Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:49

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu các định và so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu; xác định đặc điểm hóa sinh liên quan tới hàm lượng protein tan, hoạt tính α-amilase, protease và hàm lượng isoflavone của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu; phân lập và xác định được trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thu được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HẢI YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC, MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata) THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN HẢI YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC, MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata) THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU Ngành: Di truyền học Mã ngành: 8.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân THÁI NGUYÊN - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Hải Yến i
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên trong quá trình làm thí nghiệm. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, Bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhiệm vụ bảo tồn và lưu giữ quỹ gen cấp Bộ năm 2017 “Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen nhóm cây đậu đỗ địa phương thu thập từ các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam” Mã số B2017-TNA-10-QG. Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Hải Yến ii
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................ vi MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 1.1. Sơ lược về cây đậu Nho nhe .................................................................................. 3 1.1.1. Hệ thống phân loại .............................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe .................................................................. 3 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của đậu Nho nhe .......................................................... 3 1.1.4. Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe ........................................................................ 6 1.2. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật ............................... 7 1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu .......................................................... 10 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ................................................................................ 14 2.1.1. Vật liệu .............................................................................................................. 14 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................ 14 2.1.3. Thiết bị .............................................................................................................. 14 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 15 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái ................................................... 15 iii
2.2.2. Phương pháp giải phẫu thực vật ....................................................................... 16 2.2.3. Xác định hoạt tính α-amylase ........................................................................... 16 2.2.4. Xác định hoạt tính protease .............................................................................. 17 2.2.5. Ðịnh lượng protein tan ...................................................................................... 19 2.2.6. Xác định sự sinh trưởng của thân mầm và rễ mầm .......................................... 19 2.2.7. Xác định hàm lượng isoflavone từ mầm đậu Nho nhe ..................................... 19 2.2.8. Phương pháp sinh học phân tử.......................................................................... 21 2.2.9. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả........................................................... 22 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 23 3.1. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu đậu Nho Nhe ......................................... 23 3.2. Đặc điểm hóa sinh của mẫu đậu Nho nhe............................................................ 27 3.2.1. Hàm lượng protein tan tổng số ......................................................................... 27 3.2.2. Hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe ....................................................... 27 3.2.3. Hoạt tính protease từ mầm đậu Nho nhe .......................................................... 27 3.2.4. Hàm lượng isoflavone từ mầm hạt đậu Nho nhe .............................................. 28 3.3. Đặc điểm của vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho Nhe ................................ 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 36 KẾT LUẬN................................................................................................................. 36 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 37 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT............................................................................................. 37 TÀI LIỆU TIẾNG ANH ............................................................................................. 37 iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Amplified Fragments Length AFLP Đa hình độ dài các đoạn khếch đại Polymorphism bp Base pair Cặp bazơ nitơ DNA sợi đôi được tổng hợp từ cDNA Complementary DNA mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA) Ethylene diamine tetraa acid EDTA Etylen diamin tetraxetic Axit cetic ITS Internal transcribed space Vùng gen ITS matK matK maturase Gen matK mRNA Messenger RNA ARN thông tin Nicotinamide adenine Coenzym được sử dụng trong phản NADP dinucleotide phosphate ứng đồng hóa PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Random Amplification RAPD Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên of Polymorphic DNA Restriction Fragment Length RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn Polymorphism RNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit rRNA RNA ribosome riboxom RNA SSR Simple Sequence Repeats Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ..................................................... 14 Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................................................. 15 Bảng 2.3. Chương trình gradient nồng độ của pha động ........................................ . 20 Bảng 2.4. Thông tin về cặp mồi nhân vùng gen ITS .................................................. 21 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR nhân vùng gen ITS ......................................... 22 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái hạt của 02 mẫu đậu Nho nhe ...................................... 24 Bảng 3.2. Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của 2 mẫu đậu Nho nhe.................................................................................................... 28 Bảng 3.3. Đặc điểm hóa sinh của 02 mẫu đậu Nho nhe ....................................... 30 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank ........................................................................................... 34 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ glucosamine theo phương pháp Miller.................. 17 Hình 2.2. Đường chuẩn nồng độ tyrosine .................................................................. 19 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái thân, lá (A), hoa (B), quả (C) và hạt (D) của mẫu đậu Nho nhe ............................................................................................. 23 Hình 3.2. Giải phẫu lá của đậu Nho nhe .................................................................... 25 Hình 3.3. Giải phẫu thân của đậu Nho nhe ................................................................ 26 Hình 3.4. Giải phẫu rễ của đậu Nho nhe .................................................................... 26 Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm 3 ngày tuổi ............................................................................................... 29 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số .......................... 30 Hình 3.7. Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN01-YB (A) và NN10-LC (B)......... 31 Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI ................................. 32 Hình 3.9. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818 trên GenBank ........................................................................ 33 Hình 3.10. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank .................................................................................................. 35 vi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu đỗ là nhóm cây có giá trị dinh dưỡng cao và đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protein. Nguồn gen các nhóm cây đậu đỗ gồm những giống và loài cây hoang dại, cùng những dạng tài nguyên thực vật đáp ứng được yêu cầu của quá trình nghiên cứu và sản xuất nông nghiệp. Nguồn gen của các nhóm cây đậu đỗ được coi là cơ sở sinh học cho vấn đề an ninh lương thực thế giới cũng như ở Việt Nam. Do vậy, nguồn gen các nhóm cây đậu đỗ cần phải được bảo tồn trong một môi trường thuận lợi, ổn định, ít có những biến đổi khắc nghiệt mang tính hủy diệt nguồn gen. Ngày nay, do nhiều nguyên nhân như sự tăng dân số, nhu cầu lương thực và nhu cầu khác của con người ngày càng tăng dẫn đến khai thác đất rừng, đất nông nghiệp và các nguồn tài nguyên một cách quá mức, thiên tai, dịch bệnh và sự phát triển nhanh của các giống mới có năng suất cao dẫn đến nguồn tài nguyên di truyền ở nhiều vùng sinh thái đã suy giảm nghiêm trọng. Sự suy giảm nhanh và mức độ mạnh nhất là các khu vực miền núi khi mùa mưa đến. Trước tình trạng các giống đậu đỗ địa phương, đặc biệt là giống đậu nho nhe đang dần bị thoái hóa và mất dần các đặc tính quý của giống, việc thu thập nguồn gen, xác định đặc điểm sinh học và mã vạch DNA là rất cần thiết. Đậu Nho nhe phân bố rải rác ở một số địa phương thuộc khu vực miền núi phía Bắc trong đó có tỉnh Yên Bái và Lai Châu. Vì