Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên (Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn này có mục tiêu bước đầu nghiên cứu phát triển các chỉ thị sinh học phân tử nhằm đánh giá đa dạng di truyền và đa dạng sinh học, góp phần hỗ trợ cho việc định loài một số mẫu hải miên thu thập được ở tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên (Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị

Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên (Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị LÊ THÀNH LONG
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Mỹ Linh, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. Phan Minh Tuấn và các cán bộ Phòng Phát triển Công nghệ y sinh, Trung tâm Phát triển công nghệ cao, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã t ận tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ Phòng tài nguyên sinh vật và Phòng nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thu thập số liệu và vật liệu nghiên cứu để thực hiện luận án. Nhân dịp này tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô, bạn bè và gia đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày tháng 1 năm 2016 Học viên Lê Thành Long
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3 1.1 Giới thiệu chung về hải miên ............................................................................... 3 1.2 Đặc điểm cấu tạo và sinh lý .................................................................................. 4 1.3 Đặc điểm sinh sản và phát triển ............................................................................ 6 1.4 Đa dạng sinh học của hải miên ............................................................................. 6 1.4.1 Hệ thống phân loại hải miên ............................................................................. 6 1.4.2 Tình hình nghiên cứu về đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại của hải miên ............................................................................................................................ 7 1.5 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng sinh học.............................................................. 12 1.6 Các chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng sinh học hải miên.............................. 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16 2.1 Vật liệu ............................................................................................................... 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 16 2.1.2 Hóa chất .......................................................................................................... 16 2.1.2 Trang thiết bị ................................................................................................... 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 18 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu ............................................................... 18 2.2.2 Phương pháp tách DNA tổng số từ hải miên .................................................. 18 2.2.3 Phương pháp PCR ........................................................................................... 19 2.2.4 Phương pháp điện di kiểm tra kết quả ............................................................ 20 2.2.5 Phương pháp xử lý trình tự nucleotide ........................................................... 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 23 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 23 3.2 Kết quả PCR và xác định trình tự các đoạn DNA chỉ thị .................................. 24 3.3 Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu hải miên nghiên cứu ......................... 25 3.4 Cây phát sinh chủng loại .................................................................................... 30 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 32 4.1 Kết luận .............................................................................................................. 32 4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 33 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 36
