Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic - nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin; đánh giá khả năng phân hủy sinh học của màng axit polylactic – nisin; nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản màng axit polylactic – nisin; ứng dụng màng axit polylactic – nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua) và bánh cốm. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic - nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ THU PHƢƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLYLACTIC – NISIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC 1 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ THU PHƢƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLYLACTIC – NISIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành : Vi Sinh Vật Học Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. LÊ THANH BÌNH 2 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Nội – 2014 3 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU Những vấn đề nan giải đối với thực phẩm hiện nay không những phải đối mặt với thực trạng mất an toàn vệ sinh nghiêm trọng mà còn phải đáp ứng các nhu cầu tiêu dùng ngày càng cao về đảm bảo chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu. Trước thực trạng đó, nghiên cứu nhằm tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn là một ưu tiên trong xu hướng “đóng gói tích cực, active packaging”. Đóng gói tích cực là giải pháp trong đó có sự tương tác giữa vật liệu bao gói, thực phẩm và môi trường để gia tăng thời gian bảo quản, độ an toàn, trong khi vẫn bảo đảm chất lượng, các tính chất cảm quan, độ tươi ngon của thực phẩm. Trong hơn thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu, tìm kiếm, các loại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và vật liệu thay thế các polymer dầu mỏ, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacteriocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều. Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh, gây hỏng thối hỏng thực phẩm được xem là an toàn (GRAS). Hiện nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia an toàn có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia. Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đã khắc phục các nhược điểm của các phương pháp bảo quản bằng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Ngoài ra, nisin có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao. Vì vậy, nisin là ứng cử viên hàng đầu cho hướng nghiên cứu này. Trong số các polymer phân hủy sinh học, axit polylactic (PLA) được tổng hợp từ axit L-lactic, một loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật. Vì thế, PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polymer sinh học có khả năng thay thế các polymer từ dầu mỏ. Hiện nay, một số loại sản phẩm nhựa sinh học PLA đã ra đời như BiotaTM-Chai đựng nước bằng nhựa PLA, NobleTM- Bình đựng nước hoa quả bằng nhựa PLA, DannonTM-hộp đựng sữa chua bằng nhựa PLA. 4 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polymer sinh học và chất kháng khuẩn nguồn sinh học, để tạo ra sản phẩm bao bì thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh học- rõ ràng là một giải pháp “thân thiện môi trường” và là lựa chọn căn cơ cho sự phát triển bền vững. Xuất phát từ những thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”. với mục tiêu : - Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin - Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của màng axit polylactic – nisin - Nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản màng axit polylactic – nisin - Ứng dụng màng axit polylactic – nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua) và bánh cốm 5 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1. HIỆN TRẠNG VÀ XU HƢỚNG NGHIÊN CỨU BAO BÌ THỰC PHẨM KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN HỦY SINH HỌC Tình trạng thực phẩm hiện nay đang đứng trước các nguy cơ mất an toàn vệ sinh cao trong khi lại phải đáp ứng các nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm đảm bảo chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu. Xu hướng đó đã dẫn tới những thay đổi mạnh mẽ của ngành công nghiệp bao bì và đóng gói thực phẩm [18; 71]. Các loại bao bì an toàn và thân thiện môi trường được phát triển. Các loại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học đang dần thay thế các chất bảo quản hóa học và chất kháng sinh. Hướng nghiên cứu tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn, có khả năng ức chế, tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm, bảo đảm chất lương, độ tươi ngon của thực phẩm, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường đang thu hút nhiều nghiên cứu [12; 46; 47; 48; 51; 56; 58; 82]. Trong thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu, tìm kiếm, sử dụng các vật liệu có nguồn gốc sinh học để dần thay thế các polyme dầu mỏ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Hiện nay, các loại vật liệu phân hủy sinh học như axit polylactic (PLA), polyhydroxybutyrate (PHB) được xem là các ứng cử viên cho hướng phát triển này. Bởi vì, PLA, PHB có khả năng phân hủy trong tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường, không phụ thuộc vào tăng giá do quá trình khan hiếm của dầu mỏ... Trong số các polymer phân hủy sinh học, PLA là loại được tổng hợp từ axit L-lactic, loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật từ các nguồn nguyên liệu rẻ, có sẵn như ngô, khoai, sắn hoặc từ sinh khối thực vật. Vì thế, PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polyme sinh học có khả năng thay thế các polyme từ dầu mỏ. Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacterocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong quá trình bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm nhiều. Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh, gây thối hỏng thực phẩm và được xem là an toàn (GRAS). Nisin là một bacteriocin, cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp bởi một số chủng thuộc loài Lactococcus lactis. Nisin được Tổ chức Nông Lương và Y tế thế giới (FAO/WHO), cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép 6 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
sử dụng trong bảo quản và làm phụ gia thực phẩm. Hiện nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia. Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước. Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại dư lượng trong thực phẩm. Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp, sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Nisin có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao [18]. Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polyme sinh học và chất kháng khuẩn, để tạo ra sản phẩm bao bì bảo quản thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh học đang là mục tiêu của nhiều nhóm nghiên cứu. Trong công trình của Kritos và cộng sự [51], đã sử dụng màng natri – casein kết hợp với nisin để tạo ra màng kháng khuẩn. Trong khi đó, Xu và cộng sự [81] lại tạo màng từ glucomana – gellan - nisin, Millette và cộng sự [58] tạo ra màng kháng khuẩn sinh học bản chất alginate - nisin... Gần đây, trong công bố của Liu và cộng sự [56], các tác giả đã sử dụng 80 % PLA, 20 % pectin và kết hợp với 200 IU nisin/g để tạo ra loại polyme sinh học có tính kháng khuẩn. An toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt nam là một vấn đề vô cùng cấp bách, đang gây nhiều bức xúc, vấn nạn cho xã hội. Các loại thực phẩm được chế biến, bảo quản và vận chuyển hầu hết trong điều kiện không an toàn. Thực phẩm chủ yếu chỉ được đựng và bao gói bằng bao giấy và các màng polyme có nguồn gốc dầu mỏ. Những loại màng này được tạo ra từ các loại polyme như polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyvinylclorua (PVC). Nhược điểm của các loại màng này và bao giấy là, ngoài việc gây tổn thất chất dinh dưỡng trong quá trình bảo quản, lại không có tác dụng đối với vi sinh vật gây bệnh thực phẩm nội tại hay xâm nhập từ bên ngoài. Mặt khác, các màng này không có khả năng tự phân hủy, nên lại là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, việc bảo quản thực phẩm thường lạm dụng quá mức các chất hóa học và đặc biệt là việc sử dụng các chất kháng sinh trong y học vào bảo quản, chế biến thực 7 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phẩm, đây là một nguyên nhân dẫn đến tình trạng phát tán nhanh tính kháng thuốc, là nguy cơ lớn đối với sức khỏe con người. Việt Nam chưa có nghiên cứu về bao bì có tính kháng khuẩn và tự phân huỷ. Tuy đã có một số nghiên cứu về polyme sinh học như là chitosan, tinh bột biến tính và một số polymer được tách từ tự nhiên nhưng những nghiên cứu về chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của Lê Thanh Bình và cộng sự [3; 9]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình trên chủ yếu tập trung vào vấn đề tạo chủng giống, năng suất, công nghệ sản xuất, sản phẩm, hướng nghiên cứu tạo vật liệu bao bì thực phẩm chưa được đề cập. 1.2. NISIN 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về nisin Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức chế lẫn nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường được tìm thấy có mặt trong nước tiểu [73]. Những nghiên cứu tiếp theo của Florey và cộng sự cũng khám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu (diphtheria) bằng các vi sinh vật không gây bệnh, có tính đối kháng. Năm 1925, Gratia đã phát hiện đã ra sự ảnh hưởng lẫn nhau của hai chủng E. coli. Đến năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra nisin, một polypeptide do chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng L. lactis. Năm 1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng E. coli V có khả năng ức chế E. coi và gọi tên là “colicine”. Vào năm 1953, Jacob và cộng sự đã sử dụng “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các chất kháng khuẩn có bản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật. Năm 1982 theo Konisky thì thuật ngữ colicine ngày nay được dùng để chỉ các bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng thuộc loài E. coli và có quan hệ gần họ với họ Enterobacteriaceae. Chính vì thế mà ý nghĩa ban đầu của thuật ngữ bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: có phổ kháng khuẩn hẹp và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [18]. Sau đó, phát hiện bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid. Tại đây cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các chủng vi khuẩn Gram dương [18; 73]. Bateriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn Gram dương không có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng thấp hơn 8 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác dụng rộng hơn và khác nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào và nó có thể có trình tự đầu được phân chia trong giai đoạn thành thục [18; 45]. Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin – một sản phẩm do vi sinh vật sinh ra có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã được nghiên cứu rất nhiều về các đặc tính sinh hóa cũng như các đặc điểm về di truyền ở cấp độ phân tử bởi vai trò của nó trong vấn đề bảo quản. Bacteriocin có đặc tính giống như một kháng sinh vì nó có khả năng kháng khuẩn nhưng bacteriocin không phải là kháng sinh. Bacteriocin khác với các kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tác dụng, tính miễn dịch của chủng sản, đích tấn công… [19]. Bacteriocin có bản chất protein, được tổng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp, có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [21; 25; 73]. Theo Joger và cộng sự năm 2000, bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân hủy rất nhanh bởi enzym phân hủy protein trong hệ tiêu hóa của người. Vì vậy, để nghiên cứu bản chất protein của những bacteriocin mới người ta thường thử khả năng nhạy cảm của chúng với các enzym phân hủy protein. 1.2.2. Cấu trúc của nisin Nisin có công thức C143H230N42O37S7, là một bacteriocin thuộc nhóm I- còn gọi là nhóm lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm. Nisin cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài L. lactis subsp. lactis, thường được viết là L. lactis [18; 44; 77]. Nisin được phát hiện từ năm 1928. Tuy nhiên, phải mãi tới năm 1957 mới xuất hiện nisin đầu tiên trong các phân xưởng sản xuất pho mát quy mô nông trại, để bảo quản các sản phẩm làm ra. Cũng trong năm này, hãng Aplin và Barrett đã đưa ra chế phẩm nisin thương mại sử dụng trong thực phẩm. Mặc dù vậy, giá trị của nisin trong bảo quản thực phẩm cũng chỉ được xác lập trong khoảng ba thập kỷ lại đây. Trong khi những nghiên cứu cơ bản và công nghệ ngày càng được quan tâm nhiều hơn [18; 67; 77; 85]. Dạng chế phẩm của nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường là Nisaplin, với thành phần 2,5 % nisin. Cấu trúc của nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971. Nisin là một chuỗi polypeptide gồm 34 axit amin tạo thành 5 vòng cấu trúc A, B, C, D, E, được nối 9 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
với nhau bằng cầu nối disulfide (hình 1.1). Có ít nhất 6 dạng nisin đã được phát hiện, ký hiệu từ A đến E và Z. Đến nay, 4 loại nisin đã được nghiên cứu đặc tính là nisin A, Z, Q và nisin U. Trừ trường hợp nisin U được tổng hợp bởi loài Streptococcus uberis, tất cả các nisin còn lại đều do loài L. lactis sinh ra. Phân tử nisin không chứa các axit amin thơm, nên không hấp thụ ở bước sóng 280 nm. Các axit amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile), được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan. Có thể vì các nhóm này rất quan trọng để đảm bảo nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích. Cấu trúc gồm 5 vòng của nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt. Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3500 Dal. Tuy nhiên, do các phân tử nisin có thể tương tác, liên kết với nhau thông qua các nhóm axit dehydroamin và các nhóm amin. Vì vậy, nisin có thể tồn tại ở dạng dime hay tetrame, với khối lượng phân tử tương ứng là 7000 Dal và 14000 Dal. Hình 1.1. Cấu trúc phân tử nisin Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây, chứng minh nisin bao gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z. Trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu 2 dạng nisin là A và Z, chúng khá bền vững. Cấu tạo của nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một axit amin ở vị trí thứ 27, histidine trong cấu trúc của nisin A, trong khi axit aspartic ở nisin Z. Do có bản chất là một protein, nên hầu hết các đặc điểm hóa lý của nisin phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường xung quanh. Mức độ hoà tan của nisin phụ thuộc 10 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
rất nhiều vào pH. Nisin kém bền vững và dễ dàng mất hoạt tính ở pH cao. Nisin là một bacteriocin bền nhiệt. Sau 60 phút xử lý ở 100 oC, nisin vẫn còn 50 % hoạt tính. Ở 121 oC, sau 10 phút, hoạt tính còn 46 %, sau 60 phút còn 22 %. Độ bền nhiệt của nisin phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao. So với các bacteriocin khác, nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn. Nisin không có khả năng tác động đối với vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc. Trong điều kiện thông thường, nisin chỉ tác động được đối với vi khuẩn Gram dương, trong đó có vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria, Staphylococcus, Mycobacterium và các vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, Clostridium. Nisin tác động có hiệu quả cao hơn ở trong các sản phẩm thực phẩm có độ pH thấp, có trải qua giai đoạn gia nhiệt, như các sản phẩm rau quả, thực phẩm đóng hộp. Một trong những cơ chế giải thích tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm là do sự tạo thành các lỗ thủng, các kênh trên màng nguyên sinh chất, nguyên nhân gây thất thoát các phân tử, các ion có kích thước nhỏ trong nội bào, làm giảm lực vận chuyển proton PMF (Proton Motive Force), ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp ATP, dẫn tới sự chết tế bào [43; 59; 68]. Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm được nghiên cứu nhiều hơn. Phần lớn các quan điểm cho rằng, để tác động đối với vi khuẩn, nisin phải trải qua hai bước chính: - Ban đầu bám trên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua các thụ thể - Sau đó xâm nhập qua thành tế bào và tạo các lỗ trên màng nguyên sinh chất và thông qua các cơ chế theo mô hình “kiểu chèn”, theo kiểu nêm và cơ chế tạo mao quản có sự tham gia của lipide II [18; 35; 43]. 1.2.3. Cơ chế tác dụng của nisin Nisin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh, gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl. Tyrobutiricum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus... [17; 26; 30; 44]. Đối với bào tử, nisin có khả năng ức chế sự nảy mầm của chúng. Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, axit ...thì nisin có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [15] 11 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Nisin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn Gram (+). Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơn rất nhiều so với tế bào tại pha cân bằng [26]. Nguyên nhân do sự phá vỡ các tổ chức cục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin, sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập vào tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó [34; 73]. Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E. coli bị ức chế khi có mặt của EDTA. Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-) đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về dinh dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng. Điều này được giải thích là do sự khác nhau của thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Bacteriocin chỉ tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-) [26]. Tác dụng của nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình . Kiểu tác dụng không đặc trưng: nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm mà không cần phải có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng tế bào làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [30]. Kiểu hình thứ 2: nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bào đích và sự tương tác đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tế bào [79]. Mức độ tác động của nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vào thành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn. Ở vi khuẩn Gram (+), peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể lên tới 25 lớp. Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm 10% tổng khối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn có một lớp màng ngoài quan trọng (outer membrane – OM). Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương tự màng nguyên sinh chất nhưng không chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc mà còn có polysaccharide và protein. Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngoài thành tế bào. Vi 12 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào lớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả. Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà chỉ cho phép các hợp chất kỵ nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng. Lớp ngoài cùng của màng OM không có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán kị nước. Chính nhờ lớp màng ngoài OM mà vi khuẩn Gram (-) không bị tác động của các bacteriocin. Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của một số tác nhân thì có thể làm suy giảm chức năng rào cản của lớp màng ngoài OM, ví dụ như các tác nhân tạo phức “càng” (chelator) như ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sốc nhiệt, làm lạnh, axit, sốc thẩm thấu. Chính nhờ điều này mà người ta đã ứng dụng để xử lý kết hợp với bacteriocin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-). EDTA là hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất về tác động kết hợp nisin đối với vi khuẩn Gram (- ). Stevens và các cộng sự (1991) đã nghiên cứu sử dụng nisin kết hợp EDTA để tiêu diệt một số chủng Salmonella. Kết quả cho thấy với nồng độ nisin 50 mg/ml và EDTA 20 nM thì sau 1 giờ xử lý ở 37oC, số lượng tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều giảm từ 10 3,2 đến 10 6,9 CFU/ml. Trong khi đó khi sử dụng chỉ một trong hai tác nhân EDTA hoặc nisin thì số lượng tế bào giảm không đáng kể. 1.2.4. Khả năng diệt khuẩn của nisin Khả năng diệt vi khuẩn Gram (+) Nisin thuộc bacteriocin nhóm I, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B. cereus, Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L. monocytogens, L. innocua, L. grayi, L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri, L. welchimeri, Staphylococus spp, Mycobacterium. Giá trị quan trọng của nisin đối với việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm. Khả năng diệt vi khuẩn Gram (-) Trong một số điều kiện nhất định như khi kết hợp với các tác nhân chelate (ví dụ EDTA), nisin có thể tiêu diệt Salmonella. Trong điều kiện đông lạnh, xử lý nhiệt, pH 13 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thấp, nisin có thể ức chế một số vi khuẩn Gram âm như Salmonella, Shigella, Klebsiella, E. coli. Khả năng diệt nấm mốc Sử dụng nisin để bảo quản phomat người ta thấy rằng nisin làm giảm đáng kể vi sinh vật sinh bào tử bao gồm nấm mốc và Bacillus. Tác dụng của nisin lên nấm men Nghiên cứu mới đây cho thấy sử dụng nisin với nồng độ50 IU/g đã kéo dài thời gian bảo quản phomat Galotyri của Hy lạp đến 42 ngày. Các vi sinh vật chiếm ưu thế trong phomat như lactobacilli, lactoccoci và các nấm men đã giảm một cách đáng kể. 1.2.5. Ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm Việc ứng dụng bacteriocin vào bảo quản thực phẩm, không chỉ do có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt, mang tính thời sự cao mà còn do con người nhận thức rõ hơn về hậu quả của ô nhiễm môi trường, do việc sử dụng hóa chất và chất kháng sinh trong bảo quản [18; 43; 59; 68]. Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước [18; 77]. Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại dư lượng trong thực phẩm. Dùng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp, sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ [18; 43]. Sử dụng nisin trong các loại đồ uống có cồn có thể ngăn cản sự lên men axit lactic. Bổ sung nisin vào quá trình thanh trùng bia có thể kéo dài quá trình cất giữ bia. Nisin còn được sử dụng để bảo quản các thực phẩm chế biến từ đậu tương và chế biến từ ngũ cốc, các loại thức ăn đóng gói. Để bảo quản thực phẩm, nisin có thể bổ sung với hàm lượng 100 mg/kg- 200 mg/kg và tối đa là 500 mg/kg. Do đặc tính bền nhiệt, bền vững trong điều kiện pH axit hoặc trung tính, bacteriocin là một giải pháp hay trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men. Đối với thực phẩm lên men, người ta bổ sung vào đó các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thịt có khả năng sinh bacteriocin như là giống khởi động [34]. Các vi 14 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khuẩn lactic này sinh trưởng tạo ra pH thấp và sinh tổng hợp bacteriocin ức chế các vi sinh vật gây thối cũng như các vi sinh vật gây bệnh vốn có trong các sản phẩm tự nhiên. Do đó, sản phẩm lên men vừa có hương vị thơm ngon lại vừa an toàn cho người sử dụng. Đối với các sản phẩm thực phẩm không lên men (thịt, cá, rau xanh…), bacteriocin đóng vai trò là chất bảo quản, giữ cho thực phẩm được tươi sống lâu hơn do nó ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây thối, vi sinh vật gây bệnh trong sản phẩm tự nhiên. Bacteriocin của vi khuẩn lactic không những bảo quản thực phẩm được lâu hơn, tươi hơn mà còn không tạo màu sắc, mùi khó chịu cho sản phẩm bảo quản. Hơn nữa, chúng được coi là an toàn đối với người sử dụng và làm hạn chế hiện tượng kháng thuốc [55]. Theo tác giả B. Ten Brink thì bacteriocin của vi khuẩn lactic còn được sử dụng trong các nghiên cứu phân loại. Một loại bacteriocin của vi khuẩn lactic được sử dụng như một sản phẩm thương mại trong bảo quản thực phẩm là nisin. Nisin đầu tiên được sản xuất dưới dạng thương phẩm là nisin A với tên thương mại là Nisaplin. Nisin được quan tâm nghiên cứu nhiều cả ở trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp. Nisin được chứng minh là an toàn cho con người khi sử dụng từ năm 1962 bởi hai tác giả Frazer và Hara. FAO/WHO cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969. Năm 1988, tổ chức FDA của Mỹ công nhận nisin là an toàn cho sử dụng và nó được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm. Theo Linda J. Harris và cộng sự (1992), H. Chen và D.G. Hoover năm 2003 [18, 40], nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởi enzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin và erepcin. Nisin có chứa axit amin lanthionine (Ala-S-Ala) và β – methyllanthionine (Abu-S-Ala), axit amino butyric (Abu), dehydroalanin (Dha), dehydrobutyrin (Dhb). Nisin là một bacteriocin duy nhất được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Nó được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm, đặc biệt lĩnh vực áp dụng chính của nisin vẫn là các sản phẩm thực phẩm thông dụng hàng ngày (nhất là phomat 15 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
và các sản phẩm thực phẩm đóng hộp). Năm 1969, theo JECFA (the Join FAO/WHO Expert Committee on Food Additive) ngưỡng cho phép sử dụng nisin đầu vào (ADI – Acceptable Daily Intake) là 0,13 mg/kg thể trọng/ngày nhưng ngưỡng này là quá cao và đến năm 1988, FDA (Food and Drug Administration) dựa trên liều lượng tính toán đã đưa ra ADI là 0,049 mg/kg thể trọng/ngày tương ứng với một lượng là 2,9 mg/kg/1 người/ 1 ngày. Đến năm 1992, SCF (the Scientific Committee on Food) cho phép được sử dụng 0,13 mg nisin tinh khiết/kg thể trọng (với hoạt tính là 40.000 IU/mg). Năm 2001 FDA công nhận tính an toàn của nisin trong việc sử dụng nisin để bảo quản sản phẩm thịt lợn và thịt gia cầm đã chế biến với hàm lượng nisin có mặt tối đa là 0,0025 % ở trong sản phẩm hoàn thiện. Theo FSANZ [32] thì nisin ngày nay đã được phê chuẩn cho phép sử dụng như một chất kháng khuẩn an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thế giới bao gồm: Mỹ, Anh, EU, Trung Quốc, MERCOSUR (bao gồm Argentina, Brasil, Urugoay, Paragoay, Venezuela)… Ở Việt Nam, vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu, ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để chế biến cũng như bảo quản thực phẩm. Nhiều nông trường quốc doanh đã sử dụng biện pháp ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhờ quá trình lên men lactic [2]. Nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đã sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến thực phẩm dạng: thịt, cá hun khói, tôm chua, cá muối chua, xúc xích, sữa chua… Nhiều chế phẩm có nguồn gốc từ các vi khuẩn lactic sống được sản xuất ứng dụng trong việc chữa các bệnh rối loạn đường ruột cho người, các loại sữa có bổ sung khoáng và vi lượng như Fe, Ca, Mn, Cr… để làm thức ăn bổ sung cho trẻ nhỏ và những bệnh nhân suy nhược cơ thể. Cùng với sự phát triển của công nghệ chế biến các sản phẩm trong nước thì nhu cầu sử dụng bacteriocin mà cụ thể là nisin trong bảo quản thực phẩm là rất lớn. Tuy nhiên, các sản phẩm bảo quản nhập ngoại có giá thành tương đối cao. Thị trường các chất bảo quản sinh học có nguồn gốc trong nước như bacteriocin còn đang là vấn đề mở cho các nhà sản xuất. 1.2.6. Công nghệ sản xuất và các hƣớng nghiên cứu về nisin Nisin là chất diệt khuẩn sinh học được thương mại hóa với mức độ lớn nhất trong số các bacteriocin. Cho đến nay, nisin đã và đang được sản xuất công nghiệp bằng việc lên men chủng L. lactis tự nhiên, thông qua việc tối ưu hoá môi trường, điều 16 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kiện lên men, hoàn thiện công nghệ lên men, thu hồi và tinh sạch sản phẩm [18; 37; 49; 85]. Nhiều công trình nghiên cứu về việc nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp nisin từ vi khuẩn L. lactis đã được công bố. Jozala và đồng tác giả đã chứng minh, môi trường MRS và M17 là môi trường gia tăng sự sinh trưởng và tổng hợp nisin từ các chủng L. lactis. Một số tác giả khuyến cáo rằng, các môi trường tổng hợp thường không làm tăng tổng hợp nisin [37]. Tuy nhiên, việc phối hợp các chất bổ sung khác để giảm 50 % lượng môi trường MRS và M17 lại giúp giảm giá thành sản xuất. Li và đồng tác giả (2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa, ảnh hưởng của đường saccarose, pepton đậu tương, chiết nấm men, K2HPO4 , NaCl, MgSO4 đến sự sinh tổng hợp nisin [49]. Khi lên men trong môi trường được tối ưu, năng suất tổng hợp nisin đã nâng lên từ 1074 IU/ml đến 2150 IU/ml. Taniguchi Mashayuki và cộng sự đã nghiên cứu nâng cao năng suất nisin của L. lactis trong điều kiện nuôi cấy yếm khí với môi trường có thành phần gồm đường, các muối khoáng, các nguồn nitơ và sử dụng màng siêu lọc polycrylonitride để thu nhận nisin trên quy mô công nghiệp [74]. Hiroshi Shmizu và cộng sự lại sử dụng hệ thống nuôi cấy hỗn hợp loài L. lactis với Kluyveromyces marxianus. Các tác giả nhận thấy, K. marxianus đã sử dụng lactat sinh ra trong quá trình nuôi cấy L. lactis và vì vậy đã có tác dụng kiểm soát được pH trong môi trường lên men. Kết quả là, sản lượng nisin trong nuôi cấy hỗn hợp đạt 9,8 mg/l, cao hơn trong môi trường nuôi cấy đơn chủng L. lactis (5,8 mg/l) [69]. Tại Trung quốc, sau khoảng gần 6 † 7 năm nghiên cứu ở Viện Hàn lâm, việc sản xuất nisin ở quy mô công nghiệp trên nồi lên men 100 m3, đã bắt đầu từ khoảng năm 1995. Ngày nay, bên cạnh những nghiên cứu lý thuyết về cơ chế phân tử sự liên quan giữa cấu trúc và chức năng, cơ chế tác dụng của nisin, cơ chế miễn dịch của chủng sản cũng như vai trò của những enzym cải biên, thì hướng áp dụng kỹ thuật di truyền, kỹ thuật protein nhằm cải tiến hoạt tính, độ hoà tan, tính bền vững, tăng cường tác động của nisin đối với vi sinh vật thuộc nhóm Gram âm dành được sự quan tâm đặc biệt. Ngoài ra, xu hướng nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm, đang hình thành bên cạnh các nghiên cứu về năng suất và công nghệ tinh sạch cũng như công nghệ lên men. 1.3. AXIT POLYLACTIC 17 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Axit polylactic (PLA)/polylactide là một loại polyme nhiệt dẻo bán tinh thể, giòn và rắn, có nhiệt độ thủy tinh hóa tương đối thấp (~ 60 oC) và có nhiệt độ chảy mềm 175 ÷ 180 oC. Vì thế PLA dễ dàng được gia công trong các thiết bị gia công chất dẻo thông thường và PLA bị phân hủy theo con đường sinh học [10]. Hiện nay, trong số các loại nhựa phân hủy sinh học, PLA là đối tượng được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhiều nhất trên thế giới do PLA rất thích hợp để chế tạo ra các bao bì, màng bao gói thực phẩm, các sản phẩm sử dụng một lần nhằm thay thế các sản phẩm có nguồn gốc polyme dầu mỏ gây ô nhiễm môi trường [31]. Mặc dù thời gian phát triển mới chỉ khoảng một thập kỷ, nhưng chỉ riêng tại châu Âu tốc độ phát triển của nhựa phân hủy sinh học đã tăng gấp 10 lần. Điều này cho thấy tiềm năng chiếm lĩnh thị trường rất lớn của loại sản phẩm này. Một số sản phẩm đã được thương mại như túi sách, dụng cụ ăn uống sử dụng một lần của Công ty Mater - Bỉ, các loại móc phát bóng golf, đĩa DVD, đinh tự tiêu trong phẫu thuật... của Công ty Vegemat. Từ năm 2005, công ty đóng gói bao bì Coopbox của Ý đã sử dụng PLA làm khay đựng và màng film bao gói bảo quản các loại thịt tươi, rau quả cho phân phối và sử dụng khắp trong các nước thành viên của liên minh châu Âu [24]. Năm 2002 tập đoàn hóa chất DowChemical và tập đoàn thực phẩm Cargill của Mỹ đã liên kết đầu tư 300 triệu USD xây dựng nhà máy sản xuất PLA với công suất 140.000 tấn/năm. Cargill Dow đã sử dụng PLA như là nguyên liệu đáng tin cậy thay cho các chất dẻo truyền thống [16]. Đường, tinh bột và L-lactic L-lactide sinh khối thực vật Phản ứng trùng ngưng (nhiệt Phản ứng cộng mở vòng độ, áp suất) (nhiệt độ, chất xúc tác) L-Polylactic Phân tử lương thấp L-Polylactic Phân tử lượng cao Hình 1.2. Sơ đồ quy trình sản xuất PLA của hãng Cargill Dow, Mỹ Tại Nhật Bản, PLA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Một số hãng điện tử như NEC, Panasonic, Fujisu sử dụng PLA làm thẻ điện thoại, bàn phím máy tính, vỏ điện thoại và một số thành phần linh kiện máy tính. Ngoài ra, một số hãng ô tô như 18 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Toyota, Honda sử dụng PLA làm một số thành phần và nội thất của xe. PLA còn được sử dụng chế tạo các dụng cụ văn phòng, đồ chơi trẻ em, giầy dép trẻ em, vỏ chai, khay đựng và màng film bao gói thực phẩm [62]. 1.3.1. Sản xuất axit L-lactic Axit lactic có lịch sử lâu đời và được áp dụng phổ biến trong lên men và bảo quản thực phẩm. Axit lactic được khám phá lần đầu tiên bởi Scheele vào năm 1780, như là một thành phần của sữa. Năm 1789, Lavoisier đặt tên nó là axit sữa. Đến năm 1857, Pasteur là người phát hiện, axit lactic còn được tạo ra từ quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác [13]. Hiện nay, axit lactic được sản xuất theo hai con đường: tổng hợp hóa học từ nguyên liệu dầu mỏ, khí đốt và lên men vi sinh vật từ các nguyên liệu có thể tái tạo (đường, tinh bột và sinh khối thực vật) (Hình 1.2) [78]. Tổng hợp axit lactic theo con đường hóa học đòi hỏi các thiết bị công nghiệp chịu nhiệt, chịu áp và axit, đồng thời sản phẩm tạo ra theo con đường này thường là hỗn hợp hai dạng đồng phân D và L-lactic, dẫn đến chi phí cao do việc phân tách hai loại đồng phân này [22]. Theo cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ (FDA), axit D(–)- lactic, không được ứng dụng trong thực phẩm, bởi vì nó không được cơ thể con người đồng hóa dẫn đến tích lũy axit D(–)-lactic, gây rối loạn axit và làm thất thoát canxi trong cơ thể [42]. Đồng thời, tổng hợp theo con đường hóa học lại bị giới hạn bởi hai vấn đề chính đó là sự khan hiếm nguyên liệu dầu mỏ và vấn đề môi trường tạo ra. Để khắc phục các vấn đề trên, sản xuất axit lactic theo con đường lên men vi sinh vật được cho là một lựa chọn tối ưu [42]. Nguồn dầu mỏ Sinh khối thực vật Tiền xử lý bằng axit hoặc enzyme Acetaldehyde Lên men vi sinh vật (CH3CHO) Lên men vi sinh vật HCN, xúc tác Dịch lên men Lactonitrile(CH3CHOHCN) Thu hồi và tinh sạch Thủy phân bằng H2SO4 Tạo ra dạng racemic DL-lactic Tạo ra L- lactic hoặc D-lactic axit axit (a) tổng hợp hóa học 19 (b) Lên men vi sinh vật Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn - Các vấn đề về môi trường - Giải pháp thay thế - Cạn kiệt dầu mỏ
Hình 1.3. Sơ đồ sản xuất axit lactic (a): bằng con đường hóa học; (b): con đường lên men vi sinh vật Những vi sinh vật có thể sản sinh ra axit lactic được chia thành hai nhóm: nhóm vi khuẩn và nhóm vi nấm. Hiện nay, sản xuất axit lactic bằng lên men vi khuẩn thường sử dụng các loài Lactobacillus rhamnosus, L. helveticus, L. bulgaricus, L. casei, L. plantarum, L. pentosus, L. amylophilus, L. delbrueckii. Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đường glucose và lactose thành axit lactic với hiệu suất cao. Axit lactic tạo ra theo con đường lên men vi khuẩn thường không phải chỉ có axit L-lactic mà còn có thêm sản phẩm phụ là D - lactic. Tỷ lệ giữa hai đồng phân này phụ thuộc vào bản chất sinh học của từng loài và từng chủng [54; 83]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật di truyền để bất hoạt gen D-lactate dehydrogenase tổng hợp ra D-lactic, để điều khiển tổng hợp ra 100 % axit L-lactic [17; 27; 28]. Sản xuất axit L-lactic từ vi nấm khác với ở vi khuẩn lactic. Một số loài vi nấm như Rhizopus oryzae và Rhizopus arrhizus, có thể thủy phân, đồng hóa tinh bột và tạo ra 100 % đồng phân axit L-lactic. Quá trình này diễn ra trong điều kiện hiếu khí nghiêm ngặt [50; 75]. Nếu như quá trình lên men vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng thì quá trình lên men của Rhizopus chỉ cần môi trường muối khoáng thông thường. Vi nấm trong quá trình sinh trưởng trong môi trường dịch thể, sợi dinh dưỡng bó lại thành dạng pellet, vì thế dễ dàng loại bỏ sinh khối trong quá trình thu hồi sản phẩm sau lên men [82]. Mặc dù, quá trình sản xuất axit L-lactic từ vi nấm có nhược điểm là tạo ra lượng nhỏ axit fumaric và ethanol. Tuy nhiên, hai dạng sản phẩm phụ này có thể bị hạn chế sinh ra bằng cách điều khiển quá trình lên men và loại bỏ hoàn toàn thông qua quá trình trưng cất thu hồi axit L-lactic [61]. Như vậy, việc sử dụng lên men R. oryzae và R. arrhizus có thể thu nhận được axit L-lactic có phần dễ dàng hơn so với sử dụng các vi khuẩn lactic. 1.3.2. Tách và thu hồi axit L-lactic từ dịch lên men 20 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn