 2 thập kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175 %. Theo báo cáo của hội nghị nuôi tôm toàn cầu (2003), sản lượng tôm nuôi trên thế giới từ 1999 như sau: 1.084000 tấn (1999), 1.143000 tấn (2000), 1.291000 tấn (2001), 1.445000 tấn (2002), và 1.840000 tấn (2003). Mức tăng bình quân khoảng 10,5 % mỗi năm. Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (P. monodon), tôm nương (P. chinensis) và tôm he chân trắng (P. vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm 86 % sản lượng tôm nuôi của thế giới. Nếu tính về sản lượng thì tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong các loài thủy sản nuôi nhưng tính về giá trị thì chúng đứng đầu với 4,046 tỷ USD trong năm 2000. Năm 2000, xuất khẩu tôm thế giới đạt hơn 10,9 tỷ USD. Với hiệu quả kinh tế và xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút các nhà đầu tư. Sự phát triển mạnh mẽ, có thể nói là bùng nổ nghề nuôi tôm trên thế giới ngoài những mặt lợi còn có mặt trái của nó. Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên thế giới đã có rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn. Dịch bệnh đã liên tiếp xuất hiện ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh do virus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm. Ước tính tổng thiệt hại do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD. Bệnh do virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp của các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và Ấn Độ. Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên vào năm 1992 – 1993 ở Bắc Á, sau đó là các khu vực khác trên thế giới. Tên một số quốc gia và năm phát hiện bệnh đốm trắng được trình bày ở Bảng 2.1: Bảng 2.1: Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng. Tên quốc gia Đài Loan Trung Quốc Ấn Độ Thái Lan Nhật Indonesia Úc Việt Nam Năm phát hiện 1992 1993 1994 1994 1994 1994 1994 1994
4 Tỷ lệ gây chết do virus có thể lên đến 100 % trong vòng 3 - 10 ngày kể từ khi có dấu hiệu đầu tiên. 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam. Hoạt động nuôi tôm biển ngày càng đóng vai trò quan trọng ở nước ta. Tôm nước lợ là đối tượng nuôi chủ lực ở các tỉnh ven biển. Diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 546.757 ha (2003), trong đó diện tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm khoảng 2,84 % tổng diện tích nuôi tôm), nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm 3,67 %), còn lại là nuôi quảng canh cải tiến và quảng canh. Năm 2003, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm. Các tỉnh duyên hải Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm 87,17 % của cả nước với 476.528 ha. Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt hơn 200.000 tấn. Trong cơ cấu mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam trong năm 2003, tôm sú vẫn là mặt hàng chủ lực. Khối lượng đạt trên 123.600 tấn, chiếm khoảng 25 %, nhưng về giá trị chiếm khoảng 50 %, đạt hơn 1 tỷ USD. Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 đã báo động trên toàn quốc dịch bệnh tôm đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng. Đồng Bằng Sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất do nơi đây tập trung khoảng 87 % diện tích nuôi tôm của cả nước. Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994 đã xác định tôm sú có ba loại bệnh MBV, bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng (Bùi Quang Tề, 1996, 1997; Nguyễn Việt Thắng và CTV, 1998). Trong những năm gần đây, bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam. Hầu hết các tỉnh khi tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng đã làm tôm chết hàng loạt gây tổn thất nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm. Mùa xuất hiện bệnh là mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn (> 5oC) gây sốc cho tôm. Bệnh đốm trắng thường gây chết tôm sú, tôm rảo, tôm nương và cua, ghẹ. Một số tác giả đã điều tra nghiên cứu diễn biến bệnh đốm trắng ở tôm. Kết quả cụ thể như sau:
5 Ở Việt Nam vào khoảng tháng 2/1994 tại huyện Bình Đại, Thạnh Phú (Bến Tre) và tháng 3 – 4/1994 tại các đầm nuôi của công ty FIDECO, huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đã phát hiện tôm sú bị đốm trắng đã gây chết hàng loạt tôm nuôi sau 30 – 40 ngày thả nuôi (Lý Thị Thanh Loan, 2003) Theo Nguyễn Việt Thắng và cộng tác viên (1996), Tác nhân gây bệnh chính trên tôm sú nuôi thực nghiệm từ 25/10/94 – 25/2/95 trên 9 tỉnh Nam bộ là virus. Vi khuẩn được xem là tác nhân cơ hội gây tác động cộng hưởng. Kết quả nghiên cứu bước đầu qua phân tích mô học cho thấy có đến ít nhất 2 - 3 nhóm virus khác nhau gây bệnh cho tôm nuôi ở miền Nam Việt Nam. Năm 2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3 %) mang mầm bệnh đốm trắng ở tôm nuôi và tôm cua tự nhiên và có 169 hộ (34,99 %) bệnh đốm trắng đã gây tôm chết. Tôm sú nuôi sau 1 - 2 tháng bệnh đốm trắng xuất hiện và gây tôm chết hàng loạt. Tôm sú bố mẹ khi đánh bắt ở biển khơi hoặc trong các đầm phá có hiện tượng bị bệnh đỏ mang sau khi đánh bắt 3 - 4 ngày, tỷ lệ chết tới 80 - 100 %, thời gian tôm bị bệnh và chết nhiều vào tháng 3 – 4 (sau tết). Kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử thấy có xuất hiện các thể virus hình que và test PCR dương tính với bệnh đốm trắng. Năm 2003, phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và tôm chân trắng (Lipopenaeus vannamei) nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh ) và tôm post đưa từ Quảng Nam và Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm post đưa từ miền Trung (Đà Nẵng, Quảng Nam) là 23,08 %; tôm sú nuôi thương phẩm ở các tỉnh phía Bắc là 26,92 %; tôm chân trắng là 13,33 %. Phân tích tỷ lệ lưu hành bệnh WSSV theo tháng trên tôm sú nuôi thương phẩm thì thấy tháng 7, 8, 9 có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (0,25 – 0,4); tháng 6 tỷ lệ thấp hơn (0,12) và tháng 5 chưa phát hiện thấy tôm nhiễm bệnh. Các bệnh trên tôm xảy ra chủ yếu là do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), ngoài ra còn xuất hiện bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây còn xuất hiện bệnh phân trắng, teo gan tụy ở một vài nơi.
6 Các bệnh thường gặp trên tôm nuôi thường được phân chia thành hai loại bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm trong đó chủ yếu là do bệnh truyền nhiễm. Từ tình hình dịch bệnh chung ở trên cho thấy để phát triển bền vững nghề nuôi tôm đòi hỏi phải kết hợp rất nhiều yếu tố quan trọng như nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi tôm thịt, các vấn đề về dinh dưỡng và môi trường, đồng thời không kém phần quan trọng đó là nghiên cứu các tác nhân gây bệnh để tìm ra những biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả. 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú. Môi trường nước gồm một loạt các thông số tác động đến sự sinh trưởng và tái sản xuất của sinh vật. Ở điều kiện bình thường thì giữa sinh vật (vật chủ ), nguồn bệnh và môi trường giữ trạng thái cân bằng, bất cứ sự phá vỡ cân bằng nào đều có thể gây bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, nguồn gốc chính của việc phát sinh bệnh là vấn đề môi trường dù rằng trong bản thân nội tại của vật chủ có sự tồn tại của mầm bệnh, đây không nên xem là nguyên nhân chính sinh ra bệnh. Cơ chế kháng bệnh của tôm chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu, điều này có hạn chế so với động vật có xương sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không có và không tạo ra được kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập. Các phân tử có hoạt tính miễn dịch trong huyết tương (hemolymph) của tôm gồm hai dạng chủ yếu là huyết bào (hemocyte) và các phân tử lectin. Từ máu của giáp xác có thể phân lập được ba nhóm tế bào là bạch cầu không hạt, bạch cầu bán hạt và bạch cầu có hạt. Trong đó bạch cầu không hạt chủ yếu là những thực bào loại bỏ các thể lạ xâm nhập bao gồm virus, vi khuẩn và các tế bào nấm. Số lượng tế bào thực bào chiếm từ 2 - 28 % trong tổng số các tế bào máu. Sự thực bào có thể xảy ra tại nơi bị tổn thương, trong các mô và cơ quan lọc của hệ thống tuần hoàn và đôi khi cả chính trong thể dịch. Hiệu quả của sự thực bào phụ thuộc vào tác nhân xâm nhập, cũng như các yếu tố sinh lý của ký chủ và môi trường. Bạch cầu bán hạt đóng vai trò đầu tiên trong việc phát hiện và bắt giữ các thể lạ có kích thước lớn, và trợ giúp cho hoạt động thực bào thông qua sự hoạt hoá của hệ thống Pro-phenoloxydase. Kết quả của quá trình hoạt hoá này là các sản phẩm oxy hoá được hình thành có hoạt tính cao và do đó rất độc đối với vi sinh vật. Lectin là phân tử glycoprotein có khả năng gắn với phần đường của các phân tử khác, đặc biệt ở các tác nhân lạ. Điều kỳ lạ là vi khuẩn, virus, độc tố cũng có thể có
7 lectin bề mặt. Các phân tử lectin này một mặt có thể giúp nối kết tác nhân lạ với huyết bào tôm, hoạt hóa chúng làm tăng hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn. Mặt khác vi khuần, virus cũng có thể sử dụng lectin để sáp nhập vào tế bào tôm ở vị trí các thụ thể để khởi đầu cho quá trình nhiễm trùng. Ngoài các bạch cầu kể trên thì ở giáp xác có các tiểu quần thể bạch cầu đảm nhiệm chức năng như tế bào diệt tự nhiên, tiêu diệt tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus và tế bào ngoại lai. Như vậy tôm cũng có đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể đối với tác nhân virus nhưng không có tế bào tạo ra kháng thể và không có sự bảo vệ đặc hiệu chống lại tác nhân lạ. Vì vậy sự nhiễm virus dai dẳng tồn tại hiển nhiên trong cơ thể tôm. Vì thế việc tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản thuộc nhóm giáp xác không thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccin mà chủ yếu là các biện pháp tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trường nuôi và sử dụng các chất kích thích miễn dịch. 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú. 2.4.1 Tác nhân gây bệnh. Bệnh đốm trắng được xem là bệnh nguy hiểm và gây hậu quả nghiêm trọng nhất đến ngành nuôi tôm công nghiệp. Bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1993. Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kilodalton. Vỏ bao có 2 lớp protein VP28 và VP 19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24 và Vp15. Nhân có cấu trúc DNA sợi đôi ( dsDNA ): không có thể ẩn ( Occlusion body ). Khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm rất yếu và mềm vỏ do các đốm trắng (nên gọi là bệnh đốm trắng) có đường kính từ 0,5 – 2 mm, hiện rất rõ ở dưới vỏ kitin. Đốm trắng là chất đọng lại không bình thường của muối canxi bởi biểu bì vỏ kitin. Khi đã thấy rõ dấu hiệu này thì tôm chết rất nhanh. 2.4.2 Khu vực phân bố. Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, sau đó bệnh lan rộng ra khắp khu vực Châu Á và trên thế giới. Dịch bệnh được phát hiện trước tiên ở Đài Loan năm 1992, Trung Quốc 1993, sau đó là Nhật, Indonesia, Thái Lan,
8 Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ 1995). Bệnh đã làm giảm nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên. 2.4.3 Ký chủ. Hầu hết các loài tôm he đều có thể nhiễm bệnh này. Một số loài tôm he có thể nhiễm ngoài tự nhiên như P. monodon, P. japonicus, P. chinensis, P. indicus, P. merguiensis, P. seriferus, P. vannamei. Một số tôm he đã bị nhiễm trong điều kiện thí nghiệm như P. stylirotris, P. aztecus, P. duorarum, P. setifecus,… Một điều nguy hiểm là ngoài tôm he, một số loài của Metapenaeus spp cũng bị nhiễm, và một số giáp xác khác như cua (Scylla serrata, Callapa lophos,…), tôm hùm (Parulinus spp), tôm càng xanh (Macrobrachium rosrnbergii), Artemia,…cũng có thể bị nhiễm trong tự nhiên và trong cảm nhiễm nhân tạo. Mặt khác bệnh này có thể xảy ra ở hầu hết giai đoạn phát triển của tôm. Người ta đã gặp bệnh này ở Postlarvae 20 ngày tuổi, tôm mẹ, nhưng thường xảy ra nhất là ở Post 50 – 70 ngày tuổi. Rajendran và CTV (1999) đã nghiên cứu thực nghiệm ở bờ biển Đông Nam Ấn Độ bằng cách lấy virus bệnh đốm trắng từ tôm sú nhiễm bệnh tiêm hoặc cho ăn với 5 loài tôm nước mặn (P. monodon, P. indicus, P. semisulcatus, Metapenaeus monoceros), 2 loài tôm nước ngọt (Macrobrachium rosenbergii, M. idella), 4 loài cua (Scylla serrata, S. tranquebarica, Metapograpsus sp, Sesarma sp) và 3 loài tôm hùm (Panulirus homarus, P. ornatus, P. polyphagus). Tất cả các loài thí nghiệm đều nhiễm virus bệnh đốm trắng. Các loài tôm nhiễm bệnh thực nghiệm đều có dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học như tôm sú nhiễm bệnh tự nhiên. Tỷ lệ dồn tích trong vòng 5 – 7 ngày đối với tôm tiêm virus, 7 – 9 ngày đối với tôm cho ăn virus. Hai loài cua (S. serra và tranquebarica) và tôm hùm không có dấu hiệu bệnh lý. Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự nhiên: tôm sú (P. monodon), tôm thẻ (P. indicus), tôm rảo (Metapenaeus ensis), tôm đất (M. lysianassa) (theo Lý Thị Thanh Loan, 2003); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Bùi Quang Tề, 2003). 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền. Sự phát sinh và bùng nổ bệnh đốm trắng phụ thuộc rất nhiều vào khí hậu, thời tiết và môi trường ao nuôi. Bệnh sẽ xảy ra nếu tôm mang virus và các yếu tố thủy lý, thủy hóa biến động rất lớn vượt ra ngoài ngưỡng sinh thái thích hợp.
9 Bệnh lan truyền theo chiều dọc (từ bố mẹ sang con) và theo chiều ngang (qua nước và thức ăn, các loại giáp xác hoang dã trong ao và do tôm khoẻ ăn con bị nhiễm bệnh đốm trắng). Kết quả theo dõi tôm sú nuôi tại Hải Phòng và Hà Tĩnh năm 2003 của Bùi Quang Tề cho thấy lan truyền theo chiều ngang là chính. 2.4.5 Cơ chế xâm nhập. Theo L .M.passano, đây là dạng DNA virus, hình que ngắn. Khi xâm nhập vào tôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận như nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi thâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào, virus tiếp tục phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào sau đó lan truyền ra môi trường nước, tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập tấn công. Hoặc tôm khoẻ ăn tôm bị nhiễm virus cũng tạo điều kiện cho virus tấn công vào ký chủ mới. Nếu virus không tìm được ký chủ mới nó chỉ có thể sống được trong môi trường nước khoảng 24 giờ. 2.4.6 Bệnh lý Có thể chia bệnh virus đốm trắng thành hai dạng. Dạng 1 là bệnh cấp tính gây tỷ lệ chết cao trong vòng 2 tuần. Bệnh thường gặp ở các loài tôm: P. monodon, P. indicus và P. penicilatus. Dạng 2 là bệnh tiềm ẩn, virus đặc biệt này tồn tại trong các loài tôm Macrobrachium sp, các loại cua tự nhiên, tôm hùm tự nhiên thường không có dấu hiệu bệnh lý rõ rệt. Tuy nhiên một số nhà khoa học khác đã chia bệnh virus đốm trắng xuất hiện ở tôm he thành 3 dạng chính theo các dấu hiệu bệnh. Trong dạng I bệnh xuất hiện (cấp tính và thứ cấp tính) mức độ phá huỷ nhiều ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết trong vòng 7 – 10 ngày và dấu hiệu bệnh lý thể hiện rõ nhất là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ. Tỷ lệ tôm chết từ trung bình đến cao, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm từ trung bình đến cao. Dạng II tôm chết cấp tính. Bệnh xuất hiện tác động làm tôm chuyển màu đỏ, mức độ phá huỷ rất mạnh ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết hầu hết trong vòng từ 2 – 3 ngày, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm rất cao. Dạng III bệnh xuất hiện mãn tính tổ chức mô phá huỷ thấp không có đốm trắng và không có màu đỏ, tỷ lệ tôm chết kéo dài từ 15 - 28 ngày.
10 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay. 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến. Hiện nay có nhiều phương pháp để phát hiện bệnh như phát hiện bệnh: mô học, lai tại chỗ (In Situ Hybridization), PCR (Polymerase Chain Reaction), kính hiển vi điện tử. Năm 1997, Lightner đã đưa ra bản đánh giá chung các phương pháp được ứng dụng để chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng. Bảng 2.2: Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm sú bằng các phương pháp khác nhau (Lightner, 1997). Phương pháp chẩn đoán WSSV Kết quả Kính hiển vi quang học ++ Kính hiển vi phản quang + Kính hiển vi nền đen ++ Kính hiển vi điện tử truyền suốt + Kính hiển vi điện tử quét - Kháng thể huỳnh quang - ELISA với PABs - ELISA với MABs - Mô học ++ DNA mẫu dò ++ PCR +++ Từ bảng đánh giá trên cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy và độ chính xác cao. Vì vậy hiện nay người ta thường sử dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú. 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR. Nguyên tắc: PCR là một kỹ thuật in-vitro (trong ống nghiệm). Bằng kỹ thuật này, một chuỗi phân tử DNA đặc thù nằm giữa hai vùng của một chuỗi đã biết có thể được khuếch đại bởi một chu kỳ nhiệt được lặp đi lặp lại. Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn chính:
11 - Biến tính chuỗi DNA kép thành mạch đơn, ở nhiệt độ 92 – 95oC, chuỗi xoắn kép DNA sẽ tách thành 2 mạch đơn. - Bắt cặp giữa đoạn mồi và (primers) và mạch DNA đơn, sự bắt cặp theo chiều 3’ của sợi DNA mục tiêu ở nhiệt độ khoảng 45 – 55oC. - Tổng hợp mạch DNA bổ sung từ điểm bắt cặp giữa đoạn mồi (primers) và mạch DNA đơn nhờ enzyme DNA polymerase, từ đầu 3’ của primers ở nhiệt độ khoảng 70 – 75oC. Mỗi chu kỳ DNA gồm 3 giai đoạn chính trên. Số chu kỳ được thực hiện là từ khoảng 25 – 40 chu kỳ. Số lượng đoạn gen được khuếch đại, theo lý thuyết là 2n, với n là số chu kỳ. Trong những năm gần đây, công nghệ PCR đã được nâng lên một tầm cao mới với sự ra đời của Realtime PCR. Đây là kỹ thuật dựa trên nền PCR thông thường nhưng có nhiều ưu điểm hơn. Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ được theo dõi trực tiếp. Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Để có được tín hiệu Realtime phản ứng đang diễn ra người ta sử dụng phẩm nhuộm hoặc các probe đặc hiệu. Các phẩm nhuộm như Ethidium Bromide, SYBR green, Hoechst dye khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang. Tuy nhiên các phẩm nhuộm này không cho kết quả đặc hiệu vì nó có thể chèn vào cả những DNA cần tìm và DNA không cần tìm. Vì vậy người ta thường sử dụng các probe hơn, Các probe sẽ phát sáng khi gắn bổ sung với DNA đích và không phát sáng khi ở dạng tự do. 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật. 2.6.1 Alkaloid. Theo R. F. Raffauf (Plant alkaloids: Aguide To Their Discovery and Distribution, 1996), có hơn 10.000 alkaloid khác nhau được khám phá trên 300 họ thực vật khác nhau. Alkaloid là một hợp chất hữu cơ thường có một hay nhiều vòng carbon, có chứa nitơ và có tác dụng dược lý hiệu quả trên cơ thể người và động vật.