Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi Dương đồng (Adinandra)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nhận diện được mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng phương pháp giải phẫu, hình thái; xác định được trình tự đoạn gen matK của loài Adinandra lienii thuộc chi Dương đồng (Adinandra). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi Dương đồng (Adinandra)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KIỀU THỊ TRÀ GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KIỀU THỊ TRÀ GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân Thái Nguyên, năm 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn Kiều Thị Trà Giang XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm TS. Nguyễn Hữu Quân i
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Phạm Văn Khang, giảng viên Khoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Thực vật học và các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thí nghiệm Khoa Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, bộ phận sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài KH&CN Quỹ NAFOSTED “Phân tích thành phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở Việt Nam” mã số 106.02-2018.338. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn Kiều Thị Trà Giang ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... ii MỤC LỤC .............................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................iv DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................vi MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 1 3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra ) ............................. 3 1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra) .................................... 5 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học............... Error! Bookmark not defined. 1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học ................................................................... 8 1.3. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật .........................11 1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc ..................14 1.5. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro ................................16 1.6. Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol...............18 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................21 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................21 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................21 2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...........................................................................................21 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.................................................................22 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................22 2.2.1. Phương pháp phân loại hình thái ..................................................................22 2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật ...................................................................22 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử .....................................................................24 iii
2.2.4. Phương pháp hóa sinh...................................................................................26 2.2.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ................................28 2.2.6. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả ......................................................29 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................................30 3.1. Đặc điểm hình thái ngoài và phân bố của loài Adinandra lienii .....................30 3.2. Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii ....................................................31 3.2.1. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây ........................................................31 3.2.2. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây ..................................................32 3.3. Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii ....................34 3.4. Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây Adinandra lienii ........................................................................................................................39 3.4.1. Định tính polyphenol ....................................................................................39 3.4.2. Định tính các flavonoid ................................................................................40 3.4.3. Định tính các coumarin.................................................................................40 3.4.4. Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A. lienii ...........41 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài Adinandra lienii ........................42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................46 1. KẾT LUẬN.........................................................................................................46 2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................46 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ...............47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................48
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng việt tắt APG II An update of the Angiosperm Hệ thống phân loại thực vật Phylogeny Group classification for the ordors and families of flowering plants Bp Base pair Cặp bazơ nitơ DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA) EC50 Effective dose 50% Liều hiệu quả đáp ứng 50% EDTA Ethylene diamine tetraa acid cetic Etylen diamin tetraxetic Axit ELISA Enzyme linked Thử nghiệm miễn dịch gắn immunosorbentassay enzyme EtOH Ethyl acetatae Hep G2 Hepatocellular carcinoma human Ung thư gan ở người IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể ISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sự sai khác di truyền ở thực vật. ITS Internal transcribed space Vùng gen ITS LB Luria Bertani Môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật matK matK maturase Gen matK MCF-7 Ardeno carcinoma Ung thư vú MeOH Methanol MIC Minimalinhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế MS/MS Mass spectrometry Phương pháp khối phổ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RAPD Random Amplification Đa hình DNA nhân bản ngẫu of Polymorphic DNA nhiên RNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit rRNA RNA ribosome Riboxom RNA TTC Triphenyl tetrazolium Chloride Chỉ thị màu iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam ............................. 3 Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 ...........................................................................10 Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm .................................................21 Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm .........................................................22 Bảng 2.3. Thông tin về cặp mồi nhân gen matK....................................................25 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK ..........................................25 Bảng 3.1. Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích ...36 Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen matK từ loài Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra.............................38 Bảng 3.3. Hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây A. lienii ..................................42 v
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ....................... 4 Hình 1.2. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida ..................... 6 Hình 1.3. Các hợp chất triterpene saponins từ A. nitida .......................................... 7 Hình 1.4. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida ......................................................... 8 Hình 1.5. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro ..................17 Hình 1.6. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh tự ký .......18 Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn các hợp chất từ cây A. lienii ..............................26 Hình 3.1. Hình thái ngoài của cây A.lienii (Ảnh chụp của tác giả thu tại Lào Cai, tháng 3, năm 2018) .................................................................................................30 Hình 3.2. Giải phẫu cắt ngang thân cây A. lienii ...................................................32 Hình 3.3. Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A. lienii .............................................33 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A. lienii ......34 Hình 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A. lienii thu tại Lào Cai..35 Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài A. lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI 36 Hình 3.7. Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A. lienii thu tại Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank..................37 Hình 3.8. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK .................................................................................................................................39 Hình 3.9. Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H2SO4 đặc (b) ..........39 Hình 3.10. Định tính các flavonoid ........................................................................40 Hình 3.11. Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b) ..............41 Hình 3.12. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1 .......................................................................................41 Hình 3.13. Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 ........................................................................41 Hình 3.14. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn B. subtilis .................43 Hình 3.15. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L. plantarum.............43 vi
Hình 3.16. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. aureus...................44 Hình 3.17. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli ........................44 Hình 3.18. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. marcescens ...........45 Hình 3.19. Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S. lutea .....................45
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Vấn đề sức khỏe của con người ngày nay đang bị ảnh hưởng nghiêm trọng trước các biến đổi của khí hậu, ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm dẫn tới xuất hiện các bệnh hiểm nghèo như ung thư. Do đó, việc tìm ra phương pháp hiệu quả để điều trị các bệnh liên quan tới ung thư là vấn đề cấp bách và đặt ra nhiều thách thức lớn cho các nhà khoa học. Trước thực trạng đó, những nghiên cứu để phát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật để sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho người là cần thiết. Trong dự án sàng lọc hoạt tính sinh học của thực vật Việt Nam, dịch chiết của một số loài thuộc chi Dương đồng (Adinandra), họ Chè được dự báo có hoạt tính chống ung thư. Trên thế giới, một số công trình nghiên cứu về các chất hóa học và tác dụng sinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng đã thể hiện phổ hoạt tính kháng viêm, chống độc và giảm đau, chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về chi Adinandra mới chỉ tập trung ở việc thống kê danh sách thành phần loài. Còn về đặc tính sinh học cũng như thành phần hóa học của chúng chưa được nghiên cứu. Hiện nay, một số loài thuộc chi Dương đồng như Adinandra bockiana, Adinandra glischroloma và Adinandra lienii bước đầu được nghiên cứu về vị trí phân bố địa lý. Những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học cũng như trình tự vùng gen matK/ITS của các loài trên chưa được tác giả nào thực hiện. Vì vậy, nghiên cứu về các đặc tính sinh học cũng như xây dựng mã vạch DNA từ một số loài thuộc chi Adinandra, trong đó có loài A. lienii là rất cần thiết. Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi Dương đồng (Adinandra)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nhận diện được mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng phương pháp giải phẫu, hình thái. - Xác định được trình tự đoạn gen matK của loài Adinandra lienii thuộc chi Dương đồng (Adinandra). 1
3. Nội dung nghiên cứu - Xác định đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra lienii. - Phân lập và giải trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài A. lienii. - Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết của loài A. lienii. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra ) Chi Adinandra (thuộc họ Chè Theaceae) thường là cây bụi hay cây nhỡ, có khoảng 85 loài phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [39]. Ở Việt Nam, chi Adinandra đã được tìm thấy có 13 loài, phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia Lai (Bảng 1.1) [9]. Loài Sum Liên Adinandra lienii là loài bản địa được tìm thấy năm 1986 nhưng mới được công nhận vào năm 2012. Loài Sum Hòn Giao Adinandra hongiaoensis mới được phát hiện ở Hòn Giao Lâm Đồng năm 2014 [34]. Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam TT Tên l ài Tên thường gọi Phân bố 1 Adinandra annaenzymesis Sum đỏ Quảng trị 2 Adinandra caudata Sum đuôi Bạch Mã 3 Adinandra donnaiensis Sum đồng nai Đồng Nai 4 Adinandra glischochroma Sum lông Sapa 5 Adinandra hainanensis Sum Hải Nam Hải Ninh 6 Adinandra integerrima Sum nguyên Miền Trung 7 Adinandra microcarpa Sum trái nhỏ Hòn Bà 8 Adinandra millettii Sum millett Sapa, Tam Đảo 9 Adinandra petelotii Sum petelot Sa a 10 Adinandra poilanei Sum poilan Lâm Đồng 11 Adinandra rubropunctata Sum điểm đỏ Tiên Yên, Quảng Trị 12 Adinandra lienii Sum Liên Lào Cai 13 Adinandra hongiaoensis Sum Hòn Giao Lâm Đồng Chi Dương đồng Adinandra thuộc họ Theaceae, bộ Theales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [40]. Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm. Các hợp chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng chữa bệnh như giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau. Đặc biệt, flavonoid đã được 3
tìm thấy trong lá của loài Adinandra nitida, có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, trong các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học. Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y học cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị bệnh ung thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn,.... Cây Sum millett (A. millettii) được sử dụng điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A. integerrima được dùng để trị bong gân, rắn cắn. Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A. Hainanensis (A. rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng [5]. A B C D Hình 1.1. Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) A: A. hongiaoensis, B: A. millettii, C: A. dumosa, D: A. glischroloma 4
Chi Adinandra là cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non có lông nhung. Lá đơn, mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn. Hoa mọc đơn ở nách lá, lưỡng tính, hoa mẫu 5. Lá đài có lông mềm hoặc lông ráp. Cánh hoa không lông hay chỉ có lông ở mặt ngoài. Nhị nhiều, có khoảng 25 nhị. Bao phấn có lông ngắn hoặc dài và có mũi nhọn. Bầu trên, không lông hoặc có lông mềm; noãn nhiều. Quả khô không tự mở; hạt nhiều, nhỏ (Hình 1.1) [40]. 1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra) Ở Việt Nam hiện nay chưa có công bố nào về các loài thuộc chi Adinandra. Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc các nghiên cứu về chi Adinandra thường tập trung ở loài Andinandra nitida. Loài A. nitida là cây thuộc vùng nam Trung Quốc, lá cây được sử dụng lâu năm làm chè uống (Shiyacha) và thuốc dược liệu tốt cho sức khỏe. Loài A. nitida có nhiều tác dụng điều trị như kháng khuẩn, giảm đau, giảm huyết áp. Ở Trung Quốc, loài A. nitida còn được sử dụng trong nhiều công thức bào chế, thang thuốc để điều trị ung thư, chống oxy hóa. Các nghiên cứu về chi Adinandra tập trung vào 02 hướng: (1) Nghiên cứu về thành phần hóa học, (2) Nghiên cứu về hoạt tính sinh học. 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học Lá của cây A. nitida được sử dụng lâu năm làm chè uống và thuốc dược liệu tốt cho sức khỏe, tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài A. nitida. Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của loài A. nitida được phát hiện thuộc nhóm là flavonoid, flavonoid glycoside và triterpene saponin [29], [30], [35], [37]. Năm 2003, Wang và cộng sự đã công bố phân lập được 6 hợp chất apigenin (1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1 (4), nigaichigoside F2 (5), và peduncloside (6) trên tạp chí Trung Quốc (Hình 1.2) [35]. Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại camellianin A từ lá của loài A. nitida Merr. ex Li bằng phương pháp HPLC và chứng minh được khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng phương pháp làm sạch DPPH và các gốc tự do [28]. Cùng hướng nghiên cứu này, 5
Liu và cộng sự (2013) đã phân lập, tối ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và thu được camellianin A từ lá của loài A. nitida; đồng thời chứng minh được khả năng chống oxy hóa của flavonoid ở nồng độ 0,02 mg/ml [27]. Như vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra flavonoid như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin A và camellianin B có hoạt tính sinh học và có khả năng chống oxy hóa. Apigenin (1) Camellianin A (2) Quercitrin (3) Kajiichigoside F1 (4) Nigaichigoside F2 (5) Peduncloside (6) Hình 1.2. Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A. nitida Bằng một số phương pháp sắc ký cột, thành phần hóa học của loài A. nitida đã được Wang và cộng sự (2008) phân lập và xác định được cấu trúc của các hợp chất saponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12 en-28-oic acid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin (7); sericoside (8); glucosyl tormentate (9); nigaichigoside F1 (10) và arjunglucoside I (11). Trong đó chất 2alpha, 3alpha, 6
19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D glucopyranoside là hợp chất mới; các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát hiện trong loài A. nitida [36]. Arjunetin (7) Sericoside (8) Nigaichigoside F1 (9) Glucosyl torenzymetate (10) Arjunglucoside I (11) Hình 1.3. Các hợp chất triterpene saponins từ A. nitida Bên cạnh các nghiên cứu của Wang về thành phần hóa học, một số nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc như Liu B và cộng sự (2010), Zhang J và cộng sự (2006) lại tập trung vào phân tích thành phần flavonoid, thành phần chiếm hàm lượng lớn (> 20%) có trong lá A. nitida với camellianin A là thành phần chính [30], [37]. Theo nghiên cứu của Liu B và cộng sự (2010) , hàm lượng camellianin A, camellianin B và phần aglycon apigenin trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ 41,98; 2,67 và 1,73% tương ứng [30]. Hàm lượng flavonoid chiếm hơn 45% trong dịch chiết EtOH. 7
Sử dụng sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân tích thành phần hóa học đã có hơn 57 chất đã được phát hiện trong dịch chiết MeOH lá A. nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin (13), camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu, khối lượng phân tử và phổ MS/MS (Hình 1.4) [37]. Camellianin A (2) Rhoifolin (13) Camellianin B (14) Epicatechin (12) Hình 1.4. Các hợp chất flavonoid từ A. nitida Một nghiên cứu khác từ Liu năm 2008 về phân tích thành phần hóa học bằng phương pháp GCMS của dịch chiết siêu tới hạn CO2 lá của cây A. nitida và phát hiện được 16 hợp chất với γ-sitosterol là thành phần chính (47,56%). Một số hợp chất khác 3, 7, 11, 15-tetramethyl -2-hexadecen-1-ol, nonacosane, 9, 12- octadecadienal, vitamin E, γ-tocopherol, stigmasterol được phát hiện với hàm lượng từ 2,16-16,98%. Tuy nhiên dịch chiết MeOH thì tương tự như các nghiên cứu khác, chủ yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14) và aglycon apigenin (1) [29]. 1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học Loài A. nitida đã được nghiên cứu các tác dụng sinh học khác nhau như chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển (ACE giảm huyết áp) và chống ung thư [24], [25], [29], [30]. 8
Năm 2010, Liu và cộng sự đã thử tác dụng chống oxy hóa, tác dụng ức chế enzyme chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất chính camellianin A, camellianin B và apigenin. Trong tác dụng chống oxy, kết quả cho thấy IC50 của dịch chiết EtOH, camellianin A, camellianin B và apigenin tương ứng là 14,74 μg/ml, 1,62 mg/ml, 1,8 mg/ml, và 0,95 mg/ml. Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất flavonoid kém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH trong phép thử DPPH và Rancimat (khoảng 100 lần). Kết quả cho thấy tác dụng chống oxy hóa của lá cây A. nitida có thể phụ thuộc vào các thành phần hóa học khác [30]. Về tác dụng giảm huyết áp, ức chế enzyme chuyển (angiotensin converting enzyme ACE) các hợp chất flavonoid camellianin A, camellianin B và apigenin có tác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH. Ở nồng 500 μg/ml, tác dụng ức chế enzyme chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenin tương ứng là 29,7; 30,16; 40,68 và 30,27%. Hoạt tính ức chế enzyme chuyển của dịch chiết EtOH có lẽ phụ thuộc nhiều vào các hợp chất flavonoid [30]. Do lá cây A. nitida được sử dụng để làm chè uống với tác dụng chống ung thư, hợp chất chính camellianin A (hàm lượng được xác định chiếm 19,25% bằng HPLC được thử nghiệm hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào ung thư Hep-G2 và ung thư vú MCF-7. Ở nồng độ 200 μM, camellianin A ức chế 33,8% và 8,7% tế bào ung thư MCF-7 và Hep-G2. Có thể thấy tác dụng độc tế bào của camellianin A là khá yếu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng mật độ tế bào ở giai đoạn G0/G1. Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giai đoạn đầu của quá trình chết tế bào được phát hiện. Như vậy, camellianin A không chỉ ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩy các tế bào đi vào chu trình chết tế bào (apoptosis) [25]. Nghiên cứu của Chen Y và cộng sự (2015) khi so sánh thành phần phenolic của 4 loài thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A. nitida, A. glischroloma var. jubata, A. millettii và A. latifolia về tác dụng chống oxy hóa và so sánh chống ung thư của 4 loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 [24]. Hàm lượng các hợp chất phenolic trong A. nitida cao nhất là 140,54±1,04 mg/g, tiếp đến loài A. millettii (125,96±3,19 mg/g), loài A. glischroloma var. 9
jubata (84,14±2,97 mg/g). Loài A. latifolia có hàm lượng phenolic ít nhất (71,29 ± 2,69 mg/g). Tương tự, thành phần flavonoid có trong loài A. nitida là cao nhất 88,72±2,13 mg/g, tiếp đến là loài A. glischroloma var. jubata (44,74±1,79 mg/g) và loài A. millettii (43,54±1,48 mg/g). Loài A. latifolia có hàm lượng flavonoid ít nhất (19,13 ± 0,54 mg/g). Do vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A. nitida và A. millettii có tác dụng tốt hơn so với loài A. jubata và A. latifolia. Điều này có thể được giải thích là phù hợp với hàm lượng các hợp chất phenolic có trong các loài này. Dịch chiết của các loài Adinandra có các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư. Các dịch chiết có thể ức chế với EC50 từ 1,05- 6,44 mg/ml trên tế bào ung thư gan Hep-G2 và EC50 từ 2,26-8,02 mg/ml trên tế bào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2). Thành phần hợp chất flavonoid của loài A. nitida có chứa camellianin A, camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài A. milettii chưa được phát hiện [24]. Bảng 1.2. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 Loài EC50 (mg/ml) Hep G2 MCF-7 A. nitida 1,49 ± 0,023 2,26 ± 0,19 A. millettii 1,05 ± 0,089 2,43 ± 0,23 A. jubata 1,85 ± 0,056 8,02 ± 0,32 A. latifolia 6,44 ± 0,46 4,01 ± 0,12 Như vậy, tác dụng sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi Adinandra còn chưa rõ ràng, chưa được nghiên cứu sâu. Việc tiến hành nghiên cứu về các loài thuộc chi này là rất cần thiết nhằm hiểu biết thêm về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Dựa trên phương pháp hoạt tính dẫn đường, kết hợp với phương pháp sắc kí phổ hiện đại, các hợp chất mới có tác dụng chống ung thư trong chi Adinandra sẽ được phát hiện. 10