Luận văn thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ Am (Arbuscular mycorrhiza) in vitro

Chia sẻ: 123share | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

207
lượt xem 67
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ Am (Arbuscular mycorrhiza) in vitro" nhằm nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh Am in vitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ Am (Arbuscular mycorrhiza) in vitro

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ GIANG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ GIÁ THỂ MÔ RỄ ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI CỘNG SINH NẤM RỄ AM (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)IN VITRO Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.LÊ QUỐC HUY Hà Nội– Năm 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình. Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quốc Huy, Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ, giáo viên bộ môn Vi sinh vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, những người Thầy đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo sau Đại Học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn,giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Ngô Thị Thanh Huệ và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường cũng như tập thể cán bộ thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài. Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này./. Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác./. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1 1.1. Đặt vấn đề……………………………………………………………….. 2 1.2. Mục tiêu đề tài…………………………………………………………... 2 1.2.1. Mục tiêu chung………………….……….……………………….. 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể…………...…...………………………………….. 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……………………………….. 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học…………………………………………………. 2 1.3.1. Ý nghĩa thực tiễn…………………………………………………. 2 1.4. Phạm vi nghiên cứu……………………………………………………... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU………………………... 3 1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM...……………………………… 3 1.1.1. Khái niệm…………………………………………………………. 3 1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM(Arbuscular mycorrhiza)……. 4 1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ…………………….. 9 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogense…………………… 12 1.3. Nghiên cứu nẫm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam………….. 13 1.3.1. Trên thế giới ……………………………………………………... 13 1.3.2. Trong nước ……………………………………………………… 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu……………..……………………………………… 22 2.2. Nội dung nghiên cứu...…………………………………………………. 23 2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro………………….. 23 2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………….…………………….. 23 2.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………………………… 23 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro…………………………………..………… 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu...……………………………………………. 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm…………………………………... 24 2.3.2. Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro ………………………… 24 2.3.3. Phương pháp cấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ ……………… 28 2.3.4. Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro………………………… 28 2.3.5. Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro …………….. 29 2.3.6. Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí nghiệm…………………………………………………………………………. 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………… 31 3.1. Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễin vitro ………..…………………… 31 3.2.Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……………………………………………………………….. 32 3.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro………………………………………………………….. 38 3.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro……………………………………………………………………. 44 Chƣơng 4. KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ………………………..... 50 4.1. Kết luận………………………………………………………………… 50 4.2. Tồn tại và kiến nghị……………………………………………….......... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………............................................. 52 PHỤ LỤC………………………........................................................................ 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 AM Arbuscular mycorrhiza 2 EM Ectomycorrhiza 3 IBA Indole butylic acid 4 IP Infective propagules 5 M Minimal medium 6 MS Murashige and Skoog medium 7 MSR Strullu and Romand medium 8 PCR Polymerase chain reaction 9 Ri-tDNA Root inducing –transfer Deoxyribonucleic acid 10 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid 11 TY trypton-yeast extract medium 12 VAM Vesicular arbuscular mycorrhiza 13 VM Vesicular mycorrhiza Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA………………………………………………………………………… 32 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 34 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA……………………………………………………………………........ 35 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA………………………………………………………………………… 38 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA………………………………………………………………………… 40 Bảng 3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………….. 41 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA……………………………………………………………………......... 42 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833……………………………….. 45 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7………………………………….. 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 33 Biểu đồ3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 35 Biểu đồ3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 36 Biểu đồ3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………………. 37 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA……………………………………………………………………… 39 Biểu đồ3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri- tDNA……………………………………………………………………… 41 Biểu đồ3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA…. 42 Biểu đồ3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri- tDNA…………………………………………………………………. 43 Biểu đồ3.9: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 41833-Cà rốt Ri-tDNA, M7-Cà rốt Ri-tDNA, 41833-Medicago Ri-tDNA, M7-Medicago Ri-tDNA trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5…………………………………….. 44 Biểu đồ3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833……………………………….. 46 Biểu đồ3.11: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cộng sinh với chủng 41833 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5……… 47 Biểu đồ3.12: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7………………………………….. 49 Biểu đồ3.13: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ cộng sinh với chủng M7 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5…………. 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM……………………...…......….5 Hình 1.2.a: Búi sợi nấm (Arbuscules)…………………..…………………...……6 Hình 1.2.b: Túi sợi nấm (Vesicules)…………………..…………......................…6 Hình 1.3.a : Sợi nấm ngoại bào(extraradical hyphae) …………………...………..7 Hình 1.3.b : Bào tử (spores) ……………………………………...……………......7 Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình……………………………………………8 Hình 1.5.a: Cây Medicago truncatula phát triển bình thường…………..........…..11 Hình 1.5.b: Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ…………….……......11 Hình 1.6: Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A. rhizogenes(Veena and Taylor 2007)………..……………………………………………………..………13 Hình 2.1.a: Gieo hạt Medicago……………………..……………...………..…....24 Hình 2.1.b: Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày………………...…….……….....24 Hình 2.2.a: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 4 ngày gieo hạt.............................................25 Hình 2.2.b: Rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA phát triển sau 30 ngày...........25 Hình 3.1.a : Rễ Cà rốt không có gen Ri-tDNA......................................................31 Hình 3.1.b :Rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA.................................................................31 Hình 3.2. Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển gen Ri-tDNA. Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen); băng 3 và 4: không có gen rolB và rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA thang chuẩn 100 bp (Fermentas).......................................................................32 Hình 3.3.a: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA.................................................32 Hình 3.3.b: Rễ Medicago có gen Ri-tDNA...........................................................32 Hình 3.4.a: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR 0,5% agar………..….37 Hình 3.4.b: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR lỏng……..……...…...37 Hình 3.4.c: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MS 0,5% agar....……….….37 Hình 3.5.a: AM cộng sinh vào rễ Cà rốt và sinh trưởng sợi nấm mới……..….....45 Hình 3.5.b: AM cộng sinh vào rễ Medicago và sinh trưởng sợi nấm mới…….....45 Hình 3.6.a: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 1 tháng.......50 Hình 3.6.b: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 4 tháng.......50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nhân loại đang rất nỗ lực trong việc giải quyết 3 vấn đề lớn, đó là (i) Tăng sinh trưởng và năng suất cây trồng, đảm bảo an ninh lương thực và năng lượng, (ii) Giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng với biến đổi khí hậu, (iii) Phát triển bền vững và nâng cao chất lượng cuộc sống(AFCconference 2012). Các giải pháp sinh học theo hướng ―tiếp cận xanh‖ (Green approach) được nghiên cứu và hưởng ứng áp dụng mạnh mẽ nhằm làm tăng năng suất cây trồng, vật nuôi, giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng tốt nhất với biến đổi khí hậu. Nghiên cứu phát triển ứng dụng các chế phẩm sinh học, vi sinh, dần thay thế các loại sản phẩm hóa học cho tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi trường đang ngày càng được quan tâm và đầu tư phát triển. Nâm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) được nghiên cứu sử dụng như một loại phân bón sinh học, một mặt có tác dụng làm tăng cường hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng, đặc biệt là hấp thụ Lân và giữ nước trên những lập địa thoái hóa, do đó làm tăng sinh trưởng và năng suất, mặt khác nó cũng có tác dụng làm ổn định cấu trúc, đặc tính sinh học của đất và là yếu tố chỉ thị cho mức độ suy thoái của môi trường đất. Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh AM mới chỉ tập trung nhiều cho các cây trồng ngắn ngày, công nghệ chế phẩm AM vẫn phổ biến áp dụng ở dạng thô sơ truyền thống là ―chất nhiễm đất‖ (soil innoculum), bẫy thực vật (AM trap plant), chưa đáp ứng được các nhu cầu đòi hỏi của xản xuất cả về mặt số lượng, chất lượng sản phẩm, cũng như quy mô và hiệu quả của việc áp dụng vào sản xuất. Do vậy, hướng đi đột phá mới trong nghiên cứu AM là công nghệ nhân sinh khối AMinvitrocó khả năng góp phần giải quyết được các vấn đề tồn tại nêu trên của các loại chế phẩm AM truyền thống, trong đó môi trường nuôi cấy và giá thể rễ thực vật chủ là những yếu tố rất quan trọng trong nghiên cứu về công nghệ nhân sinh khối AM invitro. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhằm góp phần giải quyết các vấn đề tồn tại đã nêu trên của nghiên cứu ứng dụng công nghệ AM, đặc biệt trong lĩnh vực Lâm nghiệp, Đề tài nghiên cứu Thạc sĩ ―Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro ‖đã được đề xuất thực hiện. Đề tài Thạc sĩ này của tôi được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài cấp Nhà nước về ―Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) cho cây Lâm nghiệp‖thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu chung Nhằm nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Nhằm nghiên cứu lựa chọn được môi trường phù hợp cho hình thành cộng sinh và nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro. - Nhằm nghiên cứu lựa chọn được giá thể mô rễ phù hợp cho nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1.Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các cơ sở khoa học quan trọng cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường. 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đề xuất được loại môi trường và giá thể mô rễ phù hợp nhất cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm AM phục vụ gây trồng cây lâm nghiệp. 