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU CTAB Cetyl Trimethyl Amoni Bromid DNA Deoxyribonucleic acid rDNA 18S Gen ribosome DNA 18S ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism RNA Ribonucleic acid TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Tm Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperatures) UV Ultraviolet (light)
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh một số đặc điểm cấu tạo giữa các lớp hải miên ........................... 7 Bảng 1.2: Số lượng loài hải miên qua các nghiên cứu tại Việt Nam ....................... 11 Bảng 2.1: Danh sách mẫu hải miên .......................................................................... 16 Bảng 2.2: Danh sách mẫu hải miên .......................................................................... 17 Bảng 2.3: Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl ................................... 19 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR ................................................................ 20 Bảng 2.5: Danh sách trình tự của một số các loài hải miên lưu trữ trên ngân hàng Genbank ................................................................................................................... 21 Bảng 3.1: Độ tương đồng (%) giữa trình tự nucleoitde của các mẫu hải miên nghiên cứu và các trình tự tham khảo tương ứng ................................................................ 25
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ các kiểu cấu tạo cơ thể của hải miên ............................................... 5 Hình 1.2: Sơ đồ Khu vực nghiên cứu tại Đảo Cồn Cỏ ............................................ 12 Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số của mẫu Hải miên .................................... 23 Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu hải miên bằng mồi 18S ........................ 24 Hình 3.3: Trình tự gen 18S mẫu hải miên ................................................................ 27 Hình 3.4: Cây phát sinh chủng loại của 6 mẫu hải miên và các trình tự tham khảo dựa vào đoạn DNA chỉ thị trên rDNA 18S .............................................................. 30
MỞ ĐẦU Ngành Porifera (được Grant phân loại năm 1836), tên thường gọi là hải miên, là một trong những loài động vật biển có độ đa dạng cao nhất đồng thời đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển. Đặc biệt, hải miên được đánh giá là nhóm sinh vật biển chứa nhiều hợp chất mới mang các hoạt tính sinh học liên quan y - dược như chống ung thư, hỗ trợ điều trị thần kinh, tăng khả năng miễn dịch, giảm đau, kháng virus, kháng vi sinh vật, vi khuẩn lao... Việt Nam có nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú, đặc biệt là các loài hải miên. Tuy nhiên, chỉ có một số ít nghiên cứu về hải miên ở biển Việt Nam liên quan tới thành phần loài và phân bố của hải miên tại các vùng biển thuộc vịnh Nha Trang và vịnh Hạ Long. Gần đây, các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài hải miên tại biển Việt Nam đã phân lập được nhiều hợp chất có cấu trúc mới và nhiều hoạt chất có giá trị. Mặc dù vậy, hướng nghiên cứu về hải miên còn khá mới mẻ, đáng chú ý là chưa có nghiên cứu nào ở mức độ sinh học phân tử hay đánh giá đa dạng di truyền