Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bạch đàn là loài cây sinh trưởng nhanh, thích nghi tốt. Tại Việt Nam, gỗ Bạch đàn được dùng làm nguyên liệu giấy (hiệu suất bột giấy 49.5%), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn được dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc; gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi,.... Luận văn đã tiến hành "nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy". Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- ĐỖ THỊ THỤC NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (EcHB1)VÀO BACHJ ĐÀN LAI PHỤC VỤ CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN GIẤY Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2014 MỞ ĐẦU Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1
Các loài Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930 và đến nay đã trở thành nhóm cây trồng chủ lực trong các chương trình trồng rừng tập trung và phân tán ở nước ta. Đến năm 2011, tổng diện tích rừng trồng Bạch đàn ở Việt Nam là 353,000 ha, chiếm 32% diện tích rừng trồng cả nước (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2011). Bạch đàn là loài cây sinh trưởng nhanh, thích nghi tốt. Tại Việt Nam, Bạch đàn được trồng tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc, Đông Bắc, vùng trung tâm, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Gỗ Bạch đàn được dùng làm nguyên liệu giấy (hiệu suất bột giấy 49.5%), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn được dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc; gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi. Tỷ trọng gỗ ở năm 6 tuổi là 488 kg m3 (Luo Jianzhong , 2003), chiều dài sợi gỗ là 982,4 mm (cho phần gỗ mềm) và 110,46 mm (cho phần gỗ cứng) (Bai Jyayu và cs , 2003) [15]. Gỗ Bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp sản xuất giấy vì gỗ Bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản xuất từ gỗ Bạch đàn. Bên cạch đó, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài ra, lá của một số loài Bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm. Bạch đàn lai được đánh giá có ưu thế lai và sinh trưởng tốt hơn bố mẹ của chúng (Lê Đình Khả và cs, 1993) [6]. Cho đến nay, nhiều tổ hợp Bạch đàn lai có sinh trưởng vượt trội hơn bố mẹ đã được công nhận giống tiến bộ khoa học kỹ thuật và được khuyến khích gây trồng rộng rãi. Dân số thế giới đã đạt đến con số kỷ lục 7 tỷ người và nó được dự đoán sẽ tăng lên 8 tỷ người vào năm 2025 và 10 tỷ người vào những năm 2050. Do vậy vấn đề cung cấp lương thực cũng như các nguyên vật liệu khác cho nhu cầu sinh hoạt của con người trong những thập niên tới là một thách thức rất lớn đối với toàn nhân loại. Các phương pháp chọn giống truyền thống sẽ khó có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp thực phẩm cho con Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2
người trong tương lai. Để đáp ứng được nhu cầu đó, trong những thập kỷ vừa qua, công nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ biến đổi gen đã đem lại một bước nhảy vọt không những trong việc tăng năng suất và chất lượng cây trồng như tạo giống năng suất cao, chống bệnh sâu hại, chống chịu khí hậu lạnh, khô hạn và thiếu nguồn dinh dưỡng, kháng thuốc trừ cỏ…mà còn cải thiện được môi trường như giảm hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật, giảm lượng phân bón…. Trong lĩnh vực Lâm nghiệp, cây biến đổi gen cũng đã được quan tâm nghiên cứu. Trong những năm gần đây một số kết quả nghiên cứu chuyển gen cho một số loài cây rừng như Bạch dương, Thông radiata, Liễu và Bạch đàn đã được tiến hành và thử nghiệm thành công ở một số nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Brasil, Chi Lê và Trung Quốc. Mục đích chính cho nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ở đây là chuyển một số gen liên quan đến tăng sinh khối, chống chịu sâu bệnh và điều kiện khô hạn, giảm hàm lượng lignin, tăng hàm lượng và độ dài sợi cellulose, mang lại lợi ích to lớn cho ngành công nghiệp giấy cũng như cải tạo môi trường tại những vùng đất suy thoái thiếu chất dinh dưỡng… Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn cả, vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng lại mang lại hiệu quả cao (lượng bản sao gen biến nạp ít tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào). Hầu hết các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp đã công bố đều sử dụng vector trung gian là vi khuẩn A. tumefaciens (Chen và cs, 2001; Han và cs, 2000; Vengadesan và cs, 2006;…) [17]. Ở cây rừng, một số tính trạng có giá trị kinh tế như tính chất gỗ (hàm lượng cellulose, hàm lượng lignin, chiều dài sợi gỗ ...) và khả năng ra rễ... do nhiều gen (polygene) quy định. Những gen này tùy từng giai đoạn phát triển của cây mà có ảnh hưởng nhất định, tuy nhiên, trong đó có những gen chính (major genes) có ảnh hưởng lớn đến biểu hiện tính trạng của cây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3
Đối với tính trạng chiều dài sợi gỗ, các nhà khoa học đã xác định được một số gen chính có ảnh hưởng đến tính trạng này, trong đó có gen EcHB1 (accession number: AB458829). Gen EcHB1 được xác định là mã hóa cho nhân tố phiên mã HD-Zip class II ở Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và thường biểu hiện ở thân trưởng thành và tế bào rễ. Các nghiên cứu cho thấy gen EcHB1 sau khi biến nạp vào cây Thuốc lá đã cho chiều dài sợi gỗ dài hơn 1,2 lần so với đối chứng. Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy” Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn lai nói riêng Bạch đàn (Ecucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Hai lá mầm (Dycotyledone). Tên Bạch đàn Ecucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutell đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới 600 loài và biến chủng đã được mô tả và đặt tên, gần đây 500 loài đã được chấp nhận chính thức. Theo Boland và cs (1987), Eldridge và cs (1993) chi Bạch đàn được chia làm 8 chi phụ. Trong đó, chi phụ Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng và trồng rừng đại trà như: E. camaldulensis, E. urophylla, E. tereticornis, E. grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Australia và chỉ có 2 loài phân bố ngoài Australia là loài E. deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake. Bạch đàn bao gồm nhiều loài khác nhau và là cây trồng rừng phổ biến trên thế giới. Ước tính có trên 10 triệu ha Bạch đàn được trồng ở châu Á, Nam Mỹ, Nam Âu, Úc và New Zealand. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophyllaST. Blake) và Bạch đàn grandis (E. grandis) thuộc chi phụ Symphyomyrtus, họ Sim (Myrtaceae), là những loài cây gỗ lớn, mọc nhanh, được trồng nhiều tại các nước nhiệt đới có nhiệt độ trung bình từ 24 – 280C. Bạch đàn là cây thân gỗ lâu năm, mọc nhanh, cây trồng 5-6 năm tuổi thường có chiều cao trên 7m và đường kính thân khoảng 9- 10cm. Cây Bạch đàn có cơ chế tự bảo vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát triển nhanh nhờ chồi bất định và búp phụ, do đó cây có khẳ năng thích nghi cao với nhiều loại lập địa và khí hậu lại cho năng suất tương đối cao (18-20m3/ha/năm). Trên thế giới Bạch đàn là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích ngày càng được mở rộng. Theo số liệu công bố năm 2009, rừng trồng Bạch đàn năm 2009 đã đạt khoảng 19,5 triệu ha tại 3 châu lục lớn là Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á-Thái Bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5
Dương, Ấn Độ là nước có diện tích rừng trồng Bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2009 ước tính có khoảng 3,9 triệu ha (Nguồn www.git-forestry.com). Ở Việt Nam, cây Bạch đàn được người Pháp đưa vào gây trồng từ trước năm 1945, song việc gây trồng Bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ được bắt đầu từ năm 1960 (Bùi Thị Huế). Trong một thời gian ngắn, cây Bạch đàn đã phát triển mạnh mẽ và trở thành một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng rừng quan trọng của nước ta hiện nay. Bạch đàn là nhóm cây được trồng rộng rãi ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh miền Trung và miền Nam. Đây cũng là cây trồng chủ yếu trên các đường nông thôn, các bờ vùng, bờ thửa ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu và gây trồng nhiều năm qua cho thấy nhiều loài Bạch đàn được nhập vào nước ta chỉ một số loài sinh trưởng nhanh và có khả năng thích ứng lớn. Trong đó, đáng chú ý là các loài Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch đàn tere (E. tereticornis) và Bạch đàn trắng (E. camaldulensis), Bạch đàn liễu (E. exserta). Ở những nơi thấp Bạch đàn urô (E. urophylla) có thể mọc lẫn với Bạch đàn trắng (E. alba) (Martin and Cossalater, 1975 - 1976). Bạch đàn urô là cây thích hợp với các lập địa có vùng đất sâu ẩm ở các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng trung tâm miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Lê Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một trong những xuất xứ có triển vọng nhất ở Mang Linh và Hang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 1996; Phạm Văn Tuấn và cs, 2000) [7][14]. Bạch đàn urô là một trong những loài Bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam (Nguyễn Đức Kiên, 2009). Tác giả đã chỉ ra rằng các tính trạng sinh trưởng và chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu xuất bột giấy cho ngành công nghiệp. Các nghiên cứu đánh giá về sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin (Santos, 1990; Wei và Borralho, 1998a; Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các chương trình chọn giống Bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng sinh trưởng, tuy nhiên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6
ở các vùng sinh thái suy thoái, nghèo chất dinh dưỡng, tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn vẫn tồn tại ở dạng sinh trưởng chậm so với nhiều nước khác. Do vậy, các định hướng nghiên cứu làm tăng hiệu suất bột giấy và tăng khả năng sinh trưởng của cây Bạch đàn tại các vùng sinh thái suy thoái và nghèo chất dinh dưỡng tại Việt Nam đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Bạch đàn lai được đánh giá có ưu thế lai và sinh trưởng tốt hơn bố mẹ của chúng (Lê Đình Khả và cs, 1993) [6]. Một số giống Bạch đàn lai có năng suất cao đã được chọn và gây trồng rất thành công ở một số nước như Brasil và Công Gô. Tại đây, trên những lập địa tốt và áp dụng kỹ thuật trồng thâm canh có thể đạt năng suất 40 - 80m3/ha/năm. Trung Quốc và Philippin cũng tạo được một số giống Bạch đàn lai có năng suất cao và đang được trồng làm nguyên liệu giấy. 1.2.Tình hình trồng và sinh trưởng Bạch đàn lai ở Việt Nam Bạch đàn là một trong những nhóm cây đang được gây trồng rộng rãi ở nước ta. Hiện nay Bạch đàn được coi là cây nguyên liệu giấy chủ yếu ở vùng trung tâm miền Bắc. Các nghiên cứu trong nước về lai giống và sử dụng giống lai đang là hướng đi được nhiều nhà chọn giống quan tâm. Nghiên cứu về giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) với Bạch đàn đỏ (E. robusta) cho thấy giống lai có năng suất cao hơn rất nhiều so với giống bố mẹ (Lê Đình Khả, 1970) [5]. Từ năm 1994, những nghiên cứu về lai nhân tạo cho một số loài Bạch đàn đã được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng và đã tạo được hàng chục tổ hợp lai thuận nghịch trong loài và khác loài ở 3 loài Bạch đàn chính của nước ta là Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E. exserta). Qua khảo nghiệm đã chọn được 31 cây trội trong 8 tổ hợp lai Bạch đàn có năng suất cao hơn giống sản xuất tốt nhất trên 30%. Những giống này đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật và cho phép triển khai khảo nghiệm trên các vùng sinh thái khác nhau. Nghiên cứu lai giống Bạch đàn cũng cho thấy một số tổ hợp lai có hiệu suất bột giấy cao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7
hơn, trong lúc độ bền của giấy tương đương với các loài bố mẹ (Lê Đình Khả và Nguyễn Việt Cường, 2001) [4]. Ở Việt Nam từ các năm 1996 – 2000, Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tạo được gần 80 tổ hợp lai trong loài và lai khác loài giữa các loài Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla), Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E.exserta). Giai đoạn 2001-2010 nghiên cứu lai giống cho các loài bạch đàn đã tạo được trên 100 tổ hợp lai đôi, ba cho các loài cho 7 loài bạch đàn là Bạch đàn urô, Bạch đàn tere (E.tereticornis), Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) , Bạch đàn grandis (E. grandis), Bạch đàn saligna (E. saligna), Bạch đàn microcorys (E.microcorys), Bạch đàn pellita (E.pellita). Sau 2 năm tại đất đồi trọc nghèo dinh dưỡng ở Cẩm Quỳ- Ba Vì- Hà Nội, năng suất của các tổ hợp lai P18U29 đạt 17,3dm3/cây vượt mẹ (P18) là 316%, vượt bố của chúng (U29) là 363% về thể tích, còn vượt giống lai đối chứng nhập từ Brasin GU8 là 160%. Tổ hợp lai U29S6 có thể tích thân cây đạt 16,62dm3/cây vượt thể tích của mẹ (U29) là 349% và vượt giống lai đối chứng GU8 là 153%. Tại hiện trường Minh Đức- Bình Phước sau 2 năm tổ hợp lai T1P17, C18P17, P18U29C3, P18U29 và C9G15 đạt thể tích thân cây tương ứng là 26,1; 26,1; 22,8; 21,8 và 21 dm3/cây vượt giống đối chứng PN14 tương ứng là 383%, 384%, 335%, 321% và 309% về thể tích (Nguyễn Việt Cường. 2006) [13]. Qua khảo nghiệm cũng đã chọn được 30 dòng bạch đàn lai có sinh trưởng nhanh hơn các giống đối chứng PN2, PN14, U6 và GU8 ở hầu hết các điểm khảo nghiệm và có thể tích thân cây vượt hơn giống đối chứng từ 110% đến 300% ở năm thứ 3. Một nghiên cứu khảo nghiệm giống Bạch đàn lai tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy trong các dòng lai được chọn lọc có một số dòng sinh trưởng vượt trội so với dòng kiểm chứng U6, GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc biệt là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8
dòng lai UE24, UE83, UE5. Những dòng này có chỉ số thể tích bằng 70,4-73,9; trong khi đó dòng GU8 có chỉ số thể tích là 50,3. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9
Trong một vài năm gần đây công ty trồng rừng Innov Green Quảng Ninh đã tiến hành trồng rừng các giống Bạch đàn lai nhập từ Trung Quốc (giống lai giữa Bạch đàn urô x grandis, Bạch đàn urô x tere, với tên gọi là Bạch đàn cự vĩ và vĩ hệ) với diện tích vài trăm ha ở Quảng Ninh. Bạch đàn lai này có sinh trưởng nhanh hơn Bạch đàn U6 (Bảng 1.1) Bảng 1.1. Sinh trưởng dòng Bạch đàn lai cự vĩ và vĩ hệ ở Quảng Ninh (2007-2009) Kí hiệu IG01 IG02 IG03 IG04 U6 Tên KH UxG GxU UxG UxT Uro (BĐ cự vĩ) (BĐ cự vĩ) (BĐ cự vĩ) (BĐ vĩ hệ) Nơi trồng Xã Quảng Xã Quảng Xã Quảng Xã Quảng Xã Quảng ( 2007 và Sơn Huyện Sơn Huyện Sơn Huyện Sơn Huyện Sơn Huyện 2008) Hải Hà- QN Hải Hà- QN Hải Hà- QN Hải Hà- QN Hải Hà- QN D.tích (ha) 246 1,2 1,7 1 3,6 Mật độ 1500 1500 1500 1500 1500 D13 (m) 10,4 9,3 7,9 9,8 7,7 Hvn (m) 12,5 12,1 9,0 12,8 7,6 (Nguồn: Innov Green Quảng Ninh) [12]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10
1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật 1.3.1 Khái niệm chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật,..) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2005) [10]. Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳ ng đinh ̣ tính khách quan tự nhiên của vâ ̣t chấ t di truyề n: khả năng mã hóa cho các tin ́ h tra ̣ng nhấ t đinh, ̣ khả năng phiên ma,̃ dich ̣ mã và khả năng di truyề n. Thông qua chuyể n gen, cách nhà sinh lý, hóa sinh và di truyề n có thể nghiên cứu các quá trin ̀ h điề u khiể n, thể hiê ̣n và ảnh hưởng của các yế u tố di truyề n và ngoa ̣i cảnh lên hoa ̣t đô ̣ng của gen. Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp. Phương pháp chuyển gen trực tiếp - Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện - Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm - Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn - Chuyển gen nhờ súng bắn gen - Chuyển gen nhờ silicon carbide Phương pháp chuyển gen gián tiếp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11
- Chuyển gen nhờ virus - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn). Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững hiệu quả chuyển gen cao; tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện; không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trông có nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự "nhiễu gen" và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây... Đặc biệt là khi nhược điểm của A. tumefaciens chỉ chuyển gen trên cây Hai lá mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và được ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới. * Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 12
A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi đó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất như: nopaline, octopine gọi chung là opine. Các chất này không hề có trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhận này có bản chất là vật chất di truyền. Hình 1.1. Sơ đồ Ti-Plasmit (Nguồn: http://www.wikipedia.org) Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti-plasmit có trong vi khuẩn A.tumerfaciens. Đây là một plasmit được cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có kích thước 200kb, có khả năng tái bản độc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 13
Trên Ti-plasmit có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotit tương tự nhau. T-DNA là đoạn nucleotit có kích thước 25kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), mã hóa cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ 2 liên quan tới tổng hợp opine. Đoạn này được gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể và gây ra bệnh u. Trên Ti- plasmit còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hóa opine (Hình 1.1). Khi cây bị nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmit. * Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất độc vết thương có bản chất phenol: Cetosyringone và Hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng Vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt đứt bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với genom cây chủ. Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.tumefaciens sang tế bào cây chủ được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F (hình 1.4). Các gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hóa học Acetosyringone (AS). Tín hiệu hóa học được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết thương trên cây. Protein vir A tự photphoryl hóa đồng thời làm cho protein vir G được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 14
photphoryl hóa (Jin và cs., 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H (Ziemienowcz, 2001). Hình 1.2. Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật Tiếp đó các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng sợi T-DNA, protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5' của bờ phải và 3' của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs,. 1998). Đồng thời thực hiện chức năng này có các protein vir C1, vir C2 có tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA. Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Vir B có chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 15
protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T- DNA (Zhu và cs, 2000). Như vậy thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên. 1.3.2. Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen Đến nay trên thế giới, phương pháp chuyển gen vào Bạch đàn phổ biến nhất được sử dụng là chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (Chirqui và cs, 1992; Spokevicius và cs, 2005; Mullins và cs, 1997; Machado và cs, 1997; Spokevicius, 2005).. Các phương pháp khác có được thử nghiệm nhưng rất hạn chế: Chuyển qua xung điện (Teuliers và cs, 1991; Manders và cs, 1992), súng bắn gen (Serrano và cs,1996; Sartoretto và cs, 2002), siêu âm (Tournier và cs, 2003) [45]. Đối với Bạch đàn, một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin, cellulose, tính chất gỗ cũng đã được xác định cho các loài Bạch đàn E.globulus (Poke và cs, 2003) [36]; E. gunnii (Lauvergeat và cs, 2002); E. camaldulensis (Ho và cs, 2002) [26]; E. grandis (Ranik và Myburg, 2006). Các gen liên quan đến tăng khả năng hấp thụ lân cũng đã được phân lập từ Bạch đàn trắng (E. camaldulensis), trong số 5 gen được phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và giàu lân (Koyama và cs, 2006). Các gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulose (cellulose synthase CesA gene) đã được phân lập và nghiên cứu (Myburg và cs, 2008). Bảy gen mã hóa sinh tổng hợp cellulose đã được phân lập từ Bạch đàn grandis các gen này được cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất cellulose về chất lượng cũng như độ dài sợi gỗ. Chuyển gen Bạch đàn đã được thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài Bạch đàn như E. gunnii, E. globus, E. camaldulensis, E. nitens vv. (Girijashankar, 2011) và chủ yếu tập trung cho các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 16
lượng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh, nhiễm mặn…) và sâu bệnh hại. Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng Bạch đàn urô và các loài lai của nó đã được công bố trên thế giới. Năm 2002, Shao và cs đã công bố kết quả chuyển gen trên đối tượng E.urophylla thu được dòng kháng Pseudomonas solanasearum tăng 35% [41]. Năm 2003, Tounier và cs đã thu được 9 dòng E.grandis x E.urophylla giảm hoạt tính của CAD từ 69 – 78%, từ đó làm giảm quá trình sinh tổng hợp lignin. Một nghiên cứu khác của Kwasu và cs được tiến hành vào năm 2003 trên đối tượng E.grandis x E.urophyllac thử nghiệm chuyển gen mtCS từ Cà rốt đã thu được những dòng chuyển gen thích ứng được với điều kiện đất bị chua do cải thiện kênh dẫn truyền photphat vô cơ trên loại lập địa này. Năm 2003- 2004, Shani và cs đã đã tạo thành công 25 dòng cây Bạch đàn camal và grandis chuyển gen Cbd và cel1 là 2 gen mã hoá cho cellulose trong chu trình sinh tổng hợp cellulose. Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 gen này biểu hiện hoạt động mạnh hơn và dẫn đến việc phân chia tế bào trong cây nhanh hơn và các thành tế bào được kéo dài hơn. Họ tiến hành chuyển gen này vào E. camaldulensis, E. grandis và các dòng lai của nó. Để tăng cường cho Bạch đàn chống chịu với các điều kiện bất lợi như khả năng chịu lạnh, mặn, chua, khô hạn. Năm 2003, Yamada- Watanabe và cs đã chuyển gen chịu mặn cod A từ Arthrobacter globiformis vào Bạch đàn. Công ty giấy Nhật Bản Oji paper đã chuyển gen ti thể citrate synthetase vào Bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla nhằm tăng cường khả năng hấp thu phosphate vô cơ trong môi trường đất chua. Theo Kondo và cs, 2003 [31]; Ishige và cs, 2004 đã chuyển gen dreb1 vào Bạch đàn nhằm tăng khả năng chịu hạn hán cũng như chịu mặn. Tại Việt Nam, nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen vẫn còn khá mới mẻ và phát triển chậm. Một số thử nghiệm bước đầu đang được tiến hành, tuy nhiên tính cho đến nay vẫn chưa có kết quả nào được công bố. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 17
1.4. Gen mục tiêu EcHB1 1.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật Nhân tố phiên mã (transcription factors) là những protein được gắn vào điểm đặc biệt của trình tự ADN và kiểm soát sự phiên mã của gen. Nhân tố phiên mã thực hiện chức năng của mình bằng cách tăng cường hoạt hóa hoặc kìm hãm tốc độ phiên mã của RNA tại vùng bắt đầu phiên mã của gen (Ruan, 2013) [38]. Nhân tố phiên mã có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phá triển của sinh vật vì nó đảm bảo các gen được biểu hiện trong tế bào vào đúng thời điểm và đúng số lượng trong cơ thể sinh vật. Nó có vai trò trong việc bật/tắt sự phiên mã của các gen thích hợp để làm thay đổi quá trình trao đổi chất trong sinh vật, quá trình biệt hóa tế bào vv. Đã có 53.319 nhân tố phiên mã thuộc 58 nhóm (family) được tìm thấy ở 49 loài thực vật, trong đó gồm 9 loài tảo, 1 loài rêu, 3 loài cây hạt trần và 35 loài cây hạt kín (Zhang và cs, 2011) [48]. Protein HD-Zip là nhân tố phiên mã có trong các loài thực vật. HD-Zip có cấu tạo gồm miền ADN có chức năng liên kết chặt chẽ với motif khóa kéo leucine (leucine zipper motif) trong việc hình thành dimmer. Hai chuỗi polypeptide ở khóa kéo leucine được giữ với nhau bởi tương tác kỵ nước giữa acid amin leucine và sự lồng vào của 2 vòng xoắn α. Đây là loại homeodomain (miền đồng hình) chỉ có mặt trong thực vật và được coi là gen HD-Zip có nguồn gốc từ thực vật bằng cách trao đổi giữa một gen exon của miền đồng hình với một chuỗi khóa kéo leucine (Schena và Davis, 1994) [40]. Protein HD-Zip bao gồm 4 phân nhóm (từ I đến IV) dựa trên 4 đặc điểm: (1) sự bảo thủ của domain HD-Zip mà xác định vị trí ADN gắn kết, (2) cấu trúc gen, (3) các motif bảo thủ phụ thêm (additional conserved motif) và (4) chức năng (Haake và cs, 2002) [27]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 18
Mỗi một nhân tố phiên mã kiểm soát sự họat động và phát triển của một vùng thực vật đặc biệt. Nhân tố phiên mã ATHB5 thuộc HD-Zip phân nhóm I có chức năng kiểm soát sự hình thành trụ dưới lá mầm và kéo dài rễ sơ cấp (Johannesson và cs, 2001), ATHB2 thuộc HD-ZIP phân nhóm II có chức năng kiểm soát việc kéo dài tế bào liên quan đến chất lượng ánh sáng (Carabelli và cs, 1996), ATHB8 thuộc phân nhóm III có chức năng kiểm soát sự phát triển của tượng tầng trong quá trình biệt hóa tế bào (Baima và cs, 1995), ATHB10/GLABRA 2 thuộc phân nhóm IV có chức năng kiểm soát sự biệt hóa các dạng khác nhau của tế bào trichomes trên lá và thân, và tế bào lông rễ (Di Cristina và cs, 1996) [21]. Nhiều nhân tố phiên mã chỉ hoạt động khi có sự thay đổi của điều kiện sống. Nghiên cứu trên cây Arabidopsis cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CBF/DREB1 chỉ hoạt động trong điều kiện lạnh, nhân tố phiên mã CBF4 hoạt động trong điều kiện hạn và các nhân tố phiên mã này hoạt động để thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu với điều kiện bất lợi này (Haake và cs, 2002) [25]. 1.4.2. Nhân tố phiên mã EcHB1 Năm 2009, Sonoda và cộng sự đã phân tích biểu hiện của các gen nhân tố phiên mã trong mô gỗ Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) bằng kỹ thuật microsarray và đã phân lập được 21 gen nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin và cellulose và các gen này thuộc nhóm HD-Zip phân nhóm II. Gen EcHB1 – nhân tố phiên mã liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ đã được phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) và vai trò của gen này đã được đánh giá thông qua việc phân tích biểu hiện của gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 19
Hình 1.3. Trình tự gen EcHB1 được tách dòng từ Bạch đàn E. Camaldulensis Bằng phương pháp phân tích RT-PCR cho thấy gen EcHB1 này biểu hiện ở thân thành thục 5 tuổi (mature stem) và mô rễ (1 tuổi) của Bạch đàn trắng. Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở Bạch đàn biến nạp gen E. camaldulensis chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin như CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm (Sonoda và cs, 2009) [42]. Điều này cho thấy việc tăng cường hoạt động của gen EcHB1 có ảnh hưởng đến quá trình hình thành xylem trong cây. Gen EcHB1 có trình tự như sau: (GenBank: AB458829.1) 1 atgtgccctatcgattcgggccgctccttcgacacgagccttagtctcggtttaggctgt 61 tatggggatcctgaagatcacgagatcaagatcaagaaaccgctcgcgaagctcagtggt 121 aactccacgtgcctcacgataggcttgcccggcggggaggcgtgcggctgggatccgcg 181 agtggggacgaggtcaggaacatcccgagcaggtcggcatcgtcgttctcaaactcaagc 241 agtgcgaagagggagaaggcggagcaaggagaggaagaagcggttgagagagggacgggc 301 tcgccgagggcgactatcaatatcgaagatgaagatgagttcagccccaggaagaagctc 361 aggctttctaaagcacaaagttccattttggaagagagcttcaaagcgcacacaaccctc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 20