Luận văn:Nghiên cứu khả năng tổng hợp pectinase của nấm mốc phân lập từ cơ chất giàu pectin và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Chia sẻ: Nguyen Vang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

158
lượt xem 35
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tổng quan về Phân lập và tuyển chọn nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose. Tiến hành nghiên cứu và đưa ra các kết quả: Phân lập được 40 chủng nấm mốc thu được từ 7 mẫu ở các địa bàn khác nhau như Hà Nội, Sơn Tây, Hưng Yên và Tuy Hòa. Trong đó có 19 chủng có hoạt tính xylanase cao (IU/ml 5); Các chủng nấm mốc phát triển trên môi trường có cơ chất carbon bã lúa mì tốt hơn so với cơ chất hỗn hợp và avicel; Hàm lượng protein trong dịch...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu khả năng tổng hợp pectinase của nấm mốc phân lập từ cơ chất giàu pectin và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG NGUY N TH THÚY HÀ NGHIÊN C U KH NĂNG T NG H P PECTINASE C A N M M C PHÂN L P T CƠ CH T GIÀU PECTIN VÀ NG D NG TRONG CÔNG NGH TH C PH M Chuyên ngành: Công ngh Th c ph m và Đ u ng Mã s : 60.54.02 TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ K THU T Đà N ng – Năm 2011
2 Công trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS.TS. TR N TH XÔ Ph n bi n 1: TS. Đ NG MINH NH T Ph n bi n 2: PGS. TS. PH M NG C ANH Lu n văn s ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n văn t t nghi p th c sĩ k thu t h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 26 tháng 11 năm 2011 Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng - Trung tâm H c li u, Đ i h c Đà N ng
3 M Đ U 1. TÍNH C P THI T C A Đ TÀI Qua nhi u nghiên c u g n ñây cho th y enzym pectinase ngày càng có nhi u ng d ng quan tr ng trong các lĩnh v c c a cu c s ng: trong công nghi p ch bi n th c ph m (như s n xu t rư u vang và nư c gi i khát, s n xu t nư c qu , s n xu t cà phê), trong y h c, công nghi p d t s i, s n xu t gi y, x lý nư c th i…[3]. Bên c nh ñó, pectinase còn mang ñ n m t bư c ti n m i cho nông nghi p. Vi c khám phá ra kh năng kháng b nh th c v t ñã ñư c ki m tra v i m t s ch ng gây b nh. K t qu cho th y, các cây dưa chu t và cà chua non khi ñư c x lý v i enzym pectinase thô thì có s c ñ kháng ch ng l i b nh t t hơn [20]. Th nhưng, trên th c t vi c ng d ng pectinase trong s n xu t chi m m t t l không ñáng k . Theo th ng kê v tình hình ng d ng c a pectinase trong công nghi p trên th gi i ch chi m 3% trong t ng s các enzym ñư c s d ng [6], trong khi enzym này có r t nhi u ý nghĩa trong s n xu t. Trên th trư ng hi n nay, các nư c châu Âu và châu M s n xu t và bán ra th trư ng enzym pectinase cũng như các lo i enzym khác v i s lư ng l n nh t. Vi t Nam, enzym pectinase ch y u ñư c nh p ngo i. Xu t phát t nh ng khía c nh trên, chúng tôi ñã ch n ñ tài “Nghiên c u kh năng t ng h p pectinase c a n m m c phân l p t cơ ch t giàu pectin và ng d ng trong công ngh th c ph m” nh m phân l p ch ng n m m c có kh năng t ng h p enzym pectinase cao, t ñó ti n hành kh o sát m t s ñi u ki n nuôi c y thích h p cho quá trình sinh t ng h p enzym này ñ ti n hành th nghi m ng d ng.
4 2. M C ĐÍCH NGHIÊN C U - Phân l p ch ng n m m c có kh năng sinh t ng h p pectinase cao. - Xác ñ nh thành ph n môi trư ng, các thông s thích h p (nhi t ñ , pH, th i gian nuôi c y) ñ n m m c sinh t ng h p pectinase cao trong môi trư ng s d ng. - Đánh giá kh năng x lý l p nh t qu cà phê c a enzym pectinase quy mô phòng thí nghi m. 3. Đ I TƯ NG VÀ PH M VI NGHIÊN C U - Các ch ng n m m c phân l p t v cam hư ñư c thu nh n ch Hòa Khánh - Liên Chi u – Đà N ng. - Nghiên c u ng d ng enzym pectinase ñ x lý l p nh t qu cà phê quy mô phòng thí nghi m. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U - Phương pháp phân l p n m m c - Phương pháp quan sát hình thái vi sinh v t - Phương pháp thu nh n enzym - Phương pháp xác ñ nh ho t tính enzym pectinase - Phương pháp xác ñ nh ho t ñ enzym pectinase - Phương pháp tinh s ch pectinase c a ch ng NM1 - Phương pháp xác ñ nh hàm lư ng protein 5. Ý NGHĨA KHOA H C VÀ TH C TI N C A Đ TÀI 5.1. Ý nghĩa khoa h c c a ñ tài - Xác ñ nh ñư c ch ng n m m c có ho t tính enzym pectinase cao. - Xác ñ nh thành ph n môi trư ng dinh dư ng, ñi u ki n nuôi c y thích h p ñ ch ng n m m c sinh t ng h p enzym pectinase có ho t ñ cao nh t.
5 - Thi t l p ñư c cơ s khoa h c cho vi c ng d ng enzym thu ñư c trong ch bi n qu cà phê Vi t Nam. 5.2. Ý nghĩa th c ti n c a ñ tài Đ t ra cơ s cho vi c xây d ng quy trình s n xu t enzym pectinase, góp ph n phát tri n ngành công ngh vi sinh nư c ta. Đ ng th i, v i vi c s n su t ñư c enzym pectinase trong nư c s giúp ch ñ ng ngu n enzym cũng như gi m giá thành s n ph m. Ngoài ra, vi c s d ng ch ph m enzym trong quá trình s n xu t cà phê giai ño n tách nh t cho s n ph m cà phê thóc s ch nh t thu n ti n cho phơi s y, nâng cao ch t lư ng s n ph m. 6. C U TRÚC C A LU N VĂN Ngoài ph n m ñ u, k t lu n và tài li u tham kh o, trong lu n văn bao g m các chương sau: + Chương 1: T ng quan + Chương 2: Đ i tư ng và phương pháp nghiên c u + Chương 3: K t qu và th o lu n
6 CHƯƠNG 1: T NG QUAN 1.1. ENZYM PECTINASE Pectinase là nhóm enzym th y phân pectin, s n ph m t o thành là acid galacturonic, galactose, methanol... Đây là nhóm enzym ñư c ng d ng r ng rãi trong k thu t ñ ng sau amylase và protease. 1.1.1. Cơ ch t c a enzym pectinase Pectin là cơ ch t c a enzym pectinase. Pectin r t ph bi n trong t nhiên, ñ c bi t là trong gi i th c v t. 1.1.2. Phân lo i enzym pectinase 1.1.3. ng d ng c a enzym pectinase 1.2. T NG QUAN V N M M C 1.2.1. Hình d ng, kích thư c, c u t o c a n m m c 1.2.2. Dinh dư ng và tăng trư ng c a n m m c 1.2.3. Sinh s n c a n m m c 1.2.4. N m m c sinh t ng h p enzym pectinase 1.3. T NG QUAN V CH BI N CÀ PHÊ 1.3.1. Các ch ng lo i / gi ng cà phê 1.3.2. C u t o c a qu cà phê 1.3.3. Các phương pháp tách nh t qu cà phê 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U TRONG NƯ C VÀ TH GI I V ENZYM PECTINASE 1.4.1. Các công trình trong nư c 1.4.2. Các công trình ngoài nư c
7 CHƯƠNG 2: Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1. Đ I TƯ NG NGHIÊN C U 2.1.1. Nguyên li u - V cam thu mua t ch Hòa Khánh – Liên Chi u – Đà N ng ñư c s d ng ñ phân l p các ch ng n m m c sinh t ng h p pectinase. - Qu cà phê Robusta (cà phê v i) ñư c thu mua t i vư n huy n B o Lâm, t nh Lâm Đ ng. 2.1.2. Hoá ch t 2.1.3. D ng c - Thi t b 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1. Phân l p n m m c b ng phương pháp pha loãng th p phân 2.2.2. Phương pháp gi gi ng 2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái vi sinh v t 2.2.4. Phương pháp thu nh n enzym 2.2.5. Phương pháp xác ñ nh ho t tính c a enzym pectinase 2.2.6. Phương pháp xác ñ nh ho t ñ theo phương pháp so màu v i thu c th DNS (acid – 3,5- dinitrosalicylic) 2.2.7. Tinh s ch pectinase c a ch ng NM1 b ng s c ký l c gel 2.2.8. Đ nh lư ng protein b ng phương pháp quang ph
8 CHƯƠNG 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1. PHÂN L P CÁC CH NG N M M C CÓ KH NĂNG SINH T NG H P PECTINASE Sau nhi u l n phân l p các ch ng n m m c thu nh n t v cam hư trên môi trư ng th ch Czapek, chúng tôi thu ñư c 3 ch ng n m m c có hình thái khu n l c khác nhau ñư c ký hi u là NM1, NM2, NM3. Sau ñó, chúng tôi ti n hành soi n m m c dư i kính hi n vi ñ quan sát ñ c ñi m c u t o bào t và s i n m c a các ch ng n m m c ñó. Hình thái c a các ch ng n m m c MN1, NM2, NM3 có các ñ c ñi m: - Ch ng NM1: khu n l c tròn, b m t l i, mép khu n l c m n, không làm thay ñ i màu c a môi trư ng. Bào t màu ñen, kh i bào t hình c u, s i n m ăn sâu vào môi trư ng, có vách ngăn, cu ng ñính bào t không phân nhánh. Bào t ñính t a ñ u trên ñ u s i n m. - Ch ng NM2: khu n l c tròn, b m t l i, x p, mép khu n l c dày, làm ñ i màu c a môi trư ng (môi trư ng có màu vàng). Bào t màu xanh l c, kh i bào t d ng ch i (chu i bào t ñính hư ng lên cùng m t phía trông gi ng như cái ch i), s i n m không ăn sâu vào môi trư ng, có vách ngăn, cu ng ñính bào t phân nhánh. - Ch ng NM3: khu n l c tròn, b m t l i, mép khu n l c răng cưa, không làm thay ñ i màu c a môi trư ng. Bào t ban ñ u có màu vàng nh t sau chuy n thành màu xanh l c. Kh i bào t hình c u, s i n m ăn sâu vào môi trư ng, có vách ngăn, cu ng ñính bào t không phân nhánh. Bào t ñính t a ñ u trên ñ u s i n m. Như v y, căn c vào ñ c ñi m hình thái c a các ch ng NM1, NM2 và NM3 chúng tôi nh n ñ nh các ch ng này l n lư t là A.niger, P.italicum và A.flavus.
9 3.2. KH O SÁT KH NĂNG PHÁT TRI N TRÊN MÔI TRƯ NG CZAPEK C A CÁC CH NG N M M C PHÂN L P ĐƯ C S phát tri n c a n m m c ñư c xác ñ nh tr c ti p b ng ñư ng kính phát tri n c a khu n l c trên môi trư ng Czapek theo th i gian. B ng 3.2: T ng h p ñư ng kính khu n l c trung bình c a các ch ng n m m c NM1, NM2, NM3 khi nuôi các th i gian khác nhau ĐK khu n Th i gian nuôi trên môi trư ng Czapek (h) Ch ng l c (mm) 24 36 48 60 72 96 n mm c NM1 8,33 13,39 18,72 26,72 32,39 35,50 NM2 1,70 4,28 6,33 8,00 9,67 10,39 NM3 9,78 14,05 20,45 27,33 35,11 37,77 D a vào s li u b ng 3.2 th y r ng kh năng phát tri n c a hai ch ng n m m c NM1 và NM3 g n như nhau và m nh hơn h n so v i ch ng NM2, k t qu này cũng gi ng v i k t qu kh o sát v t c ñ phát tri n c a các ch ng n m m c A.flavus, P.digitatum và P.italicum c a tác gi Đào Thi n và c ng s [13]. 3.3. ĐÁNH GIÁ KH NĂNG SINH ENZYM PECTINASE C A CÁC CH NG N M M C PHÂN L P ĐƯ C Đ ñánh giá kh năng sinh enzym pectinase c a các ch ng n m m c phân l p ñư c, chúng tôi ti n hành nuôi trên 2 môi trư ng: bán r n và l ng. Kh năng sinh enzym pectinase ñư c ñánh giá gián ti p qua ñư ng kính vòng phân gi i pectin.
10 B ng 3.3: Đư ng kính trung bình vòng th y phân pectin c a các ch ng n m m c NM1, NM2, NM3 trên môi trư ng l ng (mm) Đư ng kính trung bình vòng th y phân pectin c a các ch ng n m m c trên môi trư ng l ng (mm) NM1 14,5 Ch ng NM NM2 12,4 NM3 15,2 B ng 3.4: Đư ng kính trung bình vòng th y phân pectin c a các ch ng n m m c NM1, NM2, NM3 trên môi trư ng bán r n (mm) Đư ng kính trung bình vòng th y phân pectin c a các ch ng n m m c trên môi trư ng bán r n (mm) NM1 25,1 Ch ng NM NM2 17,1 NM3 26,7 K t qu b ng 3.3 và b ng 3.4 cho th y kh năng sinh enzym pectinase c a các ch ng n m m c phân l p ñư c trên môi trư ng bán r n cao hơn so v i môi trư ng l ng. K t qu này cũng hoàn toàn phù h p v i lý thuy t r ng: lư ng enzym ñư c t o thành t môi trư ng nuôi c y b m t thư ng cao hơn r t nhi u so v i nuôi c y chìm [5]. V i ba ch ng n m m c phân l p ñư c thì ch ng NM3 có kh năng sinh t ng h p pectinase m nh nh t sau ñó là ch ng NM1 và cu i cùng là ch ng NM2, trong ñó hai ch ng NM1 và NM3 có kh năng phân gi i pectin cao hơn h n so v i ch ng NM2. K t qu này tương ng như nhau ñ i v i các ch ng n m m c trên hai môi trư ng: l ng và bán r n. M c dù ch ng NM3 cho hàm lư ng pectinase cao nhưng theo nh n ñ nh c a chúng tôi ch ng NM3 có th là A.flavus, ñây là ch ng
11 sinh ñ c t aflatoxin – m t lo i ñ c t nguy hi m b i nh ng ñ c tính c a nó ñ i v i ngư i và gia súc [8]. T các k t lu n trên, chúng tôi quy t ñ nh ch n ch ng NM1 ñ nuôi c y cho các bư c nghiên c u ti p theo. Môi trư ng chúng tôi s d ng ñây là môi trư ng bán r n vì [5]: lư ng enzym ñư c t o thành t vi c nuôi c y b m t thư ng cao hơn r t nhi u so v i nuôi c y chìm. M t khác, nuôi c y b m t d th c hi n, quy trình công ngh không ph c t p do ñó vi c v n hành ñơn gi n và ít t n kém. 3.4. KH O SÁT NH HƯ NG C A ĐI U KI N NUÔI C Y Đ N KH NĂNG SINH T NG H P ENZYM PECTINASE 3.4.1. nh hư ng c a cơ ch t c m ng ñ n kh năng sinh t ng h p pectinase B ng 3.5: Thành ph n môi trư ng nuôi c y sinh t ng h p pectinase v i ngu n cơ ch t c m ng khác nhau Thành ph n môi trư ng Môi trư ng 1 Môi trư ng 2 Môi trư ng 3 Cám 78% 78% 78% Tr u 20% 20% 20% (NH4)2SO4 2% 2% 2% Pectin B t cà r t B t v bư i Cơ ch t c m ng 2g/100g 14,49g/100g 19,1g/100g môi trư ng môi trư ng môi trư ng K t qu hình 3.13 cho th y r ng, ch ng NM1 có kh năng sinh t ng h p pectinase cao nh t khi s d ng cơ ch t c m ng là pectin tinh khi t, sau ñó ñ n b t cà r t và cu i cùng là b t v bư i. Đi u này có th ñư c lý gi i do: pectin là ch t c m ng d ng tinh khi t cho nên trong quá trình nuôi c y, n m m c s c m ng v i pectin nhanh hơn b i hi n tư ng sinh t ng h p enzym do c m ng
12 vi sinh v t x y ra r t nhanh chóng có th ch trong vòng vài ba phút sau khi cho ch t c m ng vào môi trư ng nuôi c y [6]. Ho t ñ pectinase (U/ml) 8,49 9 8 7 6 5 3,83 4 3,04 3 2 3 0 Pectin B t cà r t B t v bư i Ngu n cung c p ch t c m ng Hình 3.13: Ho t ñ pectinase trong canh trư ng nuôi c y có b sung nguyên li u c m ng khác nhau Trái l i, b t cà r t và b t v bư i tuy là ngu n cung c p pectin cao nhưng có ch a nhi u thành ph n khác, do v y khi lên men n m m c s s d ng các thành ph n d h p th trư c. M t khác, pectin có th d ng liên k t v i các ch t khác như cellulose, hemicellulose nên ñ h p th ñư c pectin thì n m m c ñòi h i ph i ti t enzym ñ phân gi i các liên k t này m i có th s d ng ñư c. Vì v y, trong nghiên c u ti p theo tôi ch n pectin tinh khi t làm ngu n cơ ch t c m ng, ch ng NM1 ñư c nuôi c y v i hàm lư ng pectin khác nhau là: 1g, 2g, 3g, 4g, 5g trong 100g môi trư ng.
13 Ho t ñ pectinase (U/ml) 12 11,05 10 9,18 8,63 8 6 4 2 1,91 0 1 2 3 4 5 Hàm lư ng pectin (g/100g môi trư ng) Hình 3.14: Ho t ñ pectinase trong canh trư ng nuôi c y có ch t c m ng là pectin v i hàm lư ng khác nhau T k t qu trên th y r ng hàm lư ng pectin có nh hư ng r t rõ r t ñ n ho t ñ pectinase. Đi u này có th gi i thích như sau: Khi tăng n ng ñ cơ ch t t 1 – 3g/100g môi trư ng thì ch ng NM1 sinh t ng h p enzym pectinase nhi u hơn ñ th y phân lư ng cơ ch t trong môi trư ng, do ñó ho t ñ c a enzym cũng tăng lên. Nhưng khi ti p t c tăng n ng ñ cơ ch t lên n a thì ho t ñ c a enzym gi m xu ng. S gi m ho t ñ enzym có th do các nguyên nhân sau: Pectin có tính nh t làm cho ñ nh t c a môi trư ng tăng, vì v y làm gi m ñ thông thoáng c a môi trư ng gây nh hư ng ñ n s trao ñ i ch t, sinh trư ng cũng như phát tri n c a vi sinh v t do ñó quá trình sinh t ng h p gi m.
14 K t qu nghiên c u cho th y n ng ñ pectin thích h p ñ b sung vào 100g môi trư ng nuôi c y ch ng NM1 sinh t ng h p pectinase là 3g. 3.4.2. Kh o sát nh hư ng c a ngu n nitơ ñ n kh năng sinh t ng h p pectinase B ng 3.6: Thành ph n môi trư ng nuôi c y sinh t ng h p pectinase v i ngu n niơ khác nhau Thành ph n Môi trư ng 1 Môi trư ng 2 Môi trư ng 3 môi trư ng Cám 78% 78% 78% Tr u 20% 20% 20% Pectin 3g/100g 3g/100g 3g/100g môi trư ng môi trư ng môi trư ng Ngu n nitơ (NH4)2SO4 2% NH4NO3 2% Pepton 2% K t qu nghiên c u hình 3.15 cho th y ch ng NM1 có kh năng sinh t ng h p pectinase cao nh t khi s d ng ngu n nitơ là (NH4)2SO4 sau ñó ñ n pepton và cu i cùng là NH4NO3. Đi u này cũng phù h p v i lý thuy t c a Tr n Xuân Ng ch cho r ng ngu n nitơ t các mu i amoni kim lo i ki m hay t pepton, cazein th y phân c ch s t o thành enzym pectinase [7]. Đ ng th i, theo k t qu nghiên c u c a Vinod Kunar Joshi và c ng s cho bi t ho t ñ c a enzym PE nuôi c y môi trư ng r n khi s d ng ngu n nitơ là (NH4)2SO4 (6,46 ñơn v ) cao hơn khi s d ng pepton (5,40 ñơn v ) [22]. Bên c nh ñó, k t qu nghiên c u c a Z.H. Bai và c ng s cũng ch ra r ng s t ng h p enzym pectinase trên môi trư ng r n khi s d ng ngu n nitơ là (NH4)2SO4 cao hơn khi dùng NH4NO3 và pepton [20].
15 Ho t ñ pectinase (U/ml) 11,23 11,05 12 10,39 10 8 6 4 2 0 (NH4)2SO4 NH4NO3 Pepton Ngu n cung c p nitơ Hình 3.15: Ho t ñ pectinase trong canh trư ng nuôi c y có b sung ngu n nitơ khác nhau T k t qu trên chúng tôi ch n ngu n cung c p nitơ cho các nghiên c u ti p theo là (NH4)2SO4. Ti p theo, chúng tôi ti n hành nuôi c y ch ng NM1 trên môi trư ng 1 b ng 3.6 v i hàm lư ng (NH4)2SO4 khác nhau là: 1%; 1,5%, 2%; 2,5%; 3%. T k t qu trên hình 3.16 th y r ng, ho t ñ pectinase b nh hư ng r t l n b i hàm lư ng (NH4)2SO4. Theo nh n ñ nh c a chúng tôi ñi u này có th là do: khi n ng ñ cơ ch t tăng, t c ñ sinh trư ng c a vi sinh v t tăng lên do ñó kh năng sinh t ng h p enzym pectinase cũng tăng theo. Tuy nhiên, c ti p t c tăng n ng ñ cơ ch t lên n a thì ho t ñ c a enzym gi m xu ng do cơ ch t t o áp l c làm gi m quá trình sinh t ng h p enzym. Khi tăng n ng ñ cơ ch t vư t quá m t gi i h n nh t ñ nh d n ñ n áp su t th m th u tăng lên, gây khó khăn cho quá trình h p th các ch t dinh dư ng t bên ngoài. Đi u
16 này h n ch s sinh trư ng và phát tri n c a n m m c vì v y mà kh năng sinh t ng h p enzym cũng gi m ñi. Ho t ñ pectinase (U/ml) 10 11,27 10 8,71 8 7,05 6 4 2 0 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% 3,0% Hàm lư ng (NH4)2SO4 Hình 3.16: Ho t ñ pectinase trong canh trư ng nuôi c y có ngu n nitơ là (NH4)2SO4 v i hàm lư ng khác nhau 3.4.3. Kh o sát nh hư ng c a th i gian ñ n kh năng t ng h p enzym pectinase Môi trư ng nuôi c y ñư c s d ng ñ kh o sát nh hư ng c a th i gian như sau: cám 78%, tr u 20%, (NH4)2SO4 2%, pectin 3g/100g môi trư ng.
17 Ho t ñ pectinase (U/ml) 18 16,91 16 14 12 10 8,05 7,51 8 8,72 6 7,89 4 2 0 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Th i gian nuôi c y (h) Hình 3.17: Ho t ñ pectinase khi nuôi c y các th i gian khác nhau Nhìn vào hình 3.17, ta th y khi thay ñ i th i gian thì ho t ñ enzym pectinase s thay ñ i theo. Đi u này ñư c gi i thích b i: 3 ngày ñ u các ch t dinh dư ng trong môi trư ng còn nhi u nên kh năng sinh t ng h p pectinase c a ch ng NM1 tăng lên theo th i gian. Nhưng sau ngày th 3 thì ho t ñ pectinase gi m vì ch t dinh dư ng trong môi trư ng d n c n ki t, s n ph m bài ti t nhi u nên kh năng s n xu t pectinase c a ch ng NM1 cũng gi m ñi. Như v y, ñ thu ñư c pectinase có ho t ñ cao thì nên k t thúc quá trình sinh t ng h p pectinase t i th i gian 72h.
18 3.4.4. Kh o sát nh hư ng c a nhi t ñ ñ n kh năng t ng h p enzym pectinase Ti n hành nuôi c y trên môi trư ng ñã ñư c xác ñ nh như m c 3.4.3 các nhi t ñ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC trong th i gian 3 ngày. Ho t ñ pectinase (U/ml) 18 16,95 16 14 12 10 10,45 8 9,21 6 4 2 0 20 25 30 35 40 Nhi t ñ nuôi c y ( C) 0 Hình 3.18: Ho t ñ pectinase khi nuôi c y các nhi t ñ khác nhau T k t qu bi u di n trên hình 3.18 cho th y nhi t ñ nuôi c y nh hư ng rõ r t lên s t o thành enzym pectinase. Đi u này có th ñư c gi i thích r ng: giai ño n ñ u khi nhi t ñ tăng s làm tăng chuy n ñ ng c a các c u t có trong môi trư ng, làm tăng các va ch m có hi u qu d n ñ n v n t c ph n ng x y ra nhanh hơn. Tuy nhiên, enzym có b n ch t là protein do ñó khi tăng nhi t ñ t i m t gi i h n nào ñó thì v n t c ph n ng c a enzym s b gi m do s bi n tính c a enzym.
19 3.4.5. Kh o sát nh hư ng c a pH ñ n kh năng t ng h p enzym pectinase Ti n hành nuôi c y trên môi trư ng ñã ñư c mô t m c 3.4.3 v i nhi t ñ 30 C trong th i gian 3 ngày 0 các giá tr pH khác nhau. Ho t ñ pectinase (U/ml) 18 17,10 16,83 16 14 12 11,74 11,89 10 8 6 7,07 4 2 0 2,5 3,0 3.5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 pH môi trư ng nuôi c y Hình 3.19: Ho t ñ pectinase khi nuôi c y các giá tr pH khác nhau T hình 3.19 cho th y khi thay ñ i pH thì ho t ñ c a enzym s b bi n ñ i. Đi u này có th ñư c lý gi i b i: do pH có nh hư ng ñ n v n t c ph n ng enzym vì th s thay ñ i pH cũng làm cho ho t ñ c a enzym thay ñ i. pH mà t i ñó tr ng thái ion hóa c a trung tâm ho t ñ ng enzym và cơ ch t th hi n m t cách t t nh t ñư c g i là pH thích h p. T k t qu nghiên c u cho th y, pH thích h p cho ho t ñ ng c a enzym pectinase c a ch ng NM1 n m trong kho ng 5,0 – 5,5 và ñ t giá tr c c ñ i t i pH =5,0.
20 Như v y, v i vi c ti n hành kh o sát nh hư ng c a các ñi u ki n nuôi c y ñ n kh năng sinh t ng h p enzym pectinase, chúng tôi ñã thi t l p ñư c các ñi u ki n sinh t ng h p pectinase thích h p c a ch ng n m m c NM1 ñ d ch lên men thu ñư c có ho t ñ pectinase cao nh t là 17,10U/ml ng v i môi trư ng có các thành ph n như sau: cám 78%, tr u 20%, (NH4)2SO4 2%, pectin 3g/100g môi trư ng. Các thành ph n c a môi trư ng ñư c nuôi c y nhi t ñ 300C t i pH=5,0 trong th i gian 3 ngày. 3.5. Phân tích ch ph m enzym qua c t sephadex G-50 Ho t ñ pectinase Hàm lư ng protein (U/ml) (mg/ml) 20 17,978 1,4 18 Ho t ñ 1,212 1,2 16 0,915 pectinase 14 7,474 1,0 Hàm lư ng 12 0,8 10 0,543 4,551 protein 8 1,179 0,6 6 0,4 4 0,151 2 0,2 Phân ño n 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 1415 16 1718 1920 2122 23 ch y s c ký Hình 3.20: Ho t ñ pectinase và hàm lư ng protein ño ñư c các phân ño n ch y s c ký T phân ño n 7 ñ n phân ño n 23, có 3 peak tương ng ñ t ñ nh các phân ño n 9, 13, 22 v i hàm lư ng protein l n lư t là 0,915mg/ml, 0,543mg/ml, 0,151mg/ml, tuy nhiên các peak protein phân gi i không rõ ràng. Đi u này cho th y r ng trong các phân ño n này có th có m t protein ho c m t s protein có kích thư c phân t