1.4. Phạm vi nghiên cứu Đề tài được tiến hành nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM 1.1.1.Khái niệm Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm trong đất với rễ của thực vật bậc cao.Frank là người đầu tiên phát hiện ra đặc điểm kết hợp đặc biệt này ở rễ của cây Cupulifereae vào năm 1885 và gọi đó là mycorrhiza. Từ ―mycorrhiza‖ có nghĩa là ―nấm- rễ‖, tác giả đã dùng từ này để nhấn mạnh mối quan hệ giữa nấm và rễ cây (Roger et al. 2004a). Nấm rễ nội cộng sinh AM được xác định là mối quan hệ không thể thiếu ở hầu hết các loài thực vật (hơn 90% các loài thực vật có khả năng hình thành cộng sinh AM). Sự kết hợp đó mang lại lợi ích cho cả thực vật và vi sinh vật, qua đó, nấm có được các hợp chất đồng hóa từ thực vật để sống, đồng thời nấm lại giúp rễ cây tăng cường khả năng hấp thụ nước, các chất hữu cơ hòa tan trong đất đặc biệt là phospho, chống chịu các yếu tố bệnh hại cũng như các chất độc kim loại nặng. Do đó, có tác dụng cải tạo và ổn định cấu trúc đất, cân bằng hệ sinh thái.Quan hệ cộng sinh này đặc biệt thể hiện vai trò trên những vùng đất khô cằn, hệ sinh thái bị xáo trộn nghiêm trọng, nghèo dinh dưỡng hay có tiềm năng độc hại cao. Vì vậy công nghệ AM có khả năng áp dụng rộng cho nhiều loài cây lâm nghiệp, không chỉ giúp tạo ra được nguyên liệu cây trồng rừng có chất lượng cao, khả năng thích nghi và năng suất tốt trên những lập địa cằn cỗi mà còn đáp ứng tốt nhất cho nhu cầu sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đất đai theo mục tiêu mở rộng diện tích cây trồng rừng nhưng không cạnh tranh với đất trồng cây nông nghiệp, tăng cường hiệu quả sử dụng các vùng đất hoang hóa theo cách bền vững và thân thiện với môi trường. Mycorrhiza có phân bố ở hầu khắp các nơi, thấy ở cây cỏ, rêu, dương xỉ, một số cây lá kim, và hầu hết các cây lá rộng. Sự phổ biến cùng với những vai trò tích cực của nấm rễ đã kích thích việc nghiên cứu về mycorrhiza ngày càng mở rộng và sâu sắc hơn. Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu cơ bản được thực hiện bởi hàng trăm các nhà nghiên cứu từ các nước khác nhau trên thế giới đã đem lại nhiều kết quả hết sức ý nghĩa cho ứng dụng mycorrhiza trong hệ sinh thái nông nghiệp,lâm nghiệp và môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dựa trên đặc điểm xâm nhiễm của nấm vào rễ cây chủ, mycorrhiza được phân thành 2 nhóm chính là ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza, EM), và nội cộng sinh (Endomycorrhiza, AM). Ectomycorrhiza:Ectomycorrhiza có ở những cây gỗ lớn, điển hình là thông, sồi, cáng lò, những cây có giá trị kinh tế cao, tuy nhiên ectomycorrhiza có tính đặc trưng loài. Đặc điểm của ectomycorrhiza là sợi nấm nội bào chỉ xâm nhập vào khoảng gian bào của các tế bào vùng vỏ rễ và sợi nấm ngoại bào phân nhánh mạnh tạo thành lớp vỏ bao quanh rễ nên làm biến đổi hình thái bên ngoài của rễ. Hầu hết ectomycorrhiza thuộc LớpBasidiomycetes như Agaricales, số ít thuộc LớpAscomycetes. Endomycorrhiza:Hình thành ở khoảng 80% thực vật bậc cao. Đặc điểm của endomycorrhyza là sợi nấm của chúng xâm nhập vào bên trong tế bào vỏ rễ của thực vật bậc cao và không gây nên những biến đổi hình thái bên ngoài của rễ, thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo lớp vỏ bao ngoài rễ. Cấu trúc điển hình của endomycorrhiza là sự hình thành những cấu trúc đặc biệt vesicules và arbuscules. Ở một số nhóm endomycorrhiza người ta quan sát thấy có vesicules(Vesicular mycorrhiza, VM) hoặc arbuscules (Arbuscular mycorrhiza, AM) hoặc đồng thời cả hai cấu trúc này trong tế bào vỏ rễ (Vesicular arbuscular mycorrhiza, VAM). Vậy AMlà thể cộng sinh giữa nấm với rễ cây ở thực vật bậc cao mà hình thành nên cấu trúc đặc biệt vesicules, arbuscules trong tế bào vỏ rễ và không gây biến đổi hình thái ngoài của rễ. Do tính phổ biến, có lợi và không cố hữu cho 1 loài nên nhóm vesiculesarbuscular mycorrhiza rất được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong nông nghiệp cũng như trong lâm nghiệp. 1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) a. Phân loại Trong một thời gian dài AM được xếp vào ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomycota) do cấu trúc sợi nấm không có vách ngăn, lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes). Hiện nay, bằng những nghiên cứu mức độ phân tử hệ thống phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
sinh loài đã cho thấy Zygomycota là ngành đa hệ (poli-phyletic), do đó nấm AM được tách ra khỏi ngành Zygomycota hình thành lên ngành mới là Glomeromycota. Phân loại đến cấp họ cho AM được dựa trên 4 tiêu chí cơ bản: - Cấu trúc mycorrhiza cộng sinh trong rễ. - Phương thức hình thành bào tử khi được phân lập trong đất. - Cấu trúc nội bào tử. - Phương thức nảy mầm bào tử. Hệ thống phân loại AM hiện nay ( dựa trên trình tự của rRNA ) được tóm tắt trong hình sau: Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM (Nguồn:http://www.google.com.vn/url?source=imglanding&ct=img&q=http://invam.caf. wvu.edu/fungi/taxonomy) N b. Cấu trúc Nấm rễ nội cộng sinh (AM) có cấu tạo điển hình bao gồm cấu trúc nội bào (arbuscules, vesicules, sợi nấm nội bào) và cấu trúc ngoại bào (sợi nấm ngoại bào, bào tử). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 Nhóm cấu trúc nội bào: a b Hình 1.2: Búi sợi nấm (Arbuscules) (a) Túi sợi nấm (Vesicules) (b) Nguồn:(Hà 2011) - Arbuscules: là thể giác mút, lưỡng phân, dạng như lông bàn chải, là phần trao đổi dinh dưỡng chính giữa thực vật chủ và nấm (Gianinazzi et al. 2002).Chúng được hình thành bên trong tếbào vỏ rễ(Mosse and Hepper 1975b) và là dấu hiệu cho biết có hoạt động của mycorrhiza. Tùy vào từng loài khác nhau mà arbuscules cũng có những đặc trưng riêng về hình dạng và sự phân nhánh. - Vesicules: có dạng hình cầu hoặc trứng, có thành tế bào dày, là cơ quan dự trữ dinh dưỡng cho nấm, có chứa lipit và glycolipit (Mosse and Thompson 1981a). Nó được tạo thành bởi đoạn giữa hay đầu lồi tận cùng của sợi nấm nội bào, phân bố trong khoảng gian bào hoặc bên trong tế bào vỏ rễ. - Sợi nấm nội bào: sợi nấm nội bào không có vách ngăn,dạng thẳng hoặc phân nhánh hình chữ H hoặc Y,chúng cũng hình thành dạng cuộn, tần số xuất hiện của chúng phụ thuộc vào vị trí trong rễ và đặc điểm của từng loài nấm (Morton2000). Sợi nấm vừa là phần chứa chất dự trữ vừa là một phần của con đường vận chuyển các chất hấp thụ bởi các sợi nấm bên ngoài từ đất tới arbuscules hoặc trực tiếp tới tế bào rễ của cây chủ (Bieleski 1973). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 Nhóm cấu trúc ngoại bào: a b Hình 1.3: a: Sợi nấm ngoại bào (extraradical hyphae) b: Bào tử (spores) Nguồn: (Hà 2011) - Sợi nấm ngoại bào:Sợi nấm ngoại bào không có vách ngăn, vai trò làm tăng rõ rệt diện tích hấp thụ của rễ cây (Bieleski 1973), cầu sợi nấm hình thành con đường vận chuyển chất dinh dưỡng giữa thực vật cộng sinh và khối đất bám quanh rễ (Koske and Gemma 1989). Sợi nấm ngoại bào tạo ra chỗ cư ngụ quan trọng của hệ nấm rễ (Jasper et al. 1989, 1991). - Bào tử:Bào tử có thể dạng đơn hoặc đa bào, chủ yếu hình thành ở đầu của sợi sinh bào tử nối tiếp với sợi nấm ngoại bào, đôi khi bào tử cũng xuất hiện bên trong rễ (Koske et al. 1985), trên bề mặt đất (BeCard and Fortin 1988), trên bề mặt thực vật hay các mảnh phân giải (Blaszkowski et al. 1998). Số lượng bào tử hình thành phụ thuộc vào từng loài nấm (Blaszkowski, 1993), loài cây chủ và tính đa dạng của nó (Blaszkowski1993; Hetrick and Bloom1986), độ màu mỡ của đất và chế độ phân bón (Koske et al. 1989), đặc điểm vật hậu của cây chủ (Giovannetti and Avio 2002), cường độ ánh sáng (Daft and El Giahmi 1978), và khả năng cạnh tranh của từng loài nấm (Koske et al. 1989). Bào tử có kích thước tương đối lớn (50 ÷ 500 µm), lớn hơn nhiều so với bào tử của những loại nấm khác. Vai trò của bào tử là phát tán đến nơi sống mới, và khởi đầu quá trình sinh trưởng khi được tách ra từ cơ thể mẹ. Do đặcđiểm cấu trúc các thành phần cấu tạo nên bào tử ổn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
định trong những điều kiện sinh thái khác nhau nên chúng được coi là tiêu chí quan trọng trong phân loại AM. Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình (Bao gồm arbuscules, vesicles, sợi nấm ngoại bào và bào tử) (Nguồn: http://mycorrhizas.info/vam/vamsoil2.gif) c. Sinh trưởng AM là thể cộng sinh bắt buộc. AM có thể tồn tại một thời gian dài trong đất, thậm chí khi đất bị hạn hay băng giá dưới dạng các mảnh sợi nấm trong các rễ chết hoặc tự do trong đất. Tuy nhiên, để sinh trưởng được trong một thời gian dài AM cần có cây chủ để thu nhận cacbon và năng lượng cần thiết. Do đặc điểm này mà không thể tiến hành nuôi cấy AM trực tiếp trên môi trường nhân tạo mà cần phải có giá thể là rễ của thực vật bậc cao. d. Chu trình sinh sản và vòng đời Không có chứng liệu về sự sinh sản hữu tính của AM. Nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử đã xác định không có sự tái tổ hợp hoặc ở mức độ rất thấp (Kuhn et al. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2001). Vì thế thường giả định rằng bào tử được hình thành bằng sinh sản vô tính bằng bào tử hoặc sợi nấm. Phương thức nảy mầm của bào tử: Trong những điều kiện nhiệt độ thí ch hợp , bào tử AM sẽ nảy mầm trong đất , trên rễ cây chủ , hình thành sợi nấm tạo mạng lưới hệ sợi phân bố trong đất và ăn sâu vào rễ cây chủ . Bào tử có thể tạo ra hệ sợi nấm bên trong cũng như bên ngoài rễ. Sinh sản bằng sợi nấm: Nhiều loài AM có thể nhân lên từ mảnh sợi nấm trong đất hoặc trực tiếp từ thể cộng sinh trên rễ cây . Đặc điểm của nấm rễ nội cộng sinh AM là thể cộng sinh bắt buộc với rễ cây chủ, do đó nếu không có rễ cây chủ cho các sợi nấm nảy mầm và cộng sinh thì sinh trưởng của nấm sẽ bị ngừng trệ lại sau một thời gian và tế bào chất có thể co lại bên trong bào tư .̉ Phương thức nuôi cấy: Để nuôi cấy nấm rễ nội cộng sinh AM , có thể sử dụng hai phương thức nuôi cấy , đó là : nuôi cấy in vitro và in vivo. Đối với nuôi cấy in vivo, có thể nuôi cấy trong chậu bằng đất hiện trường có chứa bào t ử hay sợi nấm (Bianciotto và cộng sự , 2000; Hijri và cộng sự , 2002). Còn đối với nuôi cấy in vitro, có thể tạo ra một số lượng lớn nấm rễ thông qua nuôi cấy mô rễ trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (Fortin et al. 2002). Đặc biệt là trong nuôi cấy mô rễ, sinh khối nấm rễ tạo ra thường không chứa tạp chất và các vi sinh vật khác nên phương pháp này được sử dụng nhiều. 1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ Nấm rễ là thể sống cộng sinh bắt buộc. Những hoạt động của nấm cũng như của thực vật có vai trò hỗ trợ cho nhau. Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật dưới dạng đường hexoses và các vitamin. Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang nấm được thực hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào. Tại các sợi nấm nội bào diễn ra quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose, lipit… cho hoạt động của nấm (Turmel 2004). Gần 20% cacbon do thực vật tổng hợp được chuyển sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được nấm biến đổi và dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng thêm nguồn hữu cơ trong đất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụ các chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụ dinh dưỡng lân (P), hấp thụ nước, chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường, đặc biệt trên các hiện trường đất đai cằn cỗi, khô hạn. Hoạt động này được tăng cường là do nấm rễ nội cộng sinh hình thành nhiều hệ sợi nấm phân nhánh mảnh tạo thành vô số cầu nối giữa môi trường đất với các tế bào rễ, tăng diện tích tiếp xúc với đất, biến đổi môi trường quanh rễ làm cho các chất trở nên linh động và thực vật có thể hấp thụ được (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được cung cấp nhờ nấm) (Turmel 2004). Sợi nấm có thể lan rộng đến 8cm quanh rễ và hấp thụ chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần. Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm cao gấp 6 lần so với qua các lông rễ. Không những thế, thực vật còn được hưởng lợi nhờ được tăng cường khả năng hấp thụ nước và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh. AM có vai trò kích thích sinh trưởng thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như auxins, cytokinins, gibberellic acids và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ chống lại các mầm bệnh từ trong đất. Sự cộng sinh AM có thể làm tăng cường sinh trưởng của cây con lên đến 400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn và nghèo dinh dưỡng (Pope 2007). Thực tế ở những loài gỗ lớn có cộng sinh AM cho thấy cây vẫn tồn tại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây không có cộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh AM đạt ngang với cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng bằng một nửa. Những loài sống phụ thuộc vào AM chủ yếu là ở những nơi đất chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinh dưỡng tồn tại nhiều ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờ đến sự lan rộng của hệ sợi nấm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn