Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:47

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài lầ xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng cây Bảy lá một hoa. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS) THU THẬP Ở LAI CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS) THU THẬP Ở LAI CHÂU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy Thái Nguyên, năm 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Các kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả Ngô Thùy Linh i
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy, khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo, hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em. Luận văn là sản phẩm của đề tài cấp Bộ có mã số B2017-TNA-04-QG do PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học làm chủ nhiệm. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả Ngô Thùy Linh ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii MỤC LỤC ..........................................................................................................iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. iv DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4 1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa ...................................................... 4 1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa ................................................... 4 1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa ................................................... 5 1.2. Các phương pháp định danh thực vật ........................................................... 6 1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 7 1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................. 8 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 14 2.1. Vật liệu thực vật.......................................................................................... 14 2.2. Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị .................................................. 14 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 14 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ .................................................................................... 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 14 2.3.1. Phương pháp hình thái, giải phẫu ............................................................ 15 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................ 15 2.3.3. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide ............................................. 18 iii
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 19 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa . 19 3.1.1. Đặc điểm hình thái của mẫu cây Bảy lá một hoa .................................... 19 3.1.2. Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa ................................... 20 3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA của mẫu cây Bảy lá một hoa .. 23 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .............................................................. 23 3.2.2. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK ..... 23 3.2.3. Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS ........ 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34 1. Kết luận .......................................................................................................... 34 2. Đề nghị........................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35 iv
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT CBOL : Consortium for the Barcode of Life DNA : Deoxyribonucleic acid ITS : Internal Transcribed Spacer kb : Kilobase matK : MaturaseK NCBI : The National Center for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction rpoC : Retained products of conception SH : Sìn Hồ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Mồi matK sử dụng trong kỹ thuật PCR ............................................ 17 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 17 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 17 Bảng 2.4. Mồi ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ................................................ 18 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 18 Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR....................................................... 18 Bảng 3.1. Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương đồng và sai khác với mẫu SH .............................................................. 27 Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK ..................... 27 Bảng 3.3. Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng và sai khác với mẫu SH ....................................................................... 32 Bảng 3.4. Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS ............... 32 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát ........................................................... 15 Hình 3.1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu .................................................... 19 Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu cuống lá ................................................................ 20 Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân ....................................................................... 21 Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu rễ ........................................................................... 22 Hình 3.5. Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa ................. 23 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR .... 24 Hình 3.7. Kết quả Blast trình tự gen matK ........................................................ 25 Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 26 Hình 3.9. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. ....... 28 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ thuật PCR............................................................................................. 29 Hình 3.11. Kết quả Blast trình tự vùng gen ITS ................................................ 30 Hình 3.12. Trình tự nucleotide của vùng gen ITS phân lập từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu .............................................. 31 Hình 3.13. Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Bảy lá một hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33 vi
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bảy lá một hoa là tên gọi chung của các mẫu cây thuộc chi Paris. Cây Bảy lá một hoa còn gọi là Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăng đài, Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất, Cúa dô (H’Mông)…. Hiện nay, chi Paris được công bố có 24 loài, mỗi loài gồm nhiều giống khác nhau. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã có 8 giống. Nhiều giống được mô tả chi tiết về mặt hình thái, đó là căn cứ ban đầu để nhận dạng và phát hiện sự có mặt của các cây quý hiếm này [30]. Ở Việt Nam, cây Bảy lá một hoa được tạm gọi tên khoa học là Paris polyphylla Sm. [12], [30]. Đây là những loài thảo mộc có giá trị trong chữa một số bệnh như cầm ho, giảm cơn hen, cầm máu, ức chế trực khuẩn lị, thương hàn… Đặc biệt, chữa cả một số bệnh nan y như ung thư, rắn cắn... chính vì có nhiều giá trị mà hiện tại cây Bảy lá một hoa đang bị khai thác bừa bãi, có nguy cơ tuyệt chủng. Từ năm 1999, Phạm Hoàng Hộ mô tả đặc điểm hình thái của 5 loài [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự lập khóa phân loại chi tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Tuy nhiên, tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm. Có nhiều phương pháp có thể định danh thực vật làm thuốc đảm bảo độ chính xác và hiệu quả. Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như cây Ngô đồng đỏ, Rong câu chỉ, Ráng thư dực [2], [3], [4]… Tuy nhiên, khi cây không còn nguyên vẹn, hay đã được chế biến thì phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả. Sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong những năm gần đây có bổ sung vào hệ thống phân loại sinh vật phương pháp phân loại học phân tử. Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùng làm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến. Việc xác 1
định chính xác tên loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sản phẩm. Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trò quan trọng trong việc bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử. Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều. Hiện nay, số lượng các trình tự nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng [13], [25], [33]. Tỉnh Lai Châu là một tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam được phát hiện có sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [20]. Mẫu cây thu được có những đặc điểm gì và thuộc loài nào là câu hỏi được đặt ra trong nghiên cứu này. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu”. 2. Mục tiêu của đề tài Xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng cây Bảy lá một hoa. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cơ quan sinh dưỡng cây Bảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu. - Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của đoạn gen matK. 2
- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của vùng gen ITS. - Nghiên cứu xác định mối quan hệ của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập được dựa trên phân tích trình tự nucleotid của đoạn gen matK và vùng gen ITS nghiên cứu. 3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa 1.1.1. Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa Cây Bảy lá một hoa là thực vật thuộc ngành Magnoliophyta (Mộc lan, Hạt kín), lớp Liliopsida (Hành), bộ Dioscoreales (Củ nâu), họ Trilliaceae (Trọng lâu), chi Paris (Bảy lá một hoa). Chi Paris hiện tại được công bố có 22 loài, trong đó gồm nhiều giống khác nhau [16]. Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã gồm 8 giống. Các giống khác nhau về số lượng, hình dạng lá và sự phân bố [32]. 8 giống thuộc loài Paris polyphylla gồm: Giống Phân bố Paris polyphylla var. Alba Quý Châu, Hồ Bắc, Vân Nam Paris polyphylla var. chinensis An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam , Giang Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân Nam, Lào, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam Paris polyphylla var. latifolia An Huy, Hà Nam, Hồ Bắc, Giang Tây, Thiểm Tây, Sơn Tây Paris polyphylla var. nana Tứ Xuyên Paris polyphylla var. panxiensis Tứ Xuyên Paris polyphylla var. polyphylla Trung Quốc , Himalayas, phía bắc Đông Dương Parispolyphylla var. stenophyla Trung Quốc, Bhutan, Assam, Nepal, Myanmar, Sikkim Paris polyphylla var.yunnanensi - Quý Châu, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân Nam, Assam, Myanmar 4
Tên khoa học là Paris polyphylla Sm. Tên đồng nghĩa Daiswa polyphylla (Smith) Raf. Tên khác như Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăng đài, Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất, Cúa dô (H’Mông)… cũng được sử dụng để gọi về cây Bảy lá một hoa [12], [30]. Ở Việt Nam, từ năm 1999, Phạm Hoàng Hộ đã mô tả đặc điểm hình thái của 5 loài. Các loài đó là Paris delavayi, Paris polyphylla, Paris fargesii, Paris yunanensis, Paris hainanensis [5]. Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự đã lập khóa phân loại chi tiết cho 8 loài và 2 giống [20]. Các nghiên cứu về cây Bảy lá một hoa đều khẳng định tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm. Bảy lá một hoa là loại cây một lá mầm, thân thảo, sống lâu năm. Từ củ nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng, cao chừng 0,3-0,8 m, thân thon dài, trơn nhẵn, không có cành, phía gốc có 1 số lá thoái hóa thành vảy bao lấy thân cây. Thân mềm, mọng nước. Phần thân trên mặt đất của cây lụi hàng năm vào cuối mùa thu. Củ có ngấn, phình to, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu xám đen. Rễ mềm, mọc dày theo củ. Giữa thân có 1 tầng lá mọc vòng, thường từ 4 đến 9 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình mác, hình trứng, bầu dục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn. Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm. Lá đài bằng số cánh tràng. Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn. Nhị mảnh, có bao phấn màu vàng nâu, xếp thành 2 vòng, xen kẽ nhau, mỗi vòng có 5 nhị [5], [20]. 1.1.2. Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn. Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma. Ở Việt Nam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc như Ninh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12], [20], [32]. 5
Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một số bệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễ Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc. Thân rễ của cây còn chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc [12]. Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có tác dụng: cầm ho, giảm cơn hen. Chiết xuất hóa học trong thân và rễ còn có tác dụng cầm máu, ức chế với mức độ khác nhau đối với trực khuẩn lị, thương hàn, tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn đồng thời có tác dụng ức chế Leptospira và virut cúm. Ngoài ra chiết xuất ở cây Bảy lá một hoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung [35]. Tại vùng Quảng Tây (Trung Quốc) có câu “Ốc hữu thất diệp nhất chi hoa / Độc xà bất tiến gia” nghĩa là trong nhà có cây Bảy lá một hoa thì rắn độc không vào nhà được. Ngoài công dụng chữa sốt và rắn độc cắn, vị tảo hưu (thân rễ của cây Bảy lá một hoa) còn dùng chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, ho lao, dùng ngoài da thì giã nát đắp lên nơi sưng đau. Ở Châu Âu người ta dùng thân, rễ và quả của loài Paris quadrifolia làm thuốc tẩy nhưng có chất độc. Dùng với liều vừa phải, thân, rễ và quả có tác dụng chống co thắt [30], [35]. 1.2. Các phương pháp định danh thực vật Có rất nhiều phương pháp để định danh thực vật. Các phương pháp đều dựa trên nguyên tắc những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất giống nhau. Thực vật càng gần nhau thì mức độ giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học, ... nhưng chủ yếu dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Việc quan sát, so sánh cấu tạo của cây thường được tiến hành trong điều kiện tự nhiên và môi trường thực nghiệm. Kỹ thuật PCR thường dùng để xác định mối quan hệ phát sinh giữa các loài và là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học. Việc kết hợp 2 phương pháp này sẽ có hiệu quả trong nhận diện và bảo tồn các loài thực vật. 6
1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu Hầu hết cấu trúc của các cơ quan đều nghiên cứu ở mức độ hiển vi, vì vậy mà các mẫu khi sử dụng phương pháp giải phẫu đều được cắt thật mỏng, sau đó để giữ được cấu trúc bên trong tế bào, thuận lợi cho việc quan sát người ta thường dùng phương pháp nhuộm màu. Việc nhuộm màu này giúp chúng ta phân biệt được các thành phần cấu tạo của các cơ quan, vì mỗi một thành phần thì bắt một màu nhất định. Nguyên tắc của phương pháp nghiên cứu hình thái và giải phẫu chủ yếu là dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đã thu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu đã cung cấp nhiều thông tin có giá trị trong định loại thực vật [2], [3], [4], [6], [8]. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhóm tác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam có 2 loài Ngô đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả. Những sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngô đồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển loài cây ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm [2]. Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban. Kết quả nghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3]. Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêu bản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đổi lớn về mặt hình thái. Tuy nhiên, giữa chúng vẫn có những đặc điểm chung về cấu tạo thân, kiểu phân nhánh, hình dạng quả. Các đặc điểm hình thái ngoài cho thấy, tuy có sự phân bố rộng khắp và được nuôi trồng dọc theo biển Việt Nam nhưng chúng vẫn xuất phát từ cùng một loài [4]. 7
Ráng thư dực (Thelypteridaceae Ching ex Pic. Serm) là một họ lớn với khoảng 50 chi và hơn 1000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Doãn Hoàng Sơn cùng cộng sự (2017) đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái để mô tả một số đặc điểm cơ bản của các chi trong họ Ráng thư dực. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu của 17 chi có ở Việt Nam về đặc điểm hình thái, sinh thái, khu phân bố, kèm theo thông tin về số lượng loài của các chi đó ở Việt Nam [8]. Chi Mua tuy là chi nhỏ nhưng những đại diện thuộc chi Mua lại có vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái rừng thứ sinh. Một số loài thì làm thuốc, loài thì làm thực phẩm, làm cảnh. Năm 2017, Khuất Văn Quyết cùng Đỗ Thị Xuyến đã tiến hành mô tả đặc điểm hình thái chi Mua ở Việt Nam thông qua mô tả dạng sống, hình thái lá, hình thái hoa, cụm hoa, quả, hạt của 13 loài. Trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái đã lựa chọn được 51 đặc điểm làm cơ sở xây dựng khóa phân loại các loài trong chi Mua ở Việt Nam [6]. 1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái đã thành công trên nhiều loài [2], [3], [4], [6], [8]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật các phương pháp phân loại có độ chính xác cao hơn cũng được chú trọng trong nghiên cứu. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử là một trong những lựa chọn của nhiều nhà nghiên cứu. Theo đó, phân loại dựa vào sinh học phân tử có nghĩa là sử dụng các phân tử lớn như DNA, RNA, protein để làm dấu hiệu nhận biết và phân loại sinh vật. DNA barcode là một đoạn trình tự nucleotide ngắn, từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện các loài sinh vật. Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quả tương đối của các đoạn gen chỉ thị đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên 8
không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn. Hebert P.D, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada từ năm 2003 đã đề xuất mã vạch DNA (DNA barcode, chỉ thị DNA) giống như một cách để xác định loài [18]. Để đảm bảo là một mã vạch DNA điển hình cần 3 yếu tố. Thứ nhất phải có hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu. Thứ hai phải có tính phổ biến. Thứ ba có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời [28]. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử có thể giám định được ngay cả khi các mẫu không còn nguyên vẹn. Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác [23]. Hiện nay, nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị các bệnh, góp phần phát triển ngành công nghiệp dược liệu. Những cây dược liệu luôn phải xác định ở cấp độ loài, vì vậy cần phải định danh chính xác để đảm bảo được sản phẩm chất lượng và có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính đa dạng di truyền và bảo vệ các loài quý hiếm. Bên cạnh đó, dược liệu còn bị pha trộn nhiều làm giảm đi hiệu quả của thuốc, hay dược liệu bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính, nên một số trường hợp có thể thể gây nguy hiểm đến tính mạng. Vì vậy, xác định chính xác nguồn gốc của các loại dược liệu là điều cần thiết. Nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA. He J. và cộng sự (2010) cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số mẫu cây dược liệu trong chi Aconitum [18]... Chỉ thị DNA thường dùng trong phân loại cây thuốc là matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL … Gen rpoC1 mã hóa 1 trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp. Gần đây, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra hiệu quả của việc sử dụng gen rpoC1 vào việc định danh thực vật. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Thủy và cộng sự (2016) đã sử dụng đoạn gen rpoC1 có kích thước 558 bp của mẫu thu thập tại 9
huyện Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn đã xác định được mối quan hệ của mẫu với các loài trong chi Paris ở mức 96-99 % [10]. Nghiên cứu của Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài Bryophytes. Tuy nhiên, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài của đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định loài [24], [28]. Gen matK mã hóa cho enzyme maturase K liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Trong số các gen lục lạp, matK có kích thước khoảng 1550 bp và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. Trình tự gen matK trong các gen lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao. CBOL đã thử nghiệm gen matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng gen matK là một trong những mã vạch chuẩn cho thực vật [23], [28]. Năm 2008, dựa vào những mẫu thu được từ Costa Rica, tiến sĩ Vincent Savolainen và đồng sự sử dụng gen matK để nhận dạng 1600 loài lan. Trong nghiên cứu, nhóm tác giả phát hiện một loài trước đây được cho là lan thực ra lại là hai loài tách biệt. Loài này sống trên những dốc khác nhau trên núi và có hoa hình dạng khác nhau để thích nghi với những loài côn trùng thụ phấn khác nhau [31]. Nghiên cứu của Huang và cộng sự (2017) xác định trình tự của gen lục lạp loài Paris vietnamensis có 158224 bp. Trong đó gen matK gồm 1547 nucleotide, nằm từ vị trí 1677 đến 3224, quy định tổng hợp maturase K có 515 axit amin (KX784050) [34]. Hay như khi phân tích hệ gen lục lạp của loài Daiswa chinensis, nhóm tác giả này cũng thu được 157847 bp. Gen matK nằm ở vị trí từ 1651 đến 3198 quy định tổng hợp maturase K (KX784048) [34]. 10
Khi sử dụng gen matK để so sánh mối quan hệ của loài có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum palmatum L.. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là khá cao [11]. Trên cây Bảy lá một hoa, việc sử dụng gen matK trong việc định danh cũng đã được thực hiện bởi một số các tác giả. Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Thủy và cộng sự (2017) phân lập đoạn gen matK từ các mẫu khác nhau về địa điểm thu thập và số lượng lá. Theo đó mẫu thu được ở tỉnh Hà Giang có 6 lá và mẫu thu ở tỉnh Lào Cai có 7 lá. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen matK mẫu cây 6 lá (Hà Giang) có 808 nucleotide, trình tự nucleotide của đoạn gen matK mẫu cây 7 lá (Lào Cai) có 806 nucleotide. Tuy nhiên kết quả so sánh sự khác biệt và tương đồng cho thấy cả 2 mẫu cùng thuộc loài Paris polyphylla var. yunnanensis [11]. Trình tự vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2. Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp rRNA. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S. Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di truyền của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch đại và xác định trình tự DNA ribosome. Trình tự nucleotide vùng gen ITS đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú và đa dạng, thuận lợi cho việc phân tích so sánh. Các nghiên cứu phát sinh loài thực vật dựa trên vùng gen ITS đã được tiến hành bởi nhiều nhà nghiên cứu [14], [21], [22]. Trước đây nấm thường được phân loại dựa trên các đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả 11