đối với hải miên ở biển Việt Nam. Từ trước tới nay, nghiên cứu đa dạng loài hải miên mới dừng ở đa dạng hình thái. Số lượng loài hải miên tại Việt Nam khá nhiều, nhiều loài có hình thái tương đối giống nhau; do vậy, các nghiên cứu đánh giá đa dạng hải miên ở cấp độ sinh học phân tử sẽ góp phần tìm hiểu và phát triển tiềm năng ứng dụng của hải miên. Do đó, vấn đề cấp thiết hiện nay là phải phát huy được những giá trị và tiềm năng ứng dụng của hải miên bằng các nghiên cứu thích hợp và có hệ thống. Khu vực nghiên cứu được lựa chọn là Khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ thuộc tỉnh Quảng Trị. Đây là khu vực biển được đánh giá là một trong những vùng có mức độ đa dạng sinh học biển khá cao ở Việt Nam, trong đó nhóm hải miên xuất hiện phong phú cả về số lượng và thành phần loài. Trên cơ sở đó, luận văn “Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên (Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị” được thực hiện. Luận văn này có mục tiêu bước đầu nghiên cứu phát triển các chỉ thị sinh học phân tử nhằm đánh giá đa dạng di truyền và đa dạng sinh học, góp phần hỗ trợ cho việc định loài một số mẫu hải miên thu thập được ở tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị. 1
Nội dung của luận văn gồm: 1. Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu hải miên nghiên cứu. 2. Tối ưu hóa các điều kiện PCR để nhân dòng các đoạn DNA chỉ thị. 3. Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu hải miên nghiên cứu. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về hải miên Ngành Porifera (được Grant phân loại năm 1836), tên thường được gọi là hải miên hay bọt biển, được tìm thấy trong hầu hết các môi trường nước, tuy nhiên, hải miên sinh sống phổ biến và đa dạng nhất trong môi trường biển. Theo Van Soest và cộng sự, 2016, có 8701 loài hải miên được ghi nhận [20], được phân loại thành 4 lớp, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loại năm 1885) là lớp đa dạng nhất, chiếm 80% số loài hải miên được biết cho tới nay. Hải miên được coi là động vật đa bào chưa hoàn thiện (Parazoa). Hải miên là nhóm động vật sống bám, tuy vậy một số loài có khả năng vận động nhờ vào tế bào chất hay roi. Màu sắc, hình dạng, kích thước cơ thể các loài hải miên rất đa dạng: loài bé nhất khoảng vài milimét, loài lớn nhất có thể tới hàng mét. Hải miên hầu như có mặt trên toàn thế giới, sinh sống trong một loạt các môi trường dưới đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới [11]. Thường hải miên phân bố ở các vùng yên tĩnh, bởi vì trầm tích khuấy động bởi sóng hoặc dòng sẽ chặn các lỗ chân lông, làm cho chúng khó khăn trong việc ăn và thở [7]. Phần lớn hải miên thường được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, nhưng một số loài có thể gắn vào trầm tích mềm mại [9]. Hải miên dồi dào hơn ở vùng biển ôn đới nhưng ít đa dạng hơn so với vùng nhiệt đới, có thể vì các sinh vật con mồi của chúng phong phú ở vùng biển nhiệt đới [11]. Hải miên thuộc lớp Hexactinellida (hải miên thủy tinh) là phổ biến nhất ở vùng biển Bắc cực và các khu vực sâu của vùng biển ôn đới và nhiệt đới cơ thể hải miên thủy tinh rất xốp cho phép trích xuất thực phẩm từ các vùng biển nghèo thức ăn mà không cần phải hoạt động nhiều. Hải miên thuộc lớp Demospongiae và hải miên lớp Calcarea (hải miên đá vôi) phong phú và đa dạng ở các vùng nước có độ sâu ít hơn [14]. 3
1.2 Đặc điểm cấu tạo và sinh lý Hải miên được coi là động vật đa bào chưa hoàn thiện (Parazoa) vì có các đặc điểm sau [3]: - Cơ thể đa bào nhưng chưa có mô phân hóa. Có nhiều lỗ thủng trên thân, trong thân có các khe, rãnh . - Đối xứng phóng xạ hay chưa có kiểu đối xứng ổn định. - Biểu bì có các tế bào gai dẹp, có lớp tế bào cổ áo làm nhiệm vụ dẫn nước vào và đẩy nước ra. - Tầng trung gian khá dày có các tế bào amip và gai xương. Xương là canxi, silic hay sợi collagen (spongin). - Chưa có miệng, tiêu hóa nội bào, bài tiết và hô hấp bằng thẩm thấu. - Chưa có tế bào thần kinh, phản ứng với kích thích theo kiểu cảm ứng. - Sinh sản vô tính bằng chồi hay mầm, sinh sản hữu tính bằng trứng và tinh trùng. Phân hóa các lá phôi chưa ổn định, ấu trùng sống tự do. Các loài hải miên có hình dạng rất phong phú, trường hợp đơn giản nhất là cơ thể có dạng một cái cốc, có đáy bám vào giá thể, đối diện với đáy là lỗ thoát nước (osculum) thành cơ thể có nhiều lỗ thủng thông nước (được gọi là ostium). Nước từ ngoài vào xoang cơ thể qua ostium và thoát ra theo osculum. Nước vào xoang không chỉ theo một ống thẳng mà có thể đi qua nhiều khoang khác nhau có lát cắt tế bào cổ áo. Xoang cơ thể còn được gọi là xoang trung tâm hay xoang vị giả (pseudogastrula). Tùy theo mức độ phức tạp của hệ ống dẫn nước và các phòng roi lát bằng các tế bào cổ áo mà chia thành các kiểu cấu tạo cơ thể hải miên khác nhau [3]. Có 4 kiểu cấu trúc cơ thể: - Kiểu ascon: có rãnh dẫn nước thông trực tiếp với xoang. - Kiểu sycon: nước qua hốc lõm mới vào xoang vị giả. - Kiểu leucon: có hệ thống rãnh và hốc phức tạp. - Kiểu ragon: có hệ thống phức tạp hơn nhiều (ví dụ Leuconic aspera chỉ cao 7cm, dày 1cm nhưng có tới 20.000 khoang và 80.000 rãnh dẫn nước) 4
Hình 1.1: Sơ đồ các kiểu cấu tạo cơ thể của hải miên Các loại tế bào của hải miên bao gồm : Thành cơ thể 2 lớp tế bào, giữa là tầng trung giao (còn gọi là tầng keo – mesohyl). Lớp ngoài là biểu mô dẹp, che chở cho cơ thể. Lớp tế bào trong là tế bào cổ áo có roi (cổ áo của các tế bào cổ áo xem dưới kính hiển vi điện tử thấy đó là vành nguyên sinh chất gồm nhiều que tế bào chất, ken dày với nhau). Roi của tế bào cổ áo hoạt động liên tục để đưa dòng nước vào cơ thể hải miên. Khả năng lọc nước là rất lớn, với 1cm2 có thể lọc được 20 lít nước trong một ngày. Tầng trung giao gồm nhiều loại tế bào: hình sao có chức phận liên kết, gai xương có nhiệm vụ nâng đỡ, amip làm nhiệm vụ thực vào và hình thành các loại tế bào khác khi cần biến đổi. Hoạt động sinh lý nhờ vào tế bào cổ áo tạo dòng nước liên tục mang thức ăn và oxy qua các lỗ và thải ra theo osculum (thức ăn gồm 4/5 là vụn bã hữu cơ, 1/5 là sinh vậy nhỏ). Trong xoang vị giả có các tế bào amip thực bào. Ngoài ra có sự trợ giúp của các vi sợi quanh các lỗ [3]. Bộ khung CaCO3 hay SiO2 hoặc chất hữu cơ (sợi spongin) giống tơ tằm với hàm lượng iôt cao (14%) có thể là nhiều trục hay một trục, xếp riêng lẻ hay từng bó. Sợi spongin do nhiều tế bào hình thành, mỗi tế bào là một đoạn, từ các tấm spongin có thể hủy từng đám tế bào để hình thành nên các lưới sợi. 5
1.3 Đặc điểm sinh sản và phát triển Hải miên có cả 2 hình thức sinh sản vô tính và hữu tính. Đối với sinh sản vô tính, có 3 cách là : phân mảnh, nảy chồi và bằng cách sản xuất gemmules. Những mảnh vỡ của hải miên có thể tách ra bởi các dòng chảy và sóng. Chúng sử dụng các tính di động của pinacocytes, choanocytes và tái định hình của mesohyl lại gắn mình vào một bề mặt phù hợp và sau đó xây dựng lại bản thân như hải miên nhỏ nhưng diễn ra theo một quá trình trong một vài ngày. Một mảnh hải miên chỉ có thể tái sinh nếu nó chứa cả collencytes để sản xuất mesohyl và archeocytes để sản xuất tất cả các loại tế bào khác [21]. Một số rất ít loài sinh sản bằng cách nảy chồi [5]. Phần lớn hải miên lưỡng tính. Tế bào sinh dục được hình thành từ tế bào amip hay tế bào cổ áo. Chúng ở trong tầng trung giao và nằm dưới các phòng roi. Tinh trùng khi chín sẽ lọt vào phòng roi, theo dòng nước ra ngoài tìm cá thể khác để thụ tinh. Sau đó hợp tử phát triển, hình thành phôi nang lưỡng cực (amphiblastula), tức là tế bào phôi ở hai cực khác nhau [3]. Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống ít nhất trong một vài năm, nhưng một số loài sống ở vùng nhiệt đới và cũng có thể ở những đại dương sâu có thể sống 200 năm hoặc hơn. Một số ít bị vôi hóa chỉ tăng 0.2 mm mỗi năm và nếu tỉ lệ đó là hằng số thì vật mẫu có kích thước 1 m phải được khoảng 5000 năm tuổi. Một số loài hải miên bắt đầu sinh sản hữu tính khi chỉ một vài tuần tuổi, trong khi những loài khác chờ đợi cho đến khi vài năm tuổi [21]. 1.4 Đa dạng sinh học của hải miên 1.4.1 Hệ thống phân loại hải miên Hải miên được phân loại theo truyền thống thành ba lớp: lớp Demospongiae, lớp Calcarea (hải miên đá vôi) và lớp Hexactinellida (hải miên thủy tinh). Các nghiên cứu phát sinh chủng loại gần đây đã chỉ ra rằng trong lớp Demospongiae có sự phân biệt về phát sinh loài nên người ta chia lớp này thành Demospongiae và Homoscleromorpha. Hiện nay, Homoscleromorpha đã được các nhà khoa học công nhận là lớp thứ tư của hải miên [5] [20]. 6
Trong bảng thống kê hải miên (Catalogue of Life, http://www.catalogueoflife.org/col/browse/classification/name/Porifera) xác định lớp Calcarea có 715 loài (81 giống, 24 họ, 5 bộ); lớp Demospongiae có 7260 loài (916 giống, 99 họ, 23 bộ); lớp Hexactinellida có 618 loài (194 giống, 20 họ, 5 bộ); lớp Homoscleromorpha có 103 loài (8 giống, 2 họ, 1 bộ). Bảng 1.1: So sánh một số đặc điểm cấu tạo giữa các lớp hải miên Calcarea Hexactinellida Demospongiae Homoscleromorpha Loại tế Nhân đơn, Lớp tế bào Nhân đơn, Nhân đơn, màng đơn bào màng đơn ngoài là hợp màng đơn bên bên ngoài bên ngoài bào ngoài Gai CaCO3 (Có Silica Silica Silica 1,3 hay 4 (6 tia) (có 1 hay 4 (4 tia) trục) trục) Sợi Không có Không có Ở nhiều loài Ở nhiều loài Spongin Bộ khung Được làm ngoài bằng Không có Ở một số loài Không có CaCO3 nếu có Hình Asconoid, Syconoid, Sylleibid hoặc dáng cơ syconoid, Leuconoid Leuconoid leuconoid thể leuconoid 1.4.2 Tình hình nghiên cứu về đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại của hải miên  Các nghiên cứu ngoài nước: Theo World Porifera Database (2016), có hơn 8700 loài hải miên được ghi nhận, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loại năm 1885) là lớp đa dạng 7
nhất, chiếm tới 80% số loài hải miên được biết cho tới nay. Nhiề u loài hải miên trên thế giới còn chưa được phát hiện và thống kê do các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung ở một số vùng biển lớn như khu vực biển Caribbean, Địa Trung Hải và Châu Úc trong khi rất nhiều vùng biển khác như khu vực đông nam Thái Bình Dương, vùng biển Đông Nam Á...vẫn chưa được khảo sát đầy đủ. Các công trình mô tả đầu tiên về hải miên ở biển Đông được thực hiện vào những năm cuối của thế kỷ 18 và giữa thế kỷ 19 từ các bộ sưu tập của các nhà buôn châu Âu và một số điều tra khoa học khởi thủy. Cho đến gần đây, có khoảng 1500 loài hải miên đã được xác định ở khu vực biển Đông. Tuy nhiên, còn nhiều loài chưa được phát hiện và định loại một cách rõ ràng [21]. Việc đặt Porifera vào đúng vị trí trong cây phát sinh chủng loại của các cơ thể đa bào nói chung và động vật đa bào nói riêng là quá trình nghiên cứu lâu dài và khó khăn. Nhóm sinh vật này lúc đầu được xếp vào nhóm thực vật-động vật và sau đó thuộc Zoophyta hoặc Mesozoa và cuối cùng Parazoa. Chỉ sau khi kỹ thuật sinh học phân tử phát triển thì mới có thể đặt nhóm có đặc điểm hình thái thuộc nhóm Porifera trở thành một giới duy nhất: Metazoa. Những bằng chứng đầu tiên là việc phát hiện và tách được những phân tử gắn kết tế bào-tế bào và mạng lưới tế bào ở trong hải miên. Các phân tử này có độ tương đồng cao về trình tự và có chức năng tương tự với các phân tử tương đương ở metazoan. Phần lớn nghiên cứu hải miên dựa vào hệ thống phân loại truyền thống theo đặc điểm hình thái bộ khung (skeleton) của hải miên trên cơ sở các công trình được xuất bản từ những thế kỷ trước [5]. Trong một số công trình gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã kết hợp các đặc điểm sinh học khác vào hệ thống phân loại hải miên như các chỉ thị sinh học phân tử, hóa sinh…trong đó các chỉ thị phân tử đã có đóng góp quan trọng trong việc phát hiện những loài mới, loài khó phân biệt về hình thái cũng như làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại ở hải miên [20]. Những công bố khoa học về đa dạng của sinh vật biển trong một vài thập kỷ qua cho thấy đa dạng sinh học biển, trong đó có hải miên chưa được đánh giá đúng ở tất cả các cấp độ từ di truyền, loài, hệ sinh thái và quy mô (không gian và thời gian). Hàng loạt các marker phân tử đã được dùng ở các mức độ khác nhau để giải 8
quyết quá trình phát sinh chủng loại của Porifera. Adams và cộng sự (1999) sử dùng trình tự gen 18S rRNA để nghiên cứu mối quan hệ trong họ Porifera và tìm thấy bằng chứng Demospongiae/Hexactinellida hình thành một nhóm riêng biệt và Calcarea không thuộc vào nhóm này mà họp thành một nhánh với bộ Ctenophora. McInerney và cộng sự (1999) xem xét tiềm năng của gen 18S và 28S rRNA khi nghiên cứu bộ Astrophorida và phát hiện ra rằng vùng 700 bp ở đầu 5’ của 28S rRNA có tiềm năng phân biệt ở mức độ họ và loài của nhóm này, trong khi đoạn gen 18S rRNA dài 1300 bp lại có mức độ đa dạng thấp . Alvarez và cộng sự (2000) phân tích mối quan hệ họ hàng của họ Axinellidae sử dụng một phần trình tự gen 28S rRNA và số liệu về hình thái và thấy rằng các loài trong họ Axinellidae đều có cùng nguồn gốc (monophyly) theo số liệu hình thái và paraphyly theo số liệu phân tử. Borchiellini và cộng sự (2001) đã cố gắng giải quyết trả lời câu hỏi là Porifera là mono- hay là paraphyly sử dụng trình tự đầy đủ của gen 18S rDNA và chỉ ra rằng Porifera là paraphyly. Vùng nối thứ nhất và thứ hai (internal transcribed spacer, ITS-1 và ITS-2) giữa các gen 18S, 5,8 S và 28S ribosome RNA cũng đã được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các loài [22][6][16]. Ở các loài động vật không xương sống khác gen 12S rDNA cũng như 16S rDNA của ty thể đã được sử dụng phân tích đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại [8]. Tiểu đơn vị cytochrome c oxidase I (COI) cũng đã được sử dụng làm marker phân tử cho nhiều loài khác nhau từ động vật bậc thấp đến cao [17].  Trong nước: Những nghiên cứu về hải miên ở biển Việt nam còn rất ít. Một vài công trình được công bố như nghiên cứu của Lindgren, phát hiện của Dawydoff (trích dẫn bởi Azzini và cộng sự, 2007), và những nghiên cứu trên bộ sưu tập hải miên ở Nha Trang của Lévi (1961) và gần đây là công trình về nghiên cứu về hải miên “boring sponges" [13]. Trong bảng thống kê hải miên ở biển Đông, Hooper và cộng sự (2000) [12] xác định có khoảng 176 loài hải miên thuộc lớp Demospongiae trong đó có 129 loài (được xác định ở mức độ loài) ở bờ biển của Việt Nam. Azzini và cộng sự, (2007) [16] phát hiện tổng số có 63 loài Demosponge ở các đảo của Vịnh Hạ Long. Trong số đó, có 36 loài được xác định loài hoàn chỉnh và 23/36 loài lần 9
đầu tiên phát hiện có mặt ở bờ biển Việt nam. Dựa trên cơ sở các tài liệu đã công bố từ năm 1952 đến nay, Thái Quang Minh (2013) [18], đã thống kê tổng cộng 299 loài (124 giống, 65 họ, 18 bộ và 4 lớp) được ghi nhận có mặt tại Việt Nam, chủ yếu khảo sát ở khu vực biển Vịnh Hạ Long và Vịnh Nha Trang. Lớp Demospongiae chiếm 94% với 281 loài (46 họ, 12 bộ). Trong số này, chỉ có 181 loài được xác định tên khoa học đầy đủ, các loài còn lại chỉ được xác định ở mức độ trên loài (giống, họ), cần có thêm phân tích về hình thái hoặc kết hợp với các chỉ thị khác như hóa học, sinh học phân tử [18]. Các loài hải miên thường gặp ở biển Việt Nam thuộc lớp Demospongiae với 12 họ sau: Niphatidae, Halichondriidae, Desmacellidae, Microcionidae, Axinellidae, Chalinidae, Ianthellidae, Irciniidae, Mycalidae, Petrosiidae, Spongiidae, Thorectidae. Đáng chú ý là các công bố về hải miên ở Việt Nam đều tập trung vào hải miên thu thập ở các rạn san hô và đảo thuộc vịnh Nha Trang (miền Nam Việt Nam) và vịnh Hạ Long (miền Bắc Việt Nam) mà chưa có công bố mang tính hệ thống về thành phần các loài hải miên ở khu vực biển miền Trung Việt Nam. Trên thực tế, các nhà khoa học ước tính còn nhiều loài hải miên ở Việt Nam chưa được phát hiện và định loại một cách rõ ràng. Các đợt điều tra khảo sát sinh vật biển trong những năm gần đây của các nhà khoa học thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển và Viện Hải dương học tại một số vùng biển như đảo Cát Bà, Côn Đảo, Trường Sa, vịnh Hạ Long...) cho thấy hải miên xuất hiện khá đa dạng về thành phần loài và có trữ lượng lớn. Chẳng hạn như, 6 loài hải miên (Gellius varius, Dysidea cinerea, Haliclona subarmigera, Mycale plumosa, Ircinia echinata, Amorphinopsis excavans) được phát hiện ở khu vực đông nam đảo Cát Bà; 5 loài (Clathria vulpine, Petrosia nigricans, Xestospongia testudinaria, Stylissa flabelliformis, Gellius var fibrosa) được xác định ở vùng biển quanh đảo Côn Đảo và 3 loài (Petrosia nigricans, Ianthella basta, Xestospongia testudinaria) ở vùng biển đảo Trường Sa. Các loài này thường phân bố chủ yếu trong các rạn san hô, vùng ven biển và xung quanh các đảo vùng biển Việt Nam. 10
Bảng 1.2: Số lượng loài hải miên qua các nghiên cứu tại Việt Nam Tác giả Địa điểm Loài Loài (được thống kê) (được mô tả cụ thể) Lindgren (1898) Nha Trang 20 Lévi (1961) Nha Trang 28 24 Tran Ngoc Loi, Nha Trang 6 Tran Dinh Nam (1965) Nguyen Van Chung Việt Nam 160 142 và cộng sự (1978) Hooper và cộng sự Việt Nam 176 129 (2000) Chervyakova Nha Trang 89 (2007) Pansinie và cộng sự Hạ Long 63 (demosponge) (2007) Azzini và cộng sự Vịnh Hạ 63 (demosponge) 23*/36 (2007) Long Thái Quang Minh Việt Nam 299 (2013) Chú thích: * : Loài lần đầu tiên phát hiện ở Việt Nam 1.4.3 Giới thiệu về Khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ. Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị là Khu bảo tồn biển thứ 4 của Việt Nam, có tổng diện tích 4.532 ha, được chia thành 3 phân khu: phân khu bảo vệ nghiêm ngặt, phân khu phục hồi sinh thái và phân khu phát triển. Toàn bộ khu vực này có hệ sinh vật biển vô cùng phong phú, dồi dào cả về trữ lượng và thành phần loài sinh vật, đặc biệt là các loài hải miên. Các nghiên cứu về hải miên ở Đảo Cồn Cỏ bước đầu đã thu thập được một số mẫu hải miên như: Xestospongia testudinaria, Niphates 11
sp., Spongia sp., Stylissa flabelliformis …. Việc nghiên cứu tính đa dạng sinh học và đánh giá đa dạng di truyền của các loài hải miên thuộc Khu bảo tồn biển Đảo Cồn Cỏ có ý nghĩa quan trọng, sẽ góp phần nâng cao giá trị đa dạng sinh học của các loài hải miên ở Việt Nam. Hình 1.2: Sơ đồ Khu vực nghiên cứu tại Đảo Cồn Cỏ 1.5 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng sinh học Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống, loài và quần thể, tính biến động di truyền giữa chúng trong các quần xã và hệ sinh thái. Đa dạng sinh học được thể hiện ở ba cấp độ: đa dạng di truyền, đa dạng về loài và đa dạng về hệ sinh thái [1]. Đa dạng di truyền được cho là sự khác biệt của các đặc tính di truyền giữa các quần thể và giữa các cá thể trong một loài hay một quần thể. Đa dạng loài chỉ mức độ phong phú về số lượng loài hoặc loài phụ trên quả đất, ở một vùng địa lý, trong một quốc gia hay trong một sinh cảnh nào đó [1]. Đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa hết sức quan trọng đối với nghiên cứu sinh học và phát triển bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các 12
nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ quá trình chọn tạo giống. Nghiên cứu đa dạng sinh học đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều cách tiếp cận khác nhau chẳng hạn như thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt (đa hình) trong DNA (chỉ thị DNA). Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu - nhược điểm , lựa chọn chỉ thị đánh giá phụ thuộc vào mục đích của từng nghiên cứu.  Chỉ thị hình thái: Nghiên cứu đa dạng sinh học dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận). Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như quy trình phức tạp. Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái có những hạn chế như số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, sự tác động của môi trường, phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; mang tính chất thống kê nên cần thực hiện với số lượng lớn, có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình để có thể đánh giá được [2].  Chỉ thị sinh hóa: Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện gen ở sinh vật. Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có thể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác nhau. Bush và cộng sự, (1978) khẳng định điện di protein là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài và phân loại sinh vật. Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉ thị isozyme và các loại protein dự trữ. Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao. Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế. [2]  Chỉ thị phân tử DNA 13
Từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước, các kỹ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu và phát triển nhanh chóng trở thành lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. Các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn lọc. Các chỉ thị DNA được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA cho nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác định gen. Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Các chỉ thị này đã được ứng dụng và mang lại những kết quả đáng tin cậy, có giá trị không chỉ với nghiên cứu đa dạng di truyền mà còn với nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học khác. Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính: i) Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP và ii) Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR,...). 1.6 Các chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng sinh học hải miên Porifera là một trong số những động vật nguyên sinh khó xác định. Hầu hết các loài hải miên không có cuống, phát triển trên nền cứng và sống ở đó trong suốt cuộc đời, điều này lý giải tại sao các nhà nghiên cứu lúc đầu xem hải miên giống thực vật hơn so với động vật. Mặc dù cấu trúc đơn giản nhưng hải miên rất đa dạng về hình dạng và kích thước, tùy thuộc vào hình dạng và thành phần của bộ khung (skeleton) tạo thành từ các tế bào và mạng lưới collagen. Hiện nay, nhiều vấn đề về sinh học của hải miên vẫn chưa được tìm hiểu rõ, như sự phát sinh chủng loại và tiến hóa, quá trình phát triển và sinh sản, cơ chế phân tử của quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, đáp ứng với biến đổi của môi trường... Nhiều chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) đã được sử dụng ở các mức độ khác nhau để tìm hiểu quá trình phát sinh chủng loại của hải miên, nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các loài hay [19][15] [10]. Có thể liệt kê 3 nhóm chỉ thị phân tử như sau: 14