Luận văn Thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của đề tài là nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa thu thập được ở Bắc Sơn - Lạng Sơn. Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– TRƯƠNG MẠNH TIẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– TRƯƠNG MẠNH TIẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Các kết quả nghiên cứu là trung thực, một phần đã được công bố trên Tạp chí Khoa học và công nghệ - Đại học Thái Nguyên với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019 Tác giả Trương Mạnh Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Thị Thu Thủy, khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo, hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường. Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT Số 3 Bảo Thắng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập. Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em. Luận văn là sản phẩm của Nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ có mã số B2018- TNA-04-GEN do PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học làm chủ nhiệm. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019 Tác giả Trương Mạnh Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC Lời cam đoan ........................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ......................................................................................... iv Danh mục các bảng.............................................................................................. v Danh mục các hình ............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 1.1. Cây Bảy lá một hoa ...................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại ............................ 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa ........................................ 4 1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa......................................................... 5 1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa ........................................................... 6 1.2. Một số phương pháp định danh thực vật ...................................................... 9 1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu ................................................. 9 1.2.2. Phương pháp phân loại học phân tử ........................................................ 12 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 22 2.1. Vật liệu........................................................................................................ 22 2.1.1. Vật liệu thực vật....................................................................................... 22 2.1.2. Vật liệu nhân gen matK, ITS.................................................................... 22 2.1.3. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 23 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 23 2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa.... 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.2.2. Phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen.............. 24 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 25 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 26 3.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa ....... 26 3.1.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái .............................................. 26 3.1.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu.............................................. 27 3.2. Đặc điểm đoạn gen matK và vùng gen ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa........ 30 3.2.1. Đặc điểm đoạn gen matK ........................................................................ 31 3.2.2. Đặc điểm vùng gen ITS ........................................................................... 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BLAST : Basic Local Aligment Search Tool DNA : Deoxyribose nucleic acid đtg : Đồng tác giả ITS : Internal Transcribed Spacer kb : Kilobase matK : Maturase K NCBI : The National Center for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction rpoC1 : RNA polymerase beta' subunit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam ..................... 8 Bảng 1.2. Một số thông tin về gen matK của chi Paris .................................... 14 Bảng 1.3. Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris ..................................... 16 Bảng 1.4. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong phân loại thực vật............................................................................. 17 Bảng 1.5. Mã vạch DNA trong định danh cây Bảy lá một hoa tại Thái Nguyên .. 20 Bảng 2.1. Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR ..... 22 Bảng 3.1. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK ................ 33 Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS .................. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa ........................ 4 Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam ............................. 8 Hình 1.3. Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS ......................................... 15 Hình 2.1. Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn .............. 22 Hình 3.1. Hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn trồng trong vườn trường Đại học Sư phạm .............................. 26 Hình 3.2. Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa .................... 28 Hình 3.3. Hình ảnh giải phẫu thân cây Bảy lá một hoa ................................... 29 Hình 3.4. Hình ảnh giải phẫu rễ cây Bảy lá một hoa....................................... 30 Hình 3.5. Hình ảnh kết quả tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1% ...... 31 Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ........... 31 Hình 3.7. Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI ................. 32 Hình 3.8. Trình tự đoạn gen matK của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ...... 32 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn ............ 33 Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ............... 34 Hình 3.11. Kết quả phân tích bằng BLAST trình tự nucleotide vùng gen ITS trong NCBI ................................................................................ 34 Hình 3.12. Trình tự vùng gen ITS của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn ... 35 Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS của các mẫu nghiên cứu ................................................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bảy lá một hoa là tên gọi chung thông dụng ở Việt Nam của nhiều loài thuộc chi Paris. Bảy lá một hoa còn gọi là củ rắn cắn, hưu túc nhiều lá, hưu túc vân nam, trọng lâu hải nam … thuộc loại dược liệu quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cần bảo vệ ở Việt Nam. Theo Nguyễn Tâp (2004, 2007), nhiều loài thuộc chi Paris nằm trong sách đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN (International Union for Conservation of Nature) ở mức nguy cấp (tiếng Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng Anh: Vulnerable, viết tắt VU) [20], [21]. Cây Bảy lá một hoa có khả năng chữa trị nhiều bệnh từ các bệnh thông thường như sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa ho…đến các bệnh nan y như: rắn độc cắn, ung thư… Vì vậy, Bảy lá một hoa là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học. Trên thế giới, chi Paris có 22 loài và nhiều thứ [56]. Ở Việt Nam cây được tìm thấy chủ yếu ở các vùng núi phía Bắc, như một số tỉnh: Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu, Cao Bằng, Hòa Bình... Cây sống trong điều kiện núi cao, nhiệt độ lạnh, sống dưới tán rừng. Mỗi năm cây chỉ ra hoa 1 lần vào khoảng tháng 4 -6, tạo quả vào khoảng tháng 7-11 sau đó lụi đi, thời gian ủ đông của cây khá lâu. Các loài trong chi Paris khá đa dạng và có sự tương đồng cao về hình thái. Năm 2016, Nguyen Quynh Nga và đtg đã được thiết lập khóa phân loại bằng việc mô tả hình thái, giải phẫu của 8 loài (species) và 2 thứ (varieties) ở Việt Nam [43]. Có thể nhận diện thực vật bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh... hướng nghiên cứu này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như Hà thủ ô đỏ [9], Sóng rắn [28], Phong lữ thảo [6]… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như cây không còn nguyên vẹn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loại phương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử. Trong đó, mã vạch DNA được lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới. Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây trồng [37],… Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự ITS1- 5.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều trong định danh thực vật. Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các loài thực vật dựa trên trình tự vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai [18], hay các các chi Erica [45], Scrophularia [48], Potamogeto [55] và nhiều thực vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng [34], [53]… Huyện Bắc Sơn là huyện miền núi của tỉnh Lạng Sơn, thuộc vùng Đông Bắc Việt Nam. Phía Tây của huyện Bắc Sơn giáp huyện Võ Nhai của tỉnh Thái Nguyên. Ở đây có nhiều núi cao từ 500 m đến hơn 1000 m so với mặt nước biển, được phát hiện có sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [57], [59]. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mô tả được đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa thu thập được ở Bắc Sơn - Lạng Sơn 3.2. Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Bảy lá một hoa 1.1.1. Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại Paris là tên gọi chung của một chi của thực vật có hoa, được mô tả bởi Linnaeus từ năm 1753 [12]. Đến nay, việc phân loại chi Paris vẫn chưa có sự thống nhất. Dưới dây là 3 cách phân loại đang được sử dụng: (1) Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris thuộc phân giới thực vật bậc cao; ngành Ngọc lan (Magnoliophyta); lớp Hành (Liliopsida); phân lớp Loa kèn (Lilidae); bộ Củ nâu (Dioscoreales); họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae), chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris) [4]. (2) Thực vật chí Trung Quốc (năm 2000) đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài (species) và 16 thứ (variety-var.) trong đó có 12 loài đặc hữu [40]. (3) Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III - Angiosperm Phylogeny Group - (năm 2009) dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Paris (chi Trọng lâu) được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) với tổng số 26 loài và 13 thứ [56]. Chi Paris phân bố chủ yếu ở châu Âu và châu Á, đặc biệt tập trung nhiều ở Trung Quốc. Theo tạp chí “Flora of China” (2000), chi Paris được mô tả gồm 22 loài với nhiều thứ khác nhau. Trong chi Paris, Paris polyphylla Smith là loài được tìm thấy sớm nhất (năm 1813). Loài này hiện được công bố chi tiết có tới 10 thứ [40]. Mười thứ (variety) thuộc chi Paris gồm: 1) Paris polyphylla var polyphylla (tên tương ứng Daiwa polyphylla Sm.); 2) Paris polyphylla var yunanensis; 3) Paris polyphylla var chinensis; 4) Paris polyphylla var nana; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
5) Paris polyphylla var alba; 6) Paris polyphylla var stenophylla; 7) Paris polyphylla var minor; 8) Paris polyphylla var latifolia; 9) Paris polyphylla var pseudothibetica; 10) Paris polyphylla var kwantungensis 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa Bảy lá một hoa là cây thân cỏ một năm. Một cây Bảy lá một hoa hoàn chỉnh sẽ gồm các phần: rễ, thân củ, thân thảo, lá, hoa/quả [12], [21], [40], [43]. Một số cơ quan của cây Bảy lá một hoa được mô tả trên hình 1.1. d. a. Hoa Quả và hạt b. Lá e. Thân củ f. Rễ c. Thân cỏ Hình 1.1. Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa (Hình ảnh là sản phẩm của nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ GD-ĐT giai đoạn 2016-2019) Thân cỏ là phần thân nằm trên mặt đất, thường lụi đi vào cuối thu. Kiểu thân cỏ sẽ không có cấu tạo thứ cấp [17]. Thân cỏ của cây Bảy lá một hoa cao hàng chục cm đến hàng trăm cm (Paris dunniana cao 1,5-3 m). Thân cỏ thon dài, trơn nhẵn, mọng nước, không có cành, phía gốc có một số lá thoái hoá thành vẩy, bao lấy thân. Giữa thân có một tầng lá mọc vòng khoảng 3 đến 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
lá, đa số các loài có từ 4 đến 6 lá. Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím. Phiến lá hình mác, hình trứng, bầu dục… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm. Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn [40]. Mỗi cây chỉ có một hoa mọc trên đỉnh cây. Mỗi hoa đều có cuống dài hàng chục cm. Hoa có đầy đủ các phần đài, tràng, nhị, nhụy. Quả của cây Bảy lá một hoa là quả đơn, có một mầu duy nhất. Vỏ quả màu xanh, khi quả chín vỏ có màu xám- đen. Quả chín sẽ tự mở vỏ để cho hạt thoát ra ngoài. Hạt của cây bảy lá một hoa thuộc kiểu hạt có nội nhũ. Hạt gồm có vỏ màu đỏ bao bọc phôi và nội nhũ (hình 1.1 d). Về mặt lý thuyết, ở những hạt kiểu này, phôi thường nhỏ, đôi khi còn chưa có sự phân hóa hoàn toàn [17]. Thân củ là phần nằm dưới mặt đất. Thân củ của cây Bảy lá một hoa có chứa chất dự trữ để cây sử dụng khi ra hoa, tạo quả, mọc chồi [17]. Thân củ phình to, thường nằm ngang, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màu xám đen. Trên thân củ có những mắt mang các sẹo của lá thoái hóa, trong nách các sẹo đó có các chồi nách. Cây Bảy lá một hoa có kiểu rễ của “cây có rễ phụ” [17]. Rễ phụ mục ra từ thân củ. Các rễ tương đối đồng đều về kích thước, thường màu nâu và có hình trụ. Cây Bảy lá một hoa thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ cao trên 600m và ưa bóng, hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn. Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm mới thấy có hoa, quả [30]. 1.1.3. Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa Theo y học cổ truyền, cây Bảy lá một hoa có công dụng trong điều trị một số bệnh nan y như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô. Thân rễ Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, có tác dụng lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc, chữa sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa ho… [23], [30]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Ở Ấn Độ và Nê-pan, thân rễ Bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống bột thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong 2 ngày. Để trị mụn nhọt và nhọt độc, hằng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ Bảy lá một hoa một cách đều đặn. Ngoài ra, thân rễ Bảy lá một hoa còn được sử dụng để chống co thắt, dễ tiêu hóa ở dạ dày, dùng làm thuốc long đờm, giải độc rắn cắn và dùng để làm giảm ảnh hưởng của thuốc mê [12]. Một số bài thuốc quý được tuyên truyền phổ biến trong dân gian để chữa bệnh bằng cây Bảy lá một hoa [58]. * Chữa rắn độc cắn bằng cách kết hợp thuốc uống và đắp ngoài. Theo đó, sử dụng thân và rễ cây khoảng 4 - 8 g, Thanh mộc hương 4 g, nhai sống uống với nước đun sôi để nguội. Đắp ngoài bằng cách dùng thuốc giã với dấm đắp lên vùng rắn cắn. * Trị ung nhọt, áp xe vú, quai bị, lao hạch cổ: Dùng thân rễ 8g, Bồ công anh 40 g sắc lấy nước uống và phần bã đắp bên ngoài vết thương. * Trị viêm phế quản mạn tính: Dùng thân rễ nghiền thành bột, mỗi lần uống 3 g với nước, ngày uống 2 lần. Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có Saponin được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh ung thư [38], [41], chống các chất oxy hóa [49]. Cơ chế chống ung thư của các dược chất trong cây Bảy lá một hoa còn chưa rõ ràng, tuy nhiên theo hướng các saponin kích thích tế bào chết theo chương trình (apoptosis) [41]. Bên cạnh saponin là dược chất quan trọng, trong thân rễ của cây Bảy lá một hoa người ta cũng phát hiện thấy 1 glucoside được gọi là paristaphin. Khi thuỷ phân paristaphin sẽ cho glucose và một glucoside mới gọi là paridin, thuỷ phân paridin, ta lại được glucose và một chất nhựa gọi là paridol [12]. 1.1.4. Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa Cây Bảy lá một hoa có những đòi hỏi riêng biệt về điều kiện sống. Theo đó, kết quả nghiên cứu cho thấy đa số các loài được phát hiện mọc hoang ở Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
những khe núi ẩm ướt, có độ cao so với mặt nước biển hàng trăm mét và ưa bóng. Ngoài ra, cây còn mọc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn, cây không chịu được úng. Phần thân trên mặt đất lụi đi hàng năm, thường vào cuối thu. Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau. Cây chưa được trồng trên quy mô lớn mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phương thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Theo đó, hàng năm vào khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươm hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo. Mỗi cây chỉ có một hoa, mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao, tuy nhiên đây vẫn là hình thức chính để cây tái sinh trong tự nhiên. Thân rễ Bảy lá một hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng. Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [30]. Ở Ấn độ, kế hoạch bảo tồn Paris polyphylla đã được thiết lập. Theo nhóm nghiên cứu ở Ấn Độ, lượng mưa là yếu tố chi phối khu phân bố của Paris polyphylla, và nhiệt độ thích hợp với Paris polyphylla là 19OC [42]. Nghiên cứu của Y Teerawatsakul và đtg (2014) việc nuôi cấy chồi đỉnh của Paris polyphylla chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, trong đó nuôi cấy chóp rễ với nhiệt độ thấp hơn 14OC và cao hơn 18OC đều không làm biến đổi mẫu cấy. Nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy chồi đỉnh (shoot tip) là 14-160C, trong khoảng nhiệt độ này sau 45 ngày nuôi cấy mẫu tăng hơn 7,5 cm [54]. Việc đánh giá và phân hạng các cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng, cần bảo vệ ở Việt Nam được Nguyễn Tập đề cập đến trong các năm 2004, 2007 [20], [21]. Theo đó, ở Việt Nam chi Paris thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae) có các loài trong danh lục đỏ cần bảo vệ trình bày ở bảng 1.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Bảng 1.1. Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam Tài liệu Phân hạng theo STT Tên khoa học Tên Việt Nam tham IUCN, 1994 khảo 1 Paris delavayi Franch Trọng lâu lá dài EN.A1c,d [20] Paris fargesii Franch EN.A1c,d Củ rắn cắn, Bảy 2 (Paris petiolata Baker ex Wight lá một hoa var. ramembnaceae Wight) Trọng lâu hải VU.B2a,b [15] 3 Paris hainanensis Merr nam (ii,iii,v) EN.B2a,b 4 Paris polyphylla Smith Bảy lá một hoa (ii,iii,v) Trọng lâu vân EN.B2a,b 5 Paris yunnanensis Franch. nam (ii,iii,v) VU.B2a,b 6 Paris chinensis Franch. Trọng lâu tàu (ii,iii,v) A B C A P. fargesii [25]EB C F vietnamensis [52]D P. G E F G H Hình 1.2. Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam (Hình ảnh thuộc sản phẩm của nhóm nghiên cứu, trong nhiệm vụ quỹ GEN cấp bộ giai đoạn 2016-2019) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Cây Bảy lá một hoa được tìm thấy ở một số tỉnh thành của Việt Nam như Sapa- Lào Cai, Cúc Phương- Ninh Bình, Đại Từ- Thái Nguyên, Tam Đảo - Phú Thọ... và đã được xếp vào Sách Đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN ở mức nguy cấp (tiếng Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng Anh: Vulnerable, viết tắt VU) [4], [10], [12], [20], [21]. Hiện nay tại một số địa phương miền núi phía Bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn đã thành lập Ban chỉ đạo dự án trên cơ sở phân tích các điều kiện khí hậu, đối chiếu với đặc điểm sinh thái cây trồng nhằm đánh giá mức độ thích nghi của một số cây dược liệu đối với điều kiện khí hậu. Từ đó kết hợp với đánh giá tác động môi trường và phân tích chi phí lợi ích để đưa ra những định hướng quy hoạch mở rộng diện tích một số cây dược liệu trong vùng, trong đó có thảo dược Bảy lá một hoa [2],[19], [57]. 1.2. Một số phương pháp định danh thực vật 1.2.1. Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu Trong lịch sử phát triển thực vật học thì hình thái, giải phẫu thực vật phát triển tương đối sớm. Từ những năm 371-286 TCN, Theophraste được gọi là người sáng lập môn thực vật học. Ông đã công bố các dẫn liệu hình thái giải phẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu về cây cỏ” [9]. Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, so sánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẫu trong phòng thí nghiệm, so sánh các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, cuối cùng là phân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét. Để phân biệt các loại tế bào hay thành phần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thường các lát cắt được nhuộm màu và tùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp. Trong phòng thí nghiệm thực vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celulose sẽ nhuộm đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ được nhuộm xanh với lục iod, nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin…[17]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Ở Việt Nam, dưới thời Pháp đô hộ chỉ có công trình nghiên cứu về giải phẫu gỗ của H Lecomte và sau khi miền Bắc được giải phóng năm 1954 thì việc nghiên cứu và giảng dạy hình thái giải phẫu được chú ý nhiều ở các trường phổ thông và đại học. Hiện nay ngày càng có nhiều công trình đi sâu tìm hiểu về hình thái và giải phẫu của các loài thực vật, nhất là những loài thực vật có giá trị làm thuốc và những loài suy giảm nghiêm trọng về số lượng, cần được bảo tồn. Năm 2015, trong “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam” của Phạm Thanh Huyền và đtg đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu khóa phân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa học của các mẫu Hà thủ ô đỏ [9]. Theo đó, nghiên cứu trên 37 mẫu Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson thu tại 10 địa điểm thuộc 8 tỉnh thành, nhóm nghiên cứu đã xác định được ở Việt Nam hiện có 3 thứ của loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson gồm: F. multiflora var. multiflora (Thunb.) Haraldson; F. mutiflora var. angulata (S.Y. Liu) H. J. Yan, Z. J. Fang & S. X. Yu và F. multiflora var. ciliinervis (Nakai) Yonek. & H.Ohashi. Nghiên cứu về hình thái đã giúp các tác giả xây dựng được khóa phân loại cho các thứ của loài này ở Việt Nam. Đã mô tả được chi tiết đặc điểm hình thái loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, cũng như các thứ của loài, cùng với đặc điểm giải phẫu các bộ phận rễ, thân, lá. Kết quả thu được là những dẫn liệu bổ sung cho các tài liệu trong nước về loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, đồng thời đây cũng là dẫn liệu khoa học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển loài Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc ở Việt Nam [9]. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Phong lữ thảo (Pelargonium hortorum L. H. Bailey) của Tạ Lê Mai Hậu và đtg (2016) lần đầu tiên đã mô tả đầy đủ các đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu của loài Phong lữ thảo ở Việt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Nam, góp phần bổ sung thêm bộ cơ sở dữ liệu về lý lịch loài nghiên cứu, làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng từ loài cây này [6]. Sóng rắn là một loài cây thuốc được trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở tỉnh Thái Nguyên. Loài cây này đã được sử dụng như một vị thuốc y học dân gian để chữa một số bệnh như zona và các bệnh ngoài da phổ biến. Với mục đích làm rõ đặc điểm và nâng cao giá trị sử dụng của loài cây này, nhóm nghiên cứu của Nông Thị Anh Thư và đtg (2017) tại trường Đại học Y dược, Đại học Thái Nguyên đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng giảm đau, chống viêm của dược liệu Sóng rắn thu hái tại Thái Nguyên”. Nhóm nghiên cứu đã thu thập, xác định tên khoa học của cây Sóng rắn thu ở Thái Nguyên là Albizia myriophylla Benth., thuộc họ Trinh nữ (Mimosaceae), trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật của cây Sóng rắn ở Thái Nguyên, giúp tránh được việc nhầm lẫn trong thu hái loài cây này làm dược liệu [28]. Việc sử dụng phương pháp so sánh hình thái đã hỗ trợ trong các nghiên cứu để định loài. Trong nghiên cứu của Đỗ Văn Hài và đtg (2017) về chi Bạch hạc (Rhinacanthus Nees) ở Việt Nam đã mô tả đặc điểm nhận biết chi, xây dựng khóa định loại 2 loài là Rh. calcaratus - Kiến cò móc và Rh. nastusus - Kiến. Nghiên cứu cũng đã cung cấp các thông tin tóm tắt về phân bố, sinh học và sinh thái, mẫu nghiên cứu và hình vẽ của các loài thuộc chi này ở Việt Nam [5]. Hay với nghiên cứu của Bùi Hồng Quang và đtg (2017) đã bổ sung thêm một loài vào khóa phân loại các loài thuộc chi Ngân hoa (Silvianthus) ở Việt Nam. Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), Nguyễn Tiến Bân (2005), ở Việt Nam chi Silvianthus có 1 loài là Silvianthus tonkinensis (Gagnep.) Ridsdale. Trong quá trình nghiên cứu các mẫu vật của chi này ở Việt Nam, loài Silvianthus bracteatus Hook. f. trước đây được ghi nhận có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc (Vân Nam), nay được nhóm nghiên cứu phát hiện có phân bố Thanh Hóa (Khu BTTN Pù Hu), Nghệ An (VQG Pù Mát), Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác định được 1 loài bổ sung thêm vào hệ thực vật Việt Nam [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn