Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:107

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính (thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Tạ Thị Diễm Thu BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Tạ Thị Diễm Thu BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN HỮU HỔ Thành phố Hồ Chí Minh – 2011
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào. TẠ THỊ DIỄM THU
MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 69 ..................................... 8 38T T 8 3 T 8 3 T 8 3 Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn 38T Agrobacterium tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp ........................................... 70 8 T 8 3 T 8 3 T 8 3 MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 38T T 8 3 Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................................... 3 38T 38T 1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX....................................................................................................... 3 T 8 3 38T 1.1.1. Đặc điểm ............................................................................................................................ 3 T 8 3 38T 1.1.2. Phân bố ............................................................................................................................... 3 T 8 3 38T 1.1.3. Phân loại ............................................................................................................................. 4 T 8 3 38T 1.1.4. Thành phần hóa học ........................................................................................................... 6 T 8 3 38T 1.1.5. Tác dụng chính của sâm ..................................................................................................... 6 T 8 3 38T 1.2. SÂM NGỌC LINH ................................................................................................................... 9 T 8 3 38T 1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện .......................................................................................... 9 T 8 3 T 8 3 1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố ......................................................................................... 10 T 8 3 38T 1.2.3. Phân bố ............................................................................................................................. 12 T 8 3 38T 1.2.4. Thành phần hóa học chính ............................................................................................... 12 T 8 3 38T 1.2.5. Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh ............................................................................. 18 T 8 3 T 8 3 1.3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium T 8 3 tumefaciens .................................................................................................................................... 21 T 8 3 1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ............................................................................. 22 T 8 3 T 8 3 1.3.2. Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens .................................................................... 23 T 8 3 T 8 3 1.3.3. Cơ chế biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ .................................................................... 25 T 8 3 T 8 3 1.3.4. Ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen thực vật .................. 28 T 8 3 T 8 3 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SAU KHI CHUYỂN VÀO T 8 3 TẾ BÀO THỰC VẬT .................................................................................................................... 29 38T 1.4.1. Phương pháp thử in vitro khả năng kháng kháng sinh của mô chuyển gen ..................... 29 T 8 3 T 8 3 1.4.2. Phương pháp hóa mô tế bào ............................................................................................. 30 T 8 3 38T 1.4.3. Phương pháp PCR ............................................................................................................ 30 T 8 3 38T 1.5. GEN IPT ................................................................................................................................. 32 T 8 3 38T 1.5.1. Một số nghiên cứu chuyển gen ipt ................................................................................... 32 T 8 3 T 8 3 1.5.2. Cơ chế tác dụng của gen ipt ............................................................................................. 33 T 8 3 38T 1.6. NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP ............................................... 34 T 8 3 T 8 3 1.6.1. Hợp chất thứ cấp và nuôi cấy mô, tế bào ......................................................................... 34 T 8 3 T 8 3 1.6.2. Quy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp ........................................................... 35 T 8 3 T 8 3 1.6.3. Một số phương pháp tăng hiệu quả sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô, tế bào T 8 3 T 8 3 .................................................................................................................................................... 36 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................. 38 38T T 8 3 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 38 T 8 3 38T 2.1.1. Mẫu cấy ............................................................................................................................ 38 T 8 3 38T 2.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404................................................. 38 T 8 3 T 8 3
2.1.3. Enzyme cắt giới hạn ......................................................................................................... 39 T 8 3 38T 2.1.4. Mồi và thang chuẩn .......................................................................................................... 39 T 8 3 38T 2.1.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ......................................................................... 40 T 8 3 T 8 3 2.1.6. Môi trường và điều kiện nuôi cấy .................................................................................... 43 T 8 3 T 8 3 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................................... 44 T 8 3 38T 2.2.1. Thí nghiệm về nuôi cấy mô.............................................................................................. 44 T 8 3 38T 2.2.2. Thí nghiệm chuyển gen .................................................................................................... 46 T 8 3 38T 2.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển ....................................................... 50 T 8 3 T 8 3 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 54 38T T 8 3 3.1. THÍ NGHIỆM VỀ NUÔI CẤY MÔ ....................................................................................... 54 T 8 3 T 8 3 3.1.1. Tạo mô sẹo từ lá sâm ex vitro và cuống lá sâm in vitro .................................................. 54 T 8 3 T 8 3 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh khối mô sẹo lá T 8 3 sâm ............................................................................................................................................. 55 T 8 3 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm ................... 58 T 8 3 T 8 3 3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN .............................................................................................. 66 T 8 3 38T 3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen ............................. 66 T 8 3 T 8 3 3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ........................ 68 T 8 3 T 8 3 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 .......................................... 69 38T T 8 3 Dãy 1: thang DNA chuẩn λ-HindIII ................................................................................ 69 38T 38T Dãy 2: plasmid trong E. coli .............................................................................................. 69 38T 38T Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn A. 38T tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp ................................................................. 70 T 8 3 3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển ....................................................... 73 T 8 3 T 8 3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 79 38T 38T TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 80 38T 38T PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 94 38T T 8 3
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BA: 6-Benzylaminopurin bp: Base pair cs.: Cộng sự dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr: Ethidium bromide gus A: Gen tạo enzyme β-D-glucuronidase GUS: Enzyme β-D-glucuronidase hpt: Gen tạo enzyme hygromycin phosphotransferase HPT: Enzyme hygromycin phosphotransferase ipt: Gen tạo enzyme isopentenyl transferase IPT: Enzyme isopentenyl transferase kD: Kilodalton MS: Môi trường Murashige and Skoog RNA: Ribonucleic acid SH: Môi trường Schenk và Hidebrandt PCR: Polymerase chain reaction pVDH396: Plasmid pVDH396 SAG: Senescence-associated gene SAG 12 -IPT: R R Promoter SAG 12 -IPT R R Taq: Thermus aquaticus TDZ: Thidiazuron Ti: Tumor-inducing X-gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Vir: Gen gây độc (Virulence)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới ......... 5 Bảng 1.2. Hàm lượng một số saponin chính trong sâm (đã trừ độ ẩm) ................... 13 Bảng 1.3. Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Panax.............. 13 Bảng 1.4. Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol ..................................................................................................................... 14 Bảng 1.5. Acid Oleanolic ......................................................................................... 14 Bảng 1.6. Ocotillol ................................................................................................... 14 Bảng 1.7. Các axid béo được tìm thấy ..................................................................... 15 Bảng 1.8. Thành phần acid amin chủ yếu ................................................................ 16 Bảng 1.9. Các nguyên tố vi lượng ........................................................................... 17 Bảng 1.10. Vai trò các gen vir. ................................................................................ 25 Bảng 2.1. Kích thước thang λ-HindIII ..................................................................... 40 Bảng 2.2. Kích thước thang 1 kb ............................................................................. 40 Bảng 2.3. Nồng độ 2,4-D và TDZ cho thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 45 Bảng 2.4. Nồng độ NAA và BA cho thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 46 Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR ................................................ 52 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh hối của mô sẹo sâm Ngọc Linh ................................................................................................... 55 Bảng 3.2. Kết quả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần ................................... 58 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin .................................................... 67
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh ................................................................................ 11 Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang bám vào tế bào thực vật ..... 22 Hình 1.3. Khối u ở thực vật do Agrobacterium tumefaciens gây ra ....................... 23 Hình 1.4. Sơ đồ gen của Ti–plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens ...................... 24 Hình 1.5. Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen ...... 26 Hình 1.6. Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ. .......................................... 27 Hình 1.7. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid. ............... 29 Hình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt ................. 34 34T Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin .......... 38 Hình 2.2. Vị trí của gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396 .................................................................................................................................. 39 Hình 2.3. Vật liệu dùng nuôi cấy tạo mô sẹo .......................................................... 45 Hình 3.1. Mô sẹo của hai loại vật liệu dùng nghiên cứu sau 2 tháng nuôi cấy ....... 54 Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần ........................................................................................ 56 Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1, C2, C3, C4, C5 và C6 ............................................................................................................ 60 Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1, C2, C3 ....................................................................................................................... 61 Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C4, C5 và C6 ................................................................................................................... 62 Hình 3.6. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo mảnh lá. .............. 63 Hình 3.7. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo cuống lá in vitro . 65 Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần ......................................................... 68
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 ................................... 69 Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp ................................ 70 Hình 3.11. Chọn lọc mô chuyển gen ....................................................................... 72 Hình 3.12. Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen ............................................ 74 Hình 3.13. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen hpt (băng DNA 800 bp) ....... 75 Hình 3.14. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen ipt (băng DNA 650 bp)........ 76 Hình 3.15. Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen.......................................... 78
1 MỞ ĐẦU Một số loài thực vật họ Sâm (Araliaceae) nói chung, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nói riêng – giống đặc hữu của nước ta là các loài cây dược liệu rất quý đối với nhiều nước trên thế giới đặc biệt đối với các nước châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam,...; rễ sâm chứa nhiều hợp chất có tác dụng dược lý quan trọng. Sâm Ngọc Linh đã được chứng minh ngoài tác dụng bổ dưỡng còn có nhiều tác dụng khác như kích thích hoạt động não bộ, nội tiết tố sinh dục, tạo hồng cầu, kháng khuẩn đặc hiệu với chủng Streptococcus, chống oxy hóa, chống lo âu, chống trầm cảm, bảo vệ gan, giảm cholesterol và lipid máu, hạ đường huyết, điều hòa tim mạch, điều hòa miễn dịch và phòng chống ung thư. Ngoài các nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn theo phương pháp truyền thống, hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và biến nạp gen nói riêng trong công tác giống sâm Ngọc Linh đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm. Như chúng ta đã biết, ipt là gen mã hóa isopentenyl transferase - enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp cytokinin ở thực vật. Vai trò tích cực của gen ipt trong cơ thể thực vật chuyển gen thể hiện tập trung ở một số điểm như: 1/ Làm chậm sự lão hóa, tăng sinh trưởng và năng suất, tăng độ bền của lá và hoa đối với nhiều loại thực vật như Arabidopsis, thuốc lá, Petunia, bông cải, cải xà lách, cúc; 2/ Ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp - tăng hàm lượng artemisinin ở cây Thanh hao chuyển gen; 3/ Làm tăng khả năng chịu hạn khi gen ipt biến nạp được điều khiển bởi promoter đặc trưng P SARK (senescence R R associated receptor protein kinase); 4/ Có thể ứng dụng tác động của gen này như yếu tố chọn lọc in vitro – thay thế tác nhân chọn lọc khác. Với ý nghĩa nêu trên, nghiên cứu biến nạp gen ipt là vấn đề cần được quan tâm. Đến nay trên thế giới cũng như ở trong nước chưa ghi nhận được công trình công bố kết quả nghiên cứu về biến nạp gen nói chung và biến nạp gen ipt nói riêng trên đối tượng sâm Ngọc Linh.
2 Do vậy, đề tài “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” được đặt ra với mục đích tạo được mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen ipt bằng kỹ thuật biến nạp gen phục vụ cho mục đích nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của gen chuyển ipt đến khả năng tăng sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Mục tiêu của đề tài Tạo được một số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính (thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR). Chưa nêu nội dung phân tích hàm lượng hợp chất thứ cấp.
3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX 1.1.1. Đặc điểm Panax là chi thực vật có nhiều cây làm thuốc quan trọng, trong đó có họ Nhân sâm. Đến nay đã biết 14 loài được công bố trên thế giới. Vùng phân bố của chi Panax ở bắc bán cầu, từ trung tâm Hymalaya qua đông bắc Trung Quốc, vùng Viễn đông nước Nga, Triều Tiên, Nhật Bản đến Bắc Mỹ…[5], [67] Đặc biệt, ở Việt Nam năm 1973 đã phát hiện một loài Panax mọc hoang trên diện tích rộng, ở độ cao 1.800 - 2.000m trên dãy Trường Sơn nam, đó là loài sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), còn gọi là sâm K5, sâm Ngọc Linh. Ngoài ra, ở Việt Nam còn phát hiện loài sâm Vũ Diệp (Panax bipinatifidus) và sâm Tam Thất (Panax pseudoginseng) ở các tỉnh miền núi phía Bắc giáp Trung Quốc. Một số nghiên cứu các cây thuộc họ Nhân sâm có đặc điểm chung sau: Về thành phần hóa học: hợp chất saponin thường được đánh giá là thành phần hoạt chất chính của những cây thuộc họ Nhân sâm và được tập trung nghiên cứu để xác định cấu trúc. Về tác dụng dược lý: các tác dụng chính của những cây thuộc họ Nhân sâm là tác dụng bổ, tăng lực, chống stress và một số tác dụng khác như giải độc gan; tác dụng trên nội tiết tố; thận; cơ, xương, khớp,… [5], [6], [45] 1.1.2. Phân bố Cho đến nay các nhà khoa học đã biết trên thế giới có khoảng 14 loài thuộc chi Panax, phân bố: [70] * Panax ginseng C.A. Mey. (Nhân sâm) = Panax schinseng Nees: loài hoang dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, châu Á. * Panax quingquefolium L. (Sâm Mỹ): mọc hoang và được trồng ở vùng Bắc Mỹ. * Panax trifoliatus L. (Dwarf ginseng, “Sâm lùn”): có ở Bắc Mỹ. * Panax notoginseng F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng: phân bố của loài hoang dai chưa rõ, đã được trồng ở Vân Nam, Trung Quốc.
4 * Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Pseudo-ginseng Hara: mọc hoang dại, rất hiếm, được tìm thấy ở phía đông dãy Himalaya. * Panax japonicus C.A. Mey. (Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Japonicus (Meyer) Hara): mọc hoang dại ở Nhật Bản và miền Nam Trung Quốc. * Panax japonicus C.A. Mey. var. maijor (Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng (Panax pseudo-ginseng Wall var. maijor (Burk.) Li.): mọc hoang dại ở miền Nam Trung Quốc. * Panax japonicus C.A. Mey. var. angustifolius (Burk.) Chen et Chu: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc. * Panax japonicus C.A. Mey. var. bipinatifidus (Seem.) C.Y. Wu et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc. * Panax zingiberensis C.Y. Wu et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc. * Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc từ Vân Nam đến Tây Tạng và miền Bắc Việt Nam. * Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Himalaycus Hara: mọc hoang ở phái Đông dãy Himalaya. * Panax sp.: gồm mẫu C (thu hái ở Chame, Nepal) và mẫu G (thu hái ở Ghorapani, Nepal): mọc hoang ở miền Trung Nepal. * Panax vietnamensis Ha et Grushv.: mọc hoang và được trồng ở hai tỉnh Kon Tum và Quảng Ngãi. 1.1.3. Phân loại Đã có một số nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax. Và gần đây nhất là hệ thống phân loại của Jun Wen (2001) thống kê 12 trong số 14 loài và dưới loài của chi Panax đã được đề cập ở trên. [70]
5 Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới H.L. Li H. Hara C. Hoo C.Y. Wu et al Jun Wen (1942) (1970) (1973) (1973) (2001) P. schinseng P. ginseng C.A. P. ginseng P. ginseng P. ginseng Nees Mey. C.A. Mey. C.A. Mey. C.A. Mey. P.Pseudoginseng P.Pseudoginseng P. Pseudoginseng P.Pseudoginseng P. Pseudoginseng Wall. Wall. Wall. Wall. Wall. Subsp. Var. Pseudoginseng Pseudoginseng Var. Var. Notoginseng Notoginseng Var. Notoginseng (Burk.) Hoo et (Burk.) Chen F.H. Chen Tseng Subsp. Var. japonicus P. japonicus P. japonicus japonicus C.A. Mey. C.A. Mey. Var. Wanggianus P. Wanggianus (Sun) Hoo et S.C. Sun Tseng Var. Angustatus (Makino) Hara Var. major Subsp. Var. elagantior Var. major P. Bipinnatifidus (Burk.) Li Himalaycus (Burk.) Wu et (Burk.) Seem. Hara Feng Var. Var. Angustifolius Angustifolius (Burk.) Li (Burk.) Jun Wen P. P. Stipuleanatus Stipuleanatus Tsai et Feng Tsai et Feng P. P. Zingiberensis Zingiberensis C.Y. Wu et K.M. C.Y. Wu et Feng K.M. Feng P. trifolius L. P. Quinquefolius P. Vietnamensis Ha et Grushv.
6 1.1.4. Thành phần hóa học Saponin và polyacetylen là hai nhóm hoạt chất chính có trong chi Panax. 1.1.4.1. Hợp chất saponin [1], [5], [6], [7], [79], [80] T 8 2 28T Saponin còn gọi là saponin glycoside hay saponoside do chữ Latinh “sapo” có nghĩa là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycoside lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Mỗi một saponin đều có hai phần: sapogenin (aglycon) và đường. Phần sapogenin có thể là một chất steroid hay triterpenoid. Phần đường thường là glucose, galactose, pentose hay metyl pentose. Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài sâm. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc của hơn 100 saponin từ các loài Panax L. có thành phần chính là các saponin triterpenoid tetracylic nhóm dammaran, gọi chung là glycoside. 1.1.4.2. Hợp chất polyacetylene [1], [6], [80], [93], [112] T 8 2 T 8 2 Polyacetylene được phát hiện trong sâm Triều Tiên và những năm 60 và phát hiện thấy có tác dụng phòng chống ung thư vào những năm 80 của thế kỷ 20. Cấu tạo của polyacetylen thường là các hydrocacbon mạch thẳng có 17 hoặc 18 carbon có gắn với các nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại là chuỗi C 7 H 15 . R R R R Việc nghiên cứu những hợp chất polyacetylen trong các cây họ Nhân sâm đã cho thấy chúng thể hiện một số đặc tính sinh học như: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ngưng tập tiểu cầu, độc tế bào và kháng ung thư. 1.1.5. Tác dụng chính của sâm Sâm Triều Tiên nói riêng và Nhân sâm nói chung có vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị các bệnh mãn tính như: bệnh tiểu đường, ung thư, sơ vữa động mạch, huyết khối, lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não,… do có tác dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức đề kháng của cơ thể. [6], [52]
7 1.1.5.1. Tác dụng tăng lực, phục hồi sức [36], [89], [92] T 8 2 T 8 2 Bột chiết sâm Triều Tiên và các ginsenosid chính như G-Rg1, G-Rb1 làm thay đổi các thông số sinh hóa trong máu liên quan đến chuyển hóa năng lượng trong quá trình vận động như làm tăng hàm lượng glucose, giảm hàm lượng glycogen trong máu (do tăng dự trữ glycogen trong gan), giảm acid béo tự do, giảm hàm lượng triglyceride, giảm hàm lượng acid lactic và acid pyruvic. Điều này cho thấy bột chiết sâm Triều Tiên làm thay đổi cơ chế hằng định nội môi về năng lượng trong quá trình vận động theo chiều hướng làm gia tăng khả năng sinh hóa của cơ xương, oxy hóa acid béo tự do sản sinh năng lượng vận động thay cho glucose. 1.1.5.2. Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương Sâm Triều Tiên thể hiện tác dụng lên hệ thần kinh theo hai hướng là kích thích hoặc ức chế tùy theo thành phần ginsenosid và trạng thái bệnh lý. Takagi và cộng sự đã chứng minh rằng các saponin thuộc nhóm protopanaxadiol mà tiêu biểu là G- Rb1 hoặc hỗn hợp saoponin có G-Rb1 và G-Rc thể hiện ức chế hệ thần kinh trung ương, trong khi các saponin thuộc nhóm protopanaxatriol, tiêu biểu là G-Rg1 và những hợp chất tan trong lipid thể hiện tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, chống mệt mỏi. [36], [70], [80], [89] Sâm Mỹ còn có tác dụng điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, G-Rb1 và G-Rg1 đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng này. [126] 1.1.5.3. Tác dụng cải thiện trí nhớ Bột chiết hồng sâm Triều Tiên có tác dụng cải thiện rõ khả năng học tập- ghi nhớ do hoạt chất G-Rg1 quyết định, nhất là những tổn thương trong hoạt năng não bộ liên quan đến tuổi già. [37], [68] 1.1.5.4. Tác dụng đáp ứng thích nghi và chống stress Tác dụng dược lý quan trọng của sâm Triều Tiên là duy trì sự hằng định nội môi, đưa về bình thường những trạng thái sinh lý bất thường của cơ thể do stress gây ra. G-Rg1 thuộc nhóm protopanaxatriol saponin là hoạt chất có tác dụng quyết định chống stress của sâm Triều Tiên. Cơ chế tác động chống stress có liên quan
8 đến trung khu điều hòa nhiệt độ và sự tạo thành chất hóa học trung gian histamin của vùng dưới đồi. [89], [114] 1.1.5.5. Tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa Các ginsenosid thuộc nhóm panaxatriol như G-Rb1, G-Rb2 và ginsenosid thuộc nhóm panaxadiol như G-Rg1 được chứng minh là những chất có tác dụng chống oxy hóa điển hình của sâm Triều Tiên. Dịch chiết nước hồng sâm Triều Tiên uống dài ngày có tác dụng kéo dài thời gian sống, giảm hàm lượng cholesterol, glucose, TBARS (sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào), gia tăng hoạt năng của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như superoxyd dismutase (Cu, Zn-SOD và Mn-SOD), catalase, glutathione peroxydase trong gan. [52], [81] 1.1.5.6. Tác dụng bảo vệ gan Sâm Triều Tiên có tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế tác dụng chống oxy hóa. Các chất điển hình có tác dụng bảo vệ gan: 20(S)-ginsenosid-Rh2, 20(R)- ginsenosid-Rg3 và prosapogenin của 20(R)-ginsenosid-Rh2 và 20(S)-ginsenosid- Rs. [5], [112] 1.1.5.7. Tác dụng điều hòa miễn dịch Dịch chiết nước rễ sâm Triều Tiên làm gia tăng sự tạo thành kháng thể sơ cấp và thứ cấp in vitro, làm tăng hoạt tính của IgM, IgG và tế bào K (natural killer cells), làm gia tăng sự sản sinh interferon, tế bào lympho. Bột chiết hồng sâm Triều Tiên (liều uống 50 - 500mg/kg thể trọng) có tác dụng kích thích không đặc hiệu đáp ứng miễn dịch. [86], [97] 1.1.5.8. Tác dụng chống ung thư Tác dụng gia tăng hoạt năng của tế bào K là một trong những cơ chế tác dụng chống ung thư của sâm Triều Tiên. Bột chiết hồng sâm Triều Tiên và phân đoạn polysaccharid thể hiện tác dụng kháng ung thư, giảm tần suất và ức chế sự tăng sinh các khối u. [68], [93] 1.1.5.9. Tác dụng trên hệ tim mạch và huyết áp Dịch chiết hồng sâm Triều Tiên (liều 200- 500mg/kg thể trọng) và các ginsenosid chính như G-Rg1 và G-Rb1 có tác dụng cải thiện sự tuần hoàn máu gây
9 bởi nhiệt độ quá lạnh hoặc bởi norepinephrin, làm giảm suy tim thực nghiệm gây bởi adriamycin. Bột hồng sâm 1,5-6g/ ngày x 2lần trong 3-24 tháng làm gia tăng sự co bóp cơ tim, giãn mạch ngoại biên, cải thiện những thông số huyết động của tim, rõ nhất là ở người cao tuổi. Ngoài ra, dịch chiết methanol của hồng sâm Triều Tiên (liều 200mg/kg thể trọng) có tác dụng gia tăng tuần hoàn máu trong gan, lách, màng nhày dạ dày, thận. [36], [56], [113] * Ngoài những tác dụng chính trên, Nhân sâm còn có tác dụng hạ cholesterol và lipid máu, giảm đau, giải độc, kích thích ăn ngon, làm sáng mắt, kéo dài tuổi thọ, điều hòa nội tiết tố sinh dục,… [56], [113] 1.2. SÂM NGỌC LINH 1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện [5], [17], [131] T 7 2 T 7 2 Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Ngọc Linh đã được các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Sâm Ngọc Linh sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Theo những thông tin lưu truyền trong cộng đồng các dân tộc thiểu số của hai tỉnh này về một loại củ quý hiếm trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người và do nhu cầu của kháng chiến, ngành dược khu Trung Trung Bộ quyết phải tìm ra cây sâm chi T 8 3 T 8 3 T 8 3 Panax tại miền Trung. 38T Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ 4 cán bộ đi điều tra tìm cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh Kon Tum. Với sự hỗ T 8 3 T 8 3 trợ của cán bộ địa phương, đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, ở độ cao 1800 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây sâm đầu tiên và ngay buổi chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm. Thời điểm này cây sâm phát hiện được đặt tên là “sâm đốt trúc” với tên khoa học với tên khoa học sơ bộ được xác định là Panax articulates
10 L., họ Nhân sâm (Araliaceae). Từ đó cây sâm này được nghiên cứu nhiều về đặc điểm hình thái, phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý,… Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, một loài sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv. Tên khoa học này do Hà Thị Dung và Grushvistky I. V.đặt, được công bố nǎm 1985 tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô cũ). 1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố 1.2.2.1. Đặc điểm hình thái [5], [6], [7], [17] T 8 2 28T Sâm Ngọc Linh là cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1m. Thân rễ nạc, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ. Ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất, hình dạng thay đổi. Rễ củ ở cây sâm hoang dại phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, con quay và dạng bó củ. Thân khí sinh, mảnh, thẳng, màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2- 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10- 14cm, rộng 3- 5cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ. Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10- 20cm có thể kèm 1- 4 tán phụ hay 1 hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán 60- 100 hoa, cuống hoa ngắn 1- 1,5cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy. Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3- 5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.
11 Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau chuyển màu đen. Hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân. Quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8- 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6cm. Mỗi quả chứa một hạt. Một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây khoảng 10 đến 30 quả. Mùa hoa: tháng 4– tháng 6, mùa quả: tháng 7– tháng 9. Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh. a.: Cây sâm ngoài tự nhiên, b.: Cây sâm trồng trong vườn (http://www.google.com.vn/imgres?q=sam+Ngoc+Linh) 1.2.2.2. Đặc điểm sinh thái Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ 1200 – 2100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15- 180C, lượng mưa khoảng 3000mm/ năm. Đất rừng ở đây P P được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt. Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm. [7], [17], [22]