Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:88

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào cây dòng ngô K7 để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT PHẠM THỊ HẰNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. HUỲNH THỊ THU HUỆ Hà Nội - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Hằng i
LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Huỳnh Thị Thu Huệ - Phó trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Luận văn này được thực hiện tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp nhà nước: “Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen” giai đoạn 2014-2018 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng như những góp ý quý báu trong quá trình tôi thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Hằng ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ABF ABRE binding factor ABRE AB -responsive element AP2/EREBP APETALA2/ethylene responsive element binding protein AREB ABA responsive element binding protein AS Acetosyringone bZIP basic leucine zipper CaMV Cauliflower mosaic virus CBF CRT binding factor CBU Crop Biotech Update cDNA Complementary DNA CDPK Calcium-dependent protein kinase CDS Coding DNA sequence CRT C-Repeat CSP Cold shock protein CUC2 Cupshaped cotyledon 2 CYP Cyclophilin DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DRE Dehydration responsive element DREB Dehydration responsive element binding iii
DST Drought and Salt Tolerance EAR ERF-associated amphiphilic repression EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ERD1 Early responsive to dehydration ERF Ethylene responsive e blement EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organization FAS-USDA Foreign Agricultural Service-United States Department of Agriculture HSP Heat Shock Protein LB Lysogeny broth LEA Late embryogenesis abundant MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight MCS Multiple cloning site mRNA Messenger RNA NAC NAM, ATAF1,2, CUC2 NACRS NAC recognition sequence NAM No apical meristem NF-Y Nuclear factor Y PCR Polymerase Chain Reaction PIS Phosphatidylinositol synthase PKC Protein kinase C PTMs Post translation modifications iv
RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction sHSP Small heat shock protein TF Transcription factor WFP World Food Programme WMO World Meteorological Organization ZAT Zinc transporter ZFP Zinc ﬁnger protein v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 – 14 2016/2017 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 21 - 22 Bảng 2.2 Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 22 - 23 Bảng 3.1 Kết quả biến nạp gen ZmbZIP72 57 Bảng 3.2 Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbIP72 thu được 58 vi
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 2.1 Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72 29 Hình 3.1 Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn 38 nhân tạo Hình 3.2 Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA 39 Hình 3.3 Kết quả RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 40 Hình 3.4 Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72 41 Hình 3.5 Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72 42 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống Tẻ 43 vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu Hình 3.7 So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen 44 ZmbZIP72 giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu Hình 3.8 Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R 45 Hình 3.9 Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2 46 Hình 3.10 Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72 47 Hình 3.11 Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII 47 Hình 3.12 Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI 48 và HindIII Hình 3.13 Chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72 50 Hình 3.14 Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme 51 HindIII Hình 3.15 Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII 51 Hình 3.16 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid 53 Hình 3.17 Minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh cây ngô chuyển gen 56 Hình 3.18 DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72 60 thế hệ T0 vii
Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển 61 gen T0 Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0 62 viii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. iii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3 1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , .........................................3 1.1.1. Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật ......3 1.1.3.1. Các gen mã hoá protein chức năng ..........................................................5 1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện ..................................................6 1.1.3.3. Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã ...........................................7 1.2. Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực vật .....................................................................................................................10 1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72 ..................................................12 1.4. Cây ngô và vấn đề chịu hạn ..........................................................................14 1.5. Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen ........................................................17 1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21 2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu....................................................................21 2.1.1. Mẫu thực vật ............................................................................................21 2.1.2. Các vật liệu khác ......................................................................................21 2.1.3. Hoá chất ....................................................................................................21 2.1.4. Thiết bị nghiên cứu ..................................................................................23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................24 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ thực vật .......................................................24 2.2.2. Tách chiết RNA tổng số từ thực vật .......................................................25 2.2.3. Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..........................................................26 2.2.4. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR..........................................26 ix
2.2.5. Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose .............................................27 2.2.6. Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 .28 2.2.7. Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A. tumefaciens .................................................................................................................30 2.2.8. Tách chiết và tinh sạch plasmid..............................................................32 2.2.9. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn .............................33 2.2.10. Điện di trên gel agarose ...........................................................................33 2.2.11. Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens .............................35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37 3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ .............................................37 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô ............................................37 3.1.2. Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..................................................................38 3.1.3. RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 .................................................................39 3.1.4. Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2 ....................................40 3.1.5. Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 .....................................42 3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 ...................................44 3.2.1. PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI ...........44 3.2.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 ..................................46 3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72 .....................49 3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 .........52 3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô .............................................................54 3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72 ...............................................58 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen ...........................59 3.5.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin ............60 3.5.3. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 64 1. Kết luận ...........................................................................................................64 2. Kiến nghị .........................................................................................................64 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ........................................................................................................................................... 65 x
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 66 xi
MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, biến đổi khí hậu đã và đang là vấn đề chính đối với nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Sản lượng lương thực toàn cầu đang bị thiệt hại nghiêm trọng bởi các yếu tố phi sinh học như hạn, ngập úng, mặn, dịch bệnh, xói mòn đất và ô nhiễm môi trường (Nikos and Bruinsma, 2012). Trong đó, hạn hán đang là một trong những nhân tố chính gây ảnh hưởng lớn tới nền sản xuất nông nghiệp của toàn cầu và ngày càng trở nên nghiêm trọng ở nhiều khu vực. Các quốc gia thuộc khu vực Nam và Đông Phi là những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề nhất bởi hạn hán. Khu vực này đã trải qua hai mùa mưa liên tiếp 2014-15 và 2015-16 với lượng mưa dưới mức trung bình (WMO, 2016). Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp Quốc (FAO), sản lượng ngũ cốc của khu vực này trong vụ mùa 2015-16 đã giảm 12% so với năm 2014-15. Những khu vực khác bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán trong những tháng đầu năm 2016 bao gồm phần lớn các khu vực ở phía Bắc Nam Mỹ, các vùng phía đông của Australia, các hòn đảo thuộc phía Tây Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á thuộc lưu vực sông Mekong đặc biệt là Việt Nam. Chương trình Lương thực thế giới (WFP) ước tính sẽ có khoảng 17 triệu người cần được hỗ trợ vào đầu năm 2017 (WMO, 2016). Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác nhau. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước đạt 1164,8 nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54 tấn/ha (https://www.gso.gov.vn). Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu khoảng 7,55 triệu tấn ngô (https://www.gso.gov.vn ). Một trong những nguyên nhân chính là do việc canh tác ngô ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên. Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và đặc biệt là trong điều kiện nắng hạn kéo dài. Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn đang là chủ đề nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học. Trong nhiều năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ gen để cải thiện khả năng chịu hạn của cây 1
trồng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn vẫn còn hạn chế. Nguyên nhân gồm cả khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để chuyển gen vào hệ gen. Ở thực vật, trong quá trình thích nghi với điều kiện hạn, sự biểu hiện và các cơ chế điều hòa mức độ biểu hiện của các gen có vai trò quan trọng. Sự biểu hiện của gen liên quan chặt chẽ với các yếu tố điều khiển phiên mã. Gen ZmbZIP72 là một trong những gen mã hóa cho yếu tố điều khiển phiên mã của cây ngô đã được phân lập và mô tả bởi Sheng và cộng sự (2012). Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng đáng kể khả năng thích ứng với khô hạn, cho thấy vai trò tiềm năng của gen ZmbZIP72 trong việc tăng cường khả năng chịu hạn đối với cây chuyển gen. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào cây dòng ngô K7 để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn. Các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: - Phân lập, tách dòng gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) của Việt Nam. - Xác định và phân tích trình tự của gen ZmbZIP72 - Thiết kế các vector mang gen ZmbZIP72 - Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens - Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T0 bằng kỹ thuật PCR. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán 1.1.1. Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm của cây trồng. Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co nguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi cây sống trong môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên mềm yếu và sự héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trường sống bị khô hạn cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ. Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp nước cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thương lớp ngoài, vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hưởng đến đẩy cột nước lên cao trong mạch gỗ. Đặc biệt khi thiếu nước sẽ hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước làm cho cột nước trong mạch gỗ không được đẩy lên liên tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nước qua biểu bì. (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độ quang hợp. Khi hàm lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50%, quang hợp của lá bị đình trệ. (v) Đặc biệt, hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng. Thiếu nước ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý, nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013). Việc giảm năng suất do hạn hán đã được báo cáo ở nhiều loại cây trồng, mức độ nghiêm trọng phụ thuộc vào thời gian xảy ra hạn. Ở lúa mạch (Hordeum vulgare), hạn hán làm giảm năng suất do số lượng của chồi, cụm hoa, hạt trên mỗi cây và trọng lượng của mỗi hạt bị giảm. Ở ngô, stress hạn làm giảm năng suất do trì hoãn việc phun râu, do đó làm tăng thời gian chênh lệch trỗ cờ - phun râu. Đặc tính này liên quan chặt chẽ với năng suất hạt, cụ thể là số bắp và số hạt trên mỗi cây bị ảnh hưởng (Cattivelli et al., 2008). Thâm hụt 3
nước trong suốt quá trình thụ phấn làm tăng tần số hạt không phát triển ở ngô. Ở cây đậu triều (Cajanus cajan), hạn hán diễn ra trong giai đoạn nảy mầm làm sản lượng hạt bị giảm đi 40 – 55% (Nam et al., 2001). Trong giai đoạn sinh sản, thiếu hụt nước làm giảm sản lượng ở bông (Gossypium hirsutum) do việc giảm hình thành và sự phát triển không đầy đủ của các quả nang. Hạn hán ở đậu tương cũng làm giảm tổng sản lượng hạt (Frederick et al., 2001). Hạn hán ít có ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt mẩy trên lúa mỳ nhưng thời gian hình thành hạt ngắn hơn và trọng lượng khô bị giảm khi trưởng thành (Wardlaw and Willenbrink, 2000). 1.1.2. Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật Để chống lại khô hạn, thực vật có những biến đổi sinh lý, hóa sinh phù hợp. Có hai cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước: cơ chế tránh mất nước và cơ chế chịu mất nước. Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998). Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước (Nguyễn Lan Điền, 2003). Cơ chế này phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất nước một cách tối đa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) (Đinh Thị Phòng, 2001). Trong khi đó, cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi hóa sinh diễn ra trong tế bào nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước. Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất. Nhờ vậy, thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L. et al, 2003). Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, các axit amin ví dụ như: axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức protein (Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, 1998). 4
1.1.3. Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật Việc nắm được các cơ chế phân tử của phản ứng chịu hạn ở thực vật là vô cùng quan trọng đối với việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng. Các nghiên cứu gần đây đã phân lập được hàng trăm gen được cảm ứng hoặc ức chế khi cây gặp điều kiện khô hạn. Tuy nhiên, chỉ một phần rất nhỏ các gen được kiểm chứng về vai trò của nó trong việc tăng tính chịu hạn của cây. Những gen này có thể phân vào các nhóm dựa vào chức năng nội bào như: các gen mã hoá protein chức năng, các gen mã hoá yếu tố truyền tín hiệu và các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã… 1.1.3.1. Các gen mã hoá protein chức năng Các gen liên quan đến chức năng bảo vệ trực tiếp lên màng tế bào và protein như LEA protein, heat shock protein (HSP), cold shock protein (CSP). LEA là một nhóm các protein tự nhiên tích tụ trong hạt phấn hoa, hạt và các mô thực vật trong quá trình đáp ứng lại các stress phi sinh học. Việc tích luỹ các protein LEA liên quan trực tiếp với khả năng chịu khô hạn ở thực vật (Amara et al. 2012). Bên cạnh dữ liệu phong phú về cấu trúc và sự biểu hiện của protein này, ngày càng có nhiều các công trình đề cập đến việc sử dụng các gen LEA nhằm cải thiện tính chống chịu khô hạn ở thực vật (Grelet et al., 2005). Ví dụ, gen HVA1 mã hoá nhóm protein LEA3 của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta đã chuyển nạp gen này thành công vào cây ngô để tăng cường khả năng chịu hạn và mặn trong điều kiện nhà lưới (Nguyen et al., 2013). Gen OsLEA3-1 nhạy cảm với mặn đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển của promoter CaMV35S và promoter HVA1-like (Xiao et al. 2007). Các protein sốc nhiệt (HSP) và sốc lạnh (CSP) là các chaperone ngăn ngừa sự biến đổi và gấp nếp của các thành phần tế bào trong điều kiện stress. Các gen CspA và CspB từ vi khuẩn đã được chuyển vào ngô để tăng cường khả năng chịu hạn, nóng, và lạnh bằng cách bảo vệ quá trình quang hợp, sinh dưỡng và các giai đoạn sinh trưởng, sinh sản. Năng suất tăng lên khoảng 11 – 12% đối với cây ngô chuyển gen CspA và CspB thông qua việc đánh giá các thử nghiệm về năng suất trong nhiều năm, ở nhiều địa điểm (Yang et al., 2010). sHSP17.2, sHSP17.4 và sHSP26 là 3 protein sốc nhiệt nhỏ đã được xác định bằng 5
cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn. Các phân tích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khi đáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô. ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau phiên mã các sHSP này (Hu et al. 2010). Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào, truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả năng chịu stress (Trivedi et al. 2012). Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng stress của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin. Các protein CYP ở lúa, ngô, Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các trình tự bảo thủ. CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al. 2013). Đánh giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần số cao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ. 1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợi phi sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc dù các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mã hoá cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập. Một vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như: NPK (Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003). Cũng giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu có thẻ làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở nhiều mặt. Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana. NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của con đường truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở cây ngô chuyển gen (Shou et al., 2014). PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một enzyme quan trọng trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là một thành phần cấu trúc màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp ứng của cây trước điều kiện bất lợi. Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô, cây tăng cường khả năng chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al., 2013). 6
1.1.3.3. Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã Yếu tố điều kiển phiên mã (TF) là các protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên mã bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu trên promoter của gen. Các yếu tố điều khiển phiên mã hiện nay được các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu và khai thác do tiềm năng sử dụng lớn trong công nghệ sinh học (Saibo et al., 2009; Century et al., 2008). Hiện nay, những nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng abscisic acid (ABA) đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng và thích nghi với các stress phi sinh học. Người ta nhận thấy rằng, bên cạnh phần lớn các gen đáp ứng với stress được điều hòa bằng ABA, vẫn còn một lượng các gen không chịu ảnh hưởng bởi ABA. Do đó, các yếu tố phiên mã cũng được chia thành nhóm phụ thuộc hay độc lập với ABA. Các TF của hơn 50 họ khác nhau mã hoá cho 1700 gen khác nhau đã được tìm thấy trong Arabidopsis (Yang et al., 2010). Các TF được trình bày dưới đây đều là các TF đáp ứng với hạn và chịu hạn. TF bZIP là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã phụ thuộc ABA. ABA responsive element binding factors (AREB/ABF) là một thành viên của nhóm TF bZIP liên quan đến tín hiệu ABA trong điều kiện hạn hán và trưởng thành của hạt. AREB/ABF nhận biết và bám vào ABA responsive element (ABRE) yếu tố hoạt động cis để điều khiển sự hoạt động của các gen phía sau (Mundy et al., 1990). ABRE nằm trong vùng promoter của các gen đáp ứng ABA (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006). Việc đóng khí khổng và giảm sự thoát hơi nước là kết quả của việc tăng hàm lượng ABA do sự biểu hiện quá mức của AREB1/ABF2, ABF3 hoặc AREB2/ABF4 (Kang et al., 2002). Sự biểu hiện quá mức của gen ABF3 ở cây lúa chuyển gen cho thấy khả năng chịu hạn thông qua việc tăng cường độ phát huỳnh quang của diệp lục (Fv/Fm) và giảm sự héo và cuộn xoắn ở lá (Oh et al., 2005). Các cây chuyển gen AREB1 được điều khiển bởi 35S promoter cho thấy khả năng sống sót vượt trội (100%) so với cây đối chứng (40%) trong điều kiện hạn, không những vậy cây chuyển gen còn có hiệu năng sử dụng nước cao hơn và có nhiều lá hơn so với dòng đối chứng (Leite et al., 2014). Một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn khác là WRKY, TF này được tìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004). 7
Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010). Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014). NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008). Có hơn 100 gen mã hóa cho các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis. Các protein NAC có nhiều chức năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng chống chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012). Có khoảng 40 TF NAC trong số 140 được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa. NAC019, NAC055 và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhận biết và bám vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các gen đáp ứng nhanh với mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran et al., 2004). Sự biểu hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ phấn của hoa lên 17 -22% và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối chứng trong điều kiện hạn hán vừa và nặng (Hu et al., 2006). Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng cường tính chịu hạn và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng (Nakashima et al., 2007). Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen OsNAC9 có tính chịu hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây đối chứng trong điều kiện bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012). Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là các TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA. Phân tích vùng promoter của các gen biểu hiện không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố hoạt động cis với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như yếu tố đáp ứng mất nước (DRE- dehydration responsive element). Họ TF đáp ứng mất nước độc lập ABA điển hình là họ DREB. Các TF này đóng vai trò điều tiết trong điều kiện stress hạn, lạnh và sự phát triển của lá, hoa, và hạt (Yang et al., 2010). Có 2 loại DREB 8