Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:84

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xây dựng một vector chuyển gen ở thực vật phục vụ việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột. Gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme AGPase ở sắn được phân lập và thiết kế vector biểu hiện trên cây mô hình (thuốc lá), để đánh giá khả năng hoạt động của vector chuyển gen và tích lũy tinh bột của gen chuyển.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Văn Đoài ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) Hà Nội - 2016
1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Văn Đoài ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn đƣợc hoàn thành bằng quá trình nghiên cứu khoa học của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Bích Ngọc cùng với cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật, viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu, kết quả đƣợc trình bày trong luận văn này là trung thực. Phần văn bản trích dẫn đều đƣợc ghi rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc hội đồng khoa học. Hà nội, tháng 12 năm 2016 Học viên
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành dựa vào kinh phí của đề tài: ““Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen”. Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học, em Lý Khánh Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, ủng hộ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt công việc và hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ I LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. II MỤC LỤC .....................................................................................................................III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... VI DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... VII DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... VIII MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3 1.1. Tinh bột.................................................................................................................3 1.1.1. Tinh bột ở thực vật ........................................................................................3 1.1.2. Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật...................................................................4 1.1.3. Dự trữ tinh bột ở lá cây..................................................................................6 1.2. Enzyme AGPase ...................................................................................................7 1.2.1. Enzyme AGPase ở thực vật ...........................................................................7 1.2.2. AGPase ở sắn............................................................................................... 10 1.3. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột .............................................................................................................................. 11 1.3.1. Tăng khả năng tích lũy tinh bột ...................................................................11 1.3.2. Tăng khả năng phân hủy tinh bột ................................................................ 12 1.3.3. Thay đổi thành phần tinh bột .......................................................................12 1.4. Công nghệ chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ...................................13 1.5. Biểu hiện nhiều gene trên cùng một khung đọc mở với 2a peptide ...................15
iv CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................17 2.1. Vật liệu ...............................................................................................................17 2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................17 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................17 2.2. Phƣơng pháp .......................................................................................................18 2.2.1. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử ........................................................18 2.2.2. Phân lập gen AGPS và AGPL từ cây sắn .....................................................21 2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL .............................................23 2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens ..............25 2.2.5. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR ...............27 2.2.6. Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng Western blot .............................. 28 2.2.7. Kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột của cây thuốc lá chuyển gen...............28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 31 3.1. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL ............................................................. 31 3.1.1. Nhân đoạn gen AGPS và AGPL bằng RT-PCR ..........................................31 3.1.2. Tách dòng gen AGPS và AGPL ...................................................................32 3.1.3. Kết quả giải trình tự với mồi M13F và M13R ............................................33 3.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen ....................................................................36 3.2.1. Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI..........37 3.2.2. Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121 .........39 3.2.3. Biến nạp pBI-35S-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................42 3.3. Kết quả chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá ....................................................42 3.3.1. Tạo cây thuốc lá chuyển gen AGPSL ..........................................................42 3.3.2. Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR ............................................44
v 3.3.3. Phân tích biểu hiện gen AGPSL bằng Western blot ....................................46 3.4. Kết quả định lƣợng tinh bột tích lũy ở lá............................................................ 48 3.4.1. Kiểm tra tinh bột bằng Iodine......................................................................48 3.4.2. Định lƣợng tinh bột bằng Anthrone ............................................................ 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................58 Kết luận......................................................................................................................58 Kiến nghị ...................................................................................................................58 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................59 Sách và bài báo ..........................................................................................................59 Website ......................................................................................................................62 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .....................................................................63 Bài báo .......................................................................................................................63 Trình tự gen ...............................................................................................................63 PHỤ LỤC ......................................................................................................................68
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ 35S Cauliflower mosaic virus 35S promoter 3-PGA 3-Phosphoglyceric acid A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADP Adenosine diphosphate ADPG Adenosine diphophate glucose AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase AGPL AGPase large subunit (Tiểu phần lớn AGPase) AGPS AGPase small subunit (Tiểu phần nhỏ AGPase) AGPSL AGPS-P2a-AGPL-cmyc ATP Adenosine triphosphate cDNA Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung) CDS Coding DNA sequence cmyc Myc (human c-Myc oncogene) epitope tag DBE Debranching enzyme (Enzyme khử nhánh mạng tinh bột) DNA Deoxyribonucleic EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GUS β-Glucuronidase gene isoform đồng phân (enzyme) kb Kilo base (1000 bazơ) kDa Kilodalton (1000 dalton) LB Lysogeny broth (Môi trƣờng nuôi cấy Lysogeny) NPTII Neomycin phosphotransferase II gene OD mật độ quang P2a 2a peptide PCR Polymerase Chain Reaction Pi Inorganic phosphate (Photphate vô cơ (HPO42-)) RNA Ribonucleic SBE Starch branching enzyme (Enzyme phân nhánh mạch tinh bột) T-DNA Transfer DNA Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol WT Wild type (Kiểu dại)
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách mồi PCR sử dụng ............................................................. 17 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green Master Mix 2X...............................................................................................................18 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase..19 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn ........................20 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân dòng đoạn AGPS và AGPL ............................................................................................ 22 Bảng 2.6. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp SmaI-P2a- AGPL-Cmyc-SacI ..........................................................................................................24 Bảng 2.7. Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen .............26 Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen AGPS và AGPL mới phân lập với trình tự tham chiếu .................................................................................................................34 Bảng 3.2. Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng ...........................53 Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng ..........................56
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo Akula Nookaraju) [1] ......................................................................................................5 Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48] ........6 Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20] ...........................................8 Hình 1.4 Con đƣờng tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37]...................................................................................................................................9 Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2010) [26] ....................12 Hình 1.6. Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47] ................................ 15 Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR ..............23 Hình 2.2. Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc ...................25 Hình 3.1. Kết quả RT-PCR nhân đoạn AGPS và AGPL từ RNA tổng số tách ở lá sắn .............................................................................................................................. 32 Hình 3.2. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL .............................................33 Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen AGPS và AGPL ..........................................34 Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS và AGPL mới phân lập ..........................35 Hình 3.5. Một số phƣơng án biểu hiện hai gen trên cùng một vector ................37 Hình 3.6. Kết quả tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc- SacI ................................................................................................................................ 38 Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI và SacI (A) và sơ đồ vector pBI121 (B) .....................................................................................................39 Hình 3.8. Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL .............40 Hình 3.9. Kết quả kiểm tra vector và A. tumefaciens mang vector pBI-35S- AGPSL...........................................................................................................................41 Hình 3.10. Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá ....................43
ix Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR cây thuốc lá chuyển gen AGPase. ..............45 Hình 3.12 Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPSL........47 Hình 3.13 Các bƣớc kiểm tra hàm lƣợng tinh bột lá bằng iodine [49]. .............48 Hình 3.14. Ảnh nhuộm iodine lá thuốc lá chuyển gen .......................................50 Hình 3.15 Sơ đồ phản ứng Anthrone với Glucose .............................................51 Hình 3.16. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone (I) (α = 0.05) .......................................................................................................................................52 Hình 3.17. Đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone (II) (α = 0.075) ........................55 Hình 3.18 Hàm lƣợng tinh bột trong lá cây chuyển gen và cây không chuyển sau 2h và 14h chiếu sáng ............................................................................................... 56
1 MỞ ĐẦU Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng nhƣ là nguồn lƣơng thực và nguyên liệu công nghiệp. Phần lớn tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tinh bột cũng là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các lĩnh vƣc công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, nhiên liệu, giấy và xây dựng… Nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên và tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên, do đặc tính dễ lên men. Năm 2015, lƣợng tinh bột đƣợc sản xuất trên thế giới lên đến 85 triệu tấn, gấp đôi so với năm 1995 (40 triệu tấn) [50]. Dự đoán, nhu cầu về tinh bột sẽ còn tăng mạnh trong tƣơng lai. Để đáp ứng nhu cầu tinh bột, ngoài việc tăng diện tích trồng trọt, tìm ra các cây trồng mới thì việc cải tiến các giống cũ là chiến lƣợc quan trọng trong nông nghiệp. Trong đó, cải tiến cây trồng theo hƣớng tăng năng suất tinh bột, giảm thời gian sản xuất hay cải tiến chất lƣợng tinh bột là những hƣớng nghiên cứu quan trọng và luôn đƣợc các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Các phƣơng pháp chọn giống, lai tạo truyền thống đã đạt đƣợc nhiều thành quả lớn trong cải thiện năng suất cây trồng. Tuy nhiên, năng suất tinh bột của các giống lai tạo đã gần đạt đến năng suất tối đa, trong khi đó, diện tích đất canh tác đang ngày càng thu hẹp. Bởi vậy, chọn tạo giống bằng công nghệ sinh học hiện đại (chuyển gen) đang là chiến lƣợc quan trọng trong sản xuất tinh bột trên thế giới. Năm 2000, 81% sản lƣợng tinh bột trên thế giới sản xuất từ ngô, tiếp đó là lúa mì (5%), khoai tây (8,3%), sắn và các cây trồng khác (5%). Nhƣng đến năm 2010, sản lƣợng tinh bột từ ngô còn 54%, trong khi đó sản lƣợng sắn tăng mạnh (33%) ) [50]. Thống kê này cho thấy ngô và sắn là hai cây trồng có tiềm năng lớn trong công nghiệp tinh bột. Trong gần một thập kỷ qua, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, rất nhiều công cụ đƣợc phát triển sẵn sàng phục vụ cho việc phân tích chức năng gen ở sắn, ví dụ nhƣ bản đồ di truyền, thƣ viện BAC (Bacterial artificial chromosome), thƣ viện EST (expressed sequence tags). Đặc biệt gần đây toàn bộ hệ
2 gen của sắn đã đƣợc giải trình tự [52]. Phân tích sự biểu hiện của toàn bộ hệ gen cũng là một công cụ hữu hiệu nhằm nâng cao khả năng tiếp cận của các nhà khoa học để nghiên cứu sâu các quá trình sinh học của sắn. Trong đó, nhiều gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột đã đƣợc nghiên cứu. Có thể kể đến các gen nhƣ: AGPase, nhóm gen GBSS, SS, SBE, DBE, ISA …. Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi glucose-1-P và ATP thành ADP-glucose và pyrophosphate. AGPase là enzyme quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen tăng khả năng tích lũy tinh bột [45]. Các nghiên cứu biểu hiện vƣợt mức AGPase phân lập từ thực vật hoặc từ vi khuẩn trên cây chuyển gen đều làm tăng hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong các mô chuyển gen. Gen AGPase ở sắn cũng đã đƣợc phân lập và chứng minh khả năng làm tăng khả năng tích lũy tinh bột ở thực vật [45], [46]. Nghiên cứu này xuất phát từ ý tƣởng xây dựng một vector chuyển gen ở thực vật phục vụ việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột. Gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme AGPase ở sắn đƣợc phân lập và thiết kế vector biểu hiện trên cây mô hình (thuốc lá), để đánh giá khả năng hoạt động của vector chuyển gen và tích lũy tinh bột của gen chuyển. Kết quả thu đƣợc có ý nghĩa trong việc nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng khả năng tích lũy tinh bột. Công trình này đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TINH BỘT 1.1.1. Tinh bột ở thực vật Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu tạo bởi hai loại polyme của glucose là amylose và amylopectin. Amylose là polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo nên từ các phân tử α-D-glucose nhờ các liên kết α-1,4-glucoside. Amylose đƣợc tạo ra từ 500-1000 phân tử α-D-glucose hoặc có khi chỉ khoảng 250-300 phân tử. Chuỗi phân tử glucose xoắn lại với nhau theo hình xoắn lò xo. Sự hình thành dạng xoắn lò xo là do sự hình thành các liên kết hydro giữa các phân tử glucose. Mỗi vòng xoắn có 6 đơn vị glucose và đƣợc duy trì bởi liên kết hydro với các dòng xoắn kề bên. Khoảng không gian giữa các vòng xoắn có kích thƣớc phù hợp cho một số phân tử khác có thể liên kết vào, ví dụ nhƣ iodine. Khi phân tử iodine liên kết vào vòng xoắn sẽ làm cho các phân tử glucose thay đổi vị trí và tạo nên phức màu xanh thẫm đặc trƣng. Ái lực của amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài mạch polymer. Amylopectin có cấu tạo phức tạp hơn amylose. Tham gia cấu tạo của amylopectin có khoảng 500,000 đến 1 triệu phân tử α-D-gluco liên kết với nhau, đƣợc nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Cứ khoảng 24-30 đơn vị glucose trên mạch sẽ có 1 liên kết α-1,6 glucoside để tạo mạch nhánh. Trên mạch nhánh cấp 1 lại hình thành mạch nhánh cấp 2, cứ nhƣ vậy phân tử amylopectin phân nhánh nhiều cấp rất phức tạp. Ngƣời ta có thể phân biệt đƣợc amylose và amylopectin dựa trên sự khác nhau về khối lƣợng phân tử; cũng nhƣ về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iodine. Amylopectin có phân tử lƣợng trong khoảng 107 đến 108; trong khi phân tử lƣợng của amylose chỉ khoảng 5x105 đến 106. Ở nhiệt độ 200C, khả năng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2 % khối lƣợng trong khi amylose là 20% khối lƣợng. Ngoài ra, amylose tƣơng tác với iodine tạo phức có màu xanh dƣơng, trong khi amylopectin tạo phức màu đỏ nâu. Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp và không quang hợp. Tinh bột đƣợc coi là nguồn carbohydrate dự trữ chủ
4 yếu và đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của tế bào thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của cây. Trong các cơ quan không diễn ra quá trình quang hợp nhƣ thân, rễ, củ và hạt, sucrose có thể đƣợc chuyển đổi thành tinh bột dự trữ trong một loại plastid chuyên biệt gọi là amyloplasts. Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là cơ quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (lúa, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến… ) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ thân (khoai tây, khoai mỡ New Zealand) và rễ củ (khoai lang, sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu. Tinh bột là nguồn carbonhydrate chủ yếu cho con ngƣời và đồng thời cho nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp. Hiện nay nguồn nguyên liệu tinh bột cho công nghiệp chủ yếu tách chiết từ ngô, tuy nhiên một lƣợng đáng kể khác từ lúa, lúa mì, sắn, khoai tây, arrowroot (Maranta arundinacea), và sago palm (Metroxylon sagu). Tinh bột từ các nguồn khác nhau có thành phần polymer, cấu trúc và thành phần hóa lý khác nhau. Thành phần hóa lý chính là chức năng của tinh bột quyết định khả năng ứng dụng của tinh bột. 1.1.2. Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật Tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan là một quá trình phức tạp, có liên quan đến quang hợp và sucrose (Hình 1.1) Quá trình này bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy ra trong lục lạp và bột lạp [35] [45]. i) Cung cấp glucose-1-phosphate (Glc-1-P) vào trong các thể lạp. Glc-1-P có thể đƣợc cung cấp từ quá trình quang hợp ở lục lạp (đối với tế bào quang hơp) hoặc từ quá trình chuyển hóa sucrose, sucrose nhận đƣợc từ mạch dẫn (đối với tế bào không quang hợp).
5 ii) Tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P và ATP nhờ enzyme AGPase. Đây là phản ứng quan trọng, có ảnh hƣởng đến tốc độ tổng hợp tinh bột. iii) Tổng hợp tinh bột (amylose và amylopectin) từ ADPG. Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo Akula Nookaraju) [1] Ghi chú: Sản phẩm của chu trình Calvin (DHAP và GA3P) được biến đổi thành Glucose-1-P và Fructose-6-P (hoặc 1-6PP). Glucose-1-P được chuyển đổi thành ADP-Glucose dưới sự xúc tác của AGPase, ADP-Glucose được xúc tác trùng hợp thành mạch tinh bột, quá trình này diễn ra trong lục lạp hoặc bột lạp. Glucose và Fructose cũng được chuyển hóa thành sucrose được dự trữ trong không bào hoặc chuyển tới các tế bào khác của cây. AI: acid invertase; CeSy: cellulose synthase; HK: hexokinase; FRK: fructokinase; FBPase: fructose- 1,6-biphosphatase; N/AI: neutral or alkaline invertase; PFP: pyrophosphate d -frucrose-6- phospahte 1-phosphotransferase; PGM: phosphoglucomutase; SoSUT1: spinach sucrose
6 transporter 1; SPP: sucrose phosphate phosphatase; SPS: sucrose phosphate synthase; SSy: starch synthase; SuP: sucrose phosphorylase; SuSy: sucrose synthase; SXD1: sucrose export defective 1; UDPase: uridine diphosphate- glucose pyrophosphorylase Nói một cách ngắn gọn, bƣớc đầu tiên không thể thiếu đƣợc là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP đƣợc xúc tác bởi AGPase. Một khi đƣợc hoạt hóa, enzyme starch synthase chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc dùng nhƣ là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (SBEs hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin (Hình 1.2). Cuối cùng amylopectin đƣợc tinh thể hóa tạo thành tinh bột dƣới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng đƣợc dự đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột [45]. Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48] 1.1.3. Dự trữ tinh bột ở lá cây Lá cây là cơ quan dự trữ sản phẩm quang hợp tạm thời của cây xanh. Tinh bột trong lá cây thƣờng đƣợc lƣu trữ ngay trong lục lạp. Tuy nhiên, có sự khác nhau về dự trữ tinh bột ở lá của một số thực vật. Các loài nhƣ thuốc lá, đậu tƣơng (Glycine max) [22], củ cải đƣờng (Beta vulgaris) [13] và Arabidopsis [46] … thì một lƣợng lớn tinh
7 bột đƣợc dự trữ ở lá. Trong khi đó, các loài khác nhƣ đậu Pháp (Phaseolus vulgaris) [13], rau bina (Pisum sativum) [41] thì lƣu trữ nhiều sucrose thay cho tinh bột. Ngoài ra, carbohydrate còn đƣợc lƣu trữ ở lá dƣới dạng raffinose và fructan [3], [32]. Ở một số loài nhƣ Pisum sativum và rau chân vịt, tinh bột chỉ đƣợc tổng hợp khi mà lƣợng sucrose đƣợc tạo ra vƣợt ngƣỡng dự trữ của lá, khi đó lƣợng tinh bột đƣợc tăng dần và sucrose giảm dần trong quá trình quang hợp [41]. Tuy nhiên, ở Arabidopsis, thuốc lá và các loài khác, luôn có một phần glucose từ quang hợp đƣợc tổng hợp thành tinh bột [46]. Khi đó, quá trình tổng hợp tinh bột và sucrose diễn ra song song, tốc độ tổng hợp của hai quá trình này đƣợc kiểm soát và phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng (đặc biệt là thời gian chiếu sáng). Cây trồng trong điều kiện ngày ngắn tích lũy nhiều tinh bột ở lá hơn so với trồng trong điều kiện ngày dài, khi đó, tinh bột đƣợc dự trữ nhiều hơn để cung cấp năng lƣợng cho trao đổi chất vào ban đêm [7], [17]. 1.2. ENZYME AGPASE 1.2.1. Enzyme AGPase ở thực vật Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho các bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột. AGPase đƣợc phát hiện ở hầu hết các nhóm thực vật bao gồm thực vật bậc thấp, thực vật một lá mầm và hai lá mầm. Nó xúc tác cho phản ứng biến đổi glucose-1-P và ATP thành ADPG và pyrophosphate. AGPase đƣợc xác định là enzyme dị lập thể (240 kDa), đƣợc cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL hoặc β, 51-60 kDa) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS hoặc α, 50 – 55 kDa) do hai gen tƣơng tứng mã hóa (Hình 1.3). Các tiểu phần nhỏ ở các loài khác nhau có độ tƣơng đồng cao (85– 95%) trong khi tiểu phần lớn thì đa dạng hơn (độ tƣơng đồng 50 – 60%) [29].
8 Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20]. Ghi chú: Mã số 1YP2 được đăng ký trên RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org), các tiểu phần được thể hiện với các màu khác nhau). Trong các tế bào quang hợp, sự hoạt động của AGPase trong lục lạp chủ yếu đƣợc điều khiển bởi 3-Phosphoglyceric acid (3-PGA), thế ôxy hóa khử (redox) và phosphate (Pi) [40] (Hình 1.4). Hợp chất 3-PGA là sản phẩm tham gia vào chu trình Calvin, xuất hiện khi xảy ra quá trình cố cacbon từ CO2. Sự xuất hiện của 3-PGA đồng nghĩa với việc bộ máy quang hợp đang hoạt động trong lục lạp, cơ chất glucose 1- phosphate đƣợc tạo ra. Lúc này, AGPase đƣợc kích hoạt bởi 3-PGA biến đổi glucose 1-phosphate và ATP thành ADP glucose và pyrophosphate. Pyrophosphate đƣợc thủy phân thành Pi. Sự tích lũy nhiều Pi (đồng nghĩa với việc sản phẩm ADP glucose đƣợc tạo ra nhiều) trong lục lạp làm ức chế hoạt tính của AGPase. Nhƣ vậy, tỉ lệ 3-GPA/Pi quyết định khả năng hoạt động của AGPase. Cơ chế điều hòa bằng thế ôxi hóa khử xảy ra ở tế bào quang hợp và không quang hợp, có ý nghĩa quan trọng trong vào ban đêm. AGPase bị bất hoạt khi các gốc sulfur cysteine của tiểu phần nhỏ bị ôxi hóa, cầu disulfide đƣợc hình thành giữa hai tiểu phần. AGPase đƣợc hoạt hóa trở lại nếu các cầu disulfide này đƣợc cắt bỏ. Tuy nhiên, cơ chế điều hòa gen AGPase các tế bào dự trữ tinh bột vẫn chƣa đƣợc rõ ràng.
9 Hình 1.4 Con đường tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37] Ghi chú: Fructose-6-P tạo ra từ chu trình Calvin được chuyển hóa thành Glucose -1-P. Glucose-1-P được hoạt hóa bởi ATP thành ADP-Glucose nhờ sự xúc tác của enzyme AGPase. AGPase được hoạt hóa bởi thế ôxi hóa khử và/hoặc 3-Phosphoglyceric acid được tạo ra từ chu trình Calvin và bị bất hoạt bởi nồng độ cao của Pi. (Viết tắt trên hình: Fru6P, fructose 6-phosphate; Glc1P, glucose 1-phosphate; Glc6P, glucose 6-phosphate; TPT, triose-phosphate/phosphate translocator. 3PGA: 3-Phosphoglyceric acid) Mặc dù đƣợc mã hóa bởi hai gen, tuy nhiên, trong cùng một loài có thể có nhiều isoform khác nhau. Ở lúa có 3 isoform đƣợc mã hóa bởi AGPS và 4 isoform mã hóa bởi AGPL [31]. Các isoform khác nhau có các tính chất khác nhau về khả năng xúc tác, mức nhạy cảm với các cơ chế điều hòa… Các isoform ở lá thƣờng nhạy cảm với 3-PGA/Pi trong khi ở các mô dự trữ thì có thể khác nhau. Ở tế bào nội nhũ lúa mì, phôi đậu Hà Lan, phôi đậu răng ngựa (Vicia faba) chứa những isoforms của AGPase có độ nhạy thấp hoặc không nhạy cảm với cơ chế điều hòa 3-PGA/Pi [12]. Đặc biệt, AGPase ở tế bào nội nhũ lúa mạch (Barley) có thể hoạt động mà không cần hoạt hóa bởi 3-PGA và ít nhạy cảm với sự ức chế của Pi [21]. Những isoform này mang lại nhiều ứng dụng trong việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả năng tích lũy tinh bột.