Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền và nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tieu của đề tài là đánh giá di truyền quần thể Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật RAPD; xây dựng được quy trình nhân giống in vitro Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền và nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ====== NGUYỄN THỊ HƯỜNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ====== NGUYỄN THỊ HƯỜNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã ngành: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Việt Hà Nội - 2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Văn Việt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả nghiên cứu trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn. Học viên Nguyễn Thị Hường
ii LỜI CÁM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Phòng Đào tạo, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trang bị kiến thức cho tôi trong xuất quá trình học tập. Đặc biệt tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Việt, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong xuất quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh Luận văn Thạc sỹ này. Tôi xin cám ơn các cán bộ Bộ môn Công nghệ tế bào và toàn thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin cám ơn Ban quản lý Vườn quốc gia Tam Đảo đã cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề tài. Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè và đông nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong xuất quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn ! Hà nội, ngày tháng năm Học viên Nguyễn Thị Hường
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................................. ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC HÌNH ...............................................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ vi ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................................3 1.1.Giới thiệu về Trà hoa vàng Tam Đảo.....................................................................3 1.1.1.Hệ thống phân loại và phân bố ........................................................................3 1.1.2.Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo .....................................................3 1.1.3.Giá trị sử dụng cây trà hoa vàng ......................................................................4 1.2.Phân tích di truyền bằng kỹ thật RAPD–PCR .......................................................6 1.2.1.Kỹ thuật chỉ thị phân tử trong cải tiến di truyền Camellia ...............................6 1.2.2.Kỹ thật RAPD ..................................................................................................7 1.2.3.Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền .............................................10 1.3.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................................11 1.3.1.Khái niệm nuôi cấy in vitro ...........................................................................11 1.3.2.Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào ......................................12 1.3.3.Ý nghĩa của nhân giống in vitro ....................................................................12 1.3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy...............................................................14 1.4.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia .........................................................20 1.4.1.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia trên thế giới ..............................20 1.4.2.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia ở Việt Nam ...............................22 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........26 2.1.Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................26 2.2.Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................26 2.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................27 2.4.Nội dung nghiên cứu ............................................................................................27 2.4.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật RAPD ..27
iv 2.4.2.Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ................................................................................................................................27 2.5.Phương pháp nghiên cứu......................................................................................28 2.5.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo.....................................28 2.5.2.Xây dựng quy trình nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo .................................31 2.6.Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu ...................................................33 2.6.1.Chỉ tiêu theo dõi.............................................................................................33 2.6.2.Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................35 3.1.Kết quả phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam đảo ..............................35 3.1.1.Tách chiết ADN tổng số ................................................................................35 3.1.2.Khuếch đại PCR với 15 mồi RAPD ..............................................................36 3.1.3.Tương quan di truyền của 10 hệ gen nghiên cứu ..........................................37 3.2.Kết quả nhân giống in vitro Trà hoa vàng ...........................................................40 3.2.1.Kết quả khử trùng tạo mẫu sạch và tái sinhh chồi .........................................40 3.2.2.Kết quả tạo cụm chồi và nhân nhanh chồi .....................................................44 3.2.3.Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. ............................................................53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................56 4.1. Kết luận ...............................................................................................................56 4.1.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD .................................56 4.1.2. Kết quả nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ................................................................................................................................56 4.2. Kiến nghị .............................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO
v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Trà hoa vàng Tam Đảo.............................................................................3 Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% .......................................35 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuyếch đại từ mồi CP1 và mồi CP9 trên gel agarose 1,2% ...............................................................................................................................37 Hình 3.3. Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 10 mẫu trà hoa vàng. ..........................39 Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi ................................................................................................................................41 Hình 3.5. Một số hình ảnh tái sinh trà hoa vàng từ phôi hạt .........................................42 Hình 3.6. Hạt chè nảy mầm trên môi trường WPM ......................................................43 Hình 3.7. Chồi Trà hoa vàng Tam Đảo tái sinh trên môi trường WPM ........................46 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro .........48 Hình 3.9. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến nuôi cấy in vitro Trà hoa vàng ...50 Hình 3.10. Cụm chồi trà hoa vàng phát triển trên môi trường MT7 ..............................52 Hình 3.11. Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro ................................................................................................................................54 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro.............55
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng ........................................................................26 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng dùng cho mỗi phản ứng RAPD - PCR ......................29 Bảng 2.3. Chương trình chạy của phản ứng PCR .........................................................30 Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch các mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần) .............36 Bảng 3.2. Phân đoạn RAPD đa hình thu được từ 15 mồi RAPD ..................................36 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền Jaccard ..............................................................38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi .......40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới khả năng nảy mầm .........................43 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi............44 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi .....................47 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến khả năng nhân nhanh chồi..49 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi ....51 Bảng 3.10. Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro .......53
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ Dịch nghĩa AFLP Amplified fragment length polymorphism CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid ADN EBA Extraction Bufer A Đệm chiết A EBB Extraction Bufer B Đệm chiết B EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EST Expressed Sequence Tag PCR Polymerase Chain Reaction BAP 6- Benzylaminopurin IBA Indol- 3- acetic acid RAPD Random amplification polymorphism DNA RFLP Retriction fragment length polymorphism α- NAA α- Naphthyacetic acid Woody Plant Medium- Lloyd G, Mc CownB, WPM 1980 MS Murashige và Skoog, 1962 VQG Vườn quốc gia
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) là một loài thực vật hạt kín thuộc họ Chè (Theaceae) được phát hiện và công bố vào năm 2007, là loài trà đặc hữu ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc và là một trong hơn 30 loài trà hoa vàng đã được phát hiện và công bố trên thế giới. Theo thống kê cho đến nay, có khoảng 28 loài được tìm thấy ở Trung Quốc và hơn 24 loài trà hoa vàng được tìm thấy ở Việt Nam 45. Trà hoa vàng được biết đến là loại cây dược liệu có giá trị cao. Thành phần các chất trong trà hoa vàng có tác dụng phòng chống ung thư, củng cố tính đàn hồi của thành mạch và điều hòa huyết áp... Ngoài ra, các loài trà hoa vàng nói riêng và chi Camellia nói chung có hoa to, màu sắc rực rỡ và lạ mắt, thường ra hoa vào dịp Tết Nguyên đán nên thu hút được sự quan tâm của các nhà chơi cây cảnh. Với các giá trị lớn cả về mặt khoa học và kinh tế, việc đánh giá, bảo tồn và quản lý nguồn gen và công tác nghiên cứu đa dạng di truyền các loài trà hoa vàng trở nên vô cùng quan trọng. Ngày nay, bên cạnh phương pháp truyền thống sử dụng chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử ADN được đánh giá là phương pháp hữu hiệu trong việc nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền của các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài [31]. Trong số các chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền, kỹ thuật RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) được sử dụng khá rộng rãi bởi kỹ thuật này đơn giản, có độ tin cậy và chính xác cao thường được sử dụng trong các nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử đối với tất cả các đối tượng thực vật. Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong công tác nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể loài Trà hoa vàng Tam Đảo để chọn ra được những cá thể có tính đa hình ADN cao phục vụ một số công tác nghiên cứu khác. Những năm gần đây, do khai thác không hợp lý nên trữ lượng các loài trà hoa vàng ở Vườn quốc gia Tam Đảo đang suy giảm nghiêm trọng, đặc biệt là loài Trà hoa vàng Tam Đảo. Nhằm bảo vệ, lưu trữ và phát triển nguồn gen các loài trà hoa vàng phục vụ cho công tác nghiên cứu, khai thác và sử dụng bền vững trong tương lai, việc lựa chọn ra một phương pháp nhân giống tối ưu các loài trà hoa vàng trở nên vô cùng
2 cấp thiết. Trong số các phương pháp nhân giống hiện nay, phương pháp nhân giống in vitro có ý nghĩa rất lớn với các ưu điểm nổi bật: có thể nhân số lượng cây lớn trên quy mô công nghiệp, sản phẩm sạch bệnh và có tính đồng nhất về hệ số di truyền cũng như hệ số nhân giống 15. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Đánh giá đa dạng di truyền và nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
3 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu về Trà hoa vàng Tam Đảo 1.1.1. Hệ thống phân loại và phân bố Hệ thống phân loại Giới : Plantae Bộ : Ericales Họ : Theaceae Chi : Camellia Loài : C. Tamdaoensis Tên khoa học: Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda Hình 1.1. Cây Trà hoa vàng Tam Đảo (http://caytrahoavang.com/tra-hoa-vang-tam-dao-camellia-tamdaoensis-ninh-et-hakoda/) Trà hoa vàng Tam Đảo có tên khoa học là C. tamdaoesis Ninh et Hakoda là một loại thực vật hạt kín thuộc họ Chè (Theacea), là loài đặc hữu của Vườn Quốc gia Tam Đảo, phân bố ở sườn dốc phía Tây Nam dãy núi Tam Đảo, ở độ cao 200 - 600m. Họ Chè chưa thống nhất với nhau về số lượng chi loài, theo L. Watson và M.J. Dallwitz liệt kê khoảng 18 chi với 500 loài. Phần lớn các chi có nguồn gốc từ miền Đông Châu Á, từ Malaysia về phía bắc tới Nhật Bản, với một vài chi có ở Nam và Trung Mỹ. Hai chi Franklinia và Gordonia cũng có các loài có nguồn gốc Đông Nam Hoa Kỳ 45 . 1.1.2. Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo Cây Trà hoa vàng Tam Đảo là thân gỗ nhỏ hay cây bụi, nhánh, không lông, cao 2 - 4m, mọc rải rác trong rừng. Thân tròn, thẳng, có màu trắng nhạt, cành non và ngọn có màu nâu đỏ. Lá có cuống, hình trái xoan dài, đầu lá nhọn, lá dài 9,5 - 14,5 cm, rộng
4 3,5 - 5,0 cm, lá đơn mọc cách không có lá kèm, lá non màu nâu đỏ và mọc chúc xuống rất đặc trưng. Hệ gân lá nổi cả 2 mặt, có 8 - 9 đôi, gân phụ hợp mép, phiến lá dày, cứng và dài, mép lá có răng cưa. Hoa mọc độc trên cuống dài 7 - 10 mm, lá bắc 5, lá đài 5, cánh hoa 8 - 10. Nhị nhiều, bầu nhụy không lông, vòi nhụy 3 - 4, dính nhau một phần. Hoa nở lâu tàn, có thể duy trì được 8 - 10 ngày. Mùa hoa từ tháng 10 đến tháng 12. Quả Trà thuộc loại quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả trà có dạng hình tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt, đường kính 3 cm. Khi chín, vỏ quả nứt ra. Vỏ trà gồm gồm 6 - 7 lớp tế bào tạo thành lớp vỏ cứng phía trong là lớp lụa mỏng, màu nâu, nhiều gân, có tác dụng vận chuyển nước và dinh dưỡng. Nhân trà có 2 là mầm. Lá mầm chiếm 3/4 khối lượng hạt trà, là nơi dự trữ dinh dưỡng 45. Trà hoa vàng Tam Đảo là loài rễ hỗn hợp gồm rễ trụ, rễ bên và rễ hấp thụ. Rễ trụ ăn sâu vào đất. Rễ bên và rễ hấp thụ phân bố từ tầng canh tác [45]. Trà rụng lá hàng năm vào mùa khô, sinh trưởng nhịp điệu rõ. Mùa ra hoa từ tháng 10 đến 12 hoa nở lâu tàn có thể từ 8 đến 10 ngày. Trà có thể thích hợp với vùng nhiệt đới nóng ẩm. Nhiệt độ thích hợp nhất để Trà hoa vàng Tam Đảo sinh trưởng tốt, sản lượng cao là những nơi có nhiệt độ bình quân trên 200C, độ ẩm không khí 85% - 90% lượng mưa 1000 - 2000 mm, có độ cao 300 - 500 m so với mặt nước biển. Trà có yêu cầu khá khắt khe đối với đất. Đất thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển của Trà hoa vàng Tam Đảo là đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước, nhưng đủ ẩm, hơi chua có pH = 4,5 - 5,5. Trà hoa vàng Tam Đảo là cây ưu sáng mạnh, nên nơi có đồi gò, trồng thưa, tán cây xòe rộng thì trà ra nhiều hoa và lá trà to. Những nơi khe núi, chân núi thiếu ánh sáng hoa bé hơn quả cũng kém mặc dù cây có thể mọc tốt [45]. 1.1.3. Giá trị sử dụng cây trà hoa vàng Các loài thuộc chi chè nói chung và các loài thuộc họ trà (chè) nói riêng đã được con người sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau. Dựa trên những công bố chúng ta có thể xếp thành các nhóm chính sau:
5  Dùng làm đồ uống Đây là một giá trị đáng kể và phổ biến không chỉ với trà hoa vàng mà còn đối với các loài thuộc chi Camellia nói chung. Từ những năm trước Công nguyên, người Trung Quốc đã sử dụng trà như một thứ nước uống và trà được phổ biến ở nhiều nước châu Á sau đó. Với một số nước như Nhật Bản, Trung Quốc thức uống từ trà đã trở thành một nét văn hóa đặc trưng. Ở Việt Nam, cây trà cũng được trồng từ khá lâu, hầu như tỉnh nào cũng có cây trà. Tuy nhiên, phổ biến hiện nay vẫn là các loài trà xanh, trà hoa vàng còn chưa được biết đến nhiều. Một ưu điểm so với trà xanh thông thường đó là chiết xuất từ lá trà hoa vàng không chứa caffeine vốn là một chất chiếm tỷ lệ đáng kể ở trà xanh 12.  Dùng làm dầu ăn Hạt của các loại trà có thể để chưng cất dầu. Ở Trung Quốc và Nhật Bản, dầu ăn chiết từ hạt trà khá phổ biến. Dầu của hơn 200 loài thuộc chi trà đã được sử dụng làm thực phẩm và dùng cho các ngành công nghiệp khác. Ngoài ra, một số hợp chất trong lá và quả trà như acid tanic, oleic acid… là những thành phần quan trọng được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm 12.  Dùng làm thuốc chữa bệnh Giá trị dược liệu là giá trị đáng quý nhất của cây trà hoa vàng. Ngày nay, các công trình khoa học đã chỉ ra ngày càng nhiều công dụng của cây trà. Riêng đối với cây trà hoa vàng, các nghiên cứu đã cho thấy trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh trưởng của các khối u đến 33,8%, giúp giảm đến 35% hàm lượng cholesterol, 36,1% lượng lipoprotein trong máu, cao hơn 10% so với các biện pháp sử dụng tây dược hiện nay. Các chế phẩm từ trà hoa vàng có khả năng làm giảm biểu hiện chứng xơ vữa động mạch, điều hòa huyết áp. Bên cạnh đó, một số bệnh về đường hô hấp, bài tiết đều có thể sử dụng thuốc uống này như một phương pháp chữa trị đơn giản và sớm mang lại kết quả 12. Đất nước Trung Quốc từ lâu đã khai thác tiềm năng to lớn từ giá trị dược liệu của cây trà hoa vàng. Họ đã xây dựng nên Vườn Camellia Quốc tế, trồng nhân tạo vùng trà hoa vàng nguyên liệu, nghiên cứu và sản xuất thành công các chế phẩm từ trà hoa vàng như: Golden Camellia, Superior tea… là những mặt hàng có giá trị và đem lại nguồn lợi nhuận khổng lồ hàng năm. Việt Nam cũng là một trong số các nước có số trà hoa vàng
6 phong phú bậc nhất thế giới, tuy nhiên việc nghiên cứu ứng dụng và khai thác giá trị dược liệu của các loài này còn chưa được chú trọng. Công tác bảo tồn chưa được tốt, lượng cá thể tự nhiên hàng năm suy giảm đáng kể là một thực trạng đáng buồn và đe dọa trực tiếp đến nguồn gen quý giá này 12.  Dùng làm cây cảnh Chi trà là chi có hoa lớn, đẹp, nhiều màu sắc, một số loài hoa nở đúng vào dịp Tết Nguyên đán nên thường được sử dụng để chơi như cây cảnh. Việc lai tạo, phối hợp các màu hoa cũng thu hút sự chú ý và quan tâm của các nhà lai tạo, làm tăng giá trị của cây trà lên nhiều lần nếu có thể tạo ra giống trà có màu hoa hiếm và độc 12. 1.2. Phân tích di truyền bằng kỹ thật RAPD – PCR 1.2.1. Kỹ thuật chỉ thị phân tử trong cải tiến di truyền Camellia Cải tiến cây trồng được bắt đầu ngay từ khi con người bắt đầu trồng cây. Hiệu ứng di truyền nút cổ chai được áp dụng ngay trong quá trình thuần hóa sớm và các hoạt động nhân giống hiện đại dẫn đến các giống cây trồng chỉ mang một phần các biến đổi hiện tại trong bộ gene 52. Trà là dị hợp tử cao, việc lai xa cho thấy sự biến đổi liên tục trong các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa. Các dòng có năng suất và chất lượng cao hơn được tạo ra trở nên phổ biến thông qua vi nhân giống. Công việc này đã bắt đầu thay thế nhân giống bằng hạt từ những năm 1960 53. Các dòng là đồng nhất về di truyền cũng như tương đồng về năng suất và chất lượng. Lựa chọn dòng vô tính là một phương pháp cải tiến giống cây trà quan trọng được áp dụng rộng rãi bởi sự đa dạng hệ gen trong nguồn hạt giống hiện có 29. Tuy nhiên, nhược điểm của vi nhân giống là sự thay đổi năng suất dưới các điều kiện bất lợi và dễ bị tấn công quy mô lớn bởi sâu bệnh hại. Khả năng thích ứng hoặc kháng cự không được xem xét đầy đủ trong nỗ lực cải thiện giống vốn có thể được thực hiện cho Camellia. Sự phụ thuộc vào một số lượng hạn chế các dòng có thể dẫn đến mất mát nguồn tài nguyên di truyền có giá trị và làm tăng rủi ro tiềm ẩn tự nhiên như sâu bệnh hại.
7 Bởi vậy, đa dạng di truyền là quan trọng cho khả năng tồn tại lâu dài và thích ứng với những thay đổi của điều kiện môi trường. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, hạt giống là cần thiết trước khi thay thế các giống trà có sự tương đồng di truyền. Các chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền, cũng như bản đồ di truyền phân tử, bản đồ liên kết phân tử là điều cấp thiết cho cải thiện nguồn gene trà. Trong đó, nghiên cứu đa dạng di truyền là bước đầu tiên quyết làm cơ sở định hướng cho xây dựng các chương trình bảo tồn thích hợp 27. Ở Trà, theo Bandyopadhyay et al., 2011 27, các chỉ thị phân tử đã được áp dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền là RAPD bởi: Wachira et al., 1995, 1997; Kaundan et al., 2000; Young-Goo et al., 2002; Chen et al., 2002 và Mewan et al., 2005; chỉ thị ISSR bởi Mondal 2002 và Yao et al., 2005; Chỉ thị AFLP bởi: Paul et al., 1997; Wachira et al., 2001; Balasaravanan et al., 2003; Mishra et al., 2004 và Sharma et al., 2009; chỉ thị SSR bởi Freeman et al., 2004; Zhao et al., 2007 và Hung et al., 2008. Bên cạnh đó các chỉ thị lục lạp như matK, rbcL, trnH-psbA, psbK-psbI bởi: Katoh et al., 2003 40; Nguyễn Đức Thành, 2015 16; Hà Văn Huân và cs, 2015 5. Trong đề tài này tác giả lựa chọn kỹ thuật RAPD cho nghiên cứu đa dạng di truyền 10 cá thể Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh) nhằm xác định tính đa dạng di truyền làm cơ sở cho lựa chọn vật liệu vào mẫu in vitro. 1.2.2. Kỹ thật RAPD Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (8 - 20 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngầu nhiên những đoạn ADN có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR - RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn băng giống nhau và chiều dài tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer tương ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome
8 của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thế kỷ 20, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) đã được ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (Wiliam, 1990; Welsh và ctv., 1991) 60. a. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc 2.1, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dedrogram) Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản ADN genom bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình ADN do sự sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi (Williams et al, 1991). Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34- 37oC). Mặc dù trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ G - C tối thiểu phải là 40% (thường là 50 - 80%) và không có trình tự bazo đầu xuôi và ngược giống nhau. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của ADN khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nuclotide) thì đoạn ADN sẽ được nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa ADN genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn ADN trong genome. Vì thế, nó là một phương pháp hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể.
9 b. Ưu điểm, hạn chế của kỹ thuật RAPD RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc. Ưu điểm Vể mặt kỹ thuật: - Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu; - Thao tác đơn giản; - Chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao; - Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao. Về mặt kinh tế: - Chi phí thực hiện thấp; - Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao; - Chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuclotide của đoạn ADN cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ ADN tính bằng nanogram và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa dạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng cho các mục đích sau: - Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua; - Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể; - In dấu vân tay (DNA fingerprinting); - Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (somaclonal variation).
10 Nhược điểm Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền những chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau: - Có tính trội do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể di hợp tử; - Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất; - Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu; - Độ tin cậy còn tùy thuộc vào kỹ thuật cá nhân; - Kỹ thật RAPD có độ chính xác không cao; - Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp); - Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp; - Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và độ tin cậy không cao (William và cs, 1993). 1.2.3. Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần nucleic acid, tạo thành mã di truyền [3]. Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loài mới; đa dạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về hệ sinh thái có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời các hệ sinh thái được duy trì và bảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó. Phần đa dạng sinh học do con người khai thác sử dụng gọi là đa dạng sinh học nông nghiệp [20]. Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính [35]: Giá trị ổn định: Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các hệ thống nông nghiệp ở quy mô toàn cầu, Quốc gia và địa phương. Sự thiệt hại của một giống cây trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống hoặc cây trồng khác.
11 Giá trị lựa chọn: Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học cần thiết chống lại những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạng hữu ích như tính kháng sâu bệnh hay tính thích nghi. Giá trị của đa dạng di truyền được thể hiện thông qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quý, hiếm của tài nguyên di truyền thực vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng và khả năng thích nghi. Năm 1946, giống lúa mỳ lùn Nhật Bản Norin 10 được nhập vào Mỹ và đã góp phần quan trọng trong cải tạo giống và tăng năng suất lúa mỳ. Các giống lúa trồng có nguồn gốc Đông Bắc Ấn Độ được sử dụng là nguồn kháng sâu, bệnh cho các vùng khác nhau trên thế giới. Những tính trạng này đã góp phần tăng sản lượng lúa bình quân của châu Á lên 30% giữa những năm 1981 và 1986 [35]. Giá trị khai thác: Đa dạng di truyền được xem là kho dự trữ tiềm năng các tài nguyên chưa biết đến. Đây cũng là lý do cần phải duy trì cả các hệ sinh thái hoang dã lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống. 1.3. Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro Nuôi cấy in vitro là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng và được kiểm soát. Nuôi cấy mô tế bào bao gồm các kỹ thuật sau:  Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.  Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…  Nuôi cấy phôi non, và phôi trưởng thành.  Nuôi cấy mô sẹo.  Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).  Nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần). Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Hiện nay, các nhà khoa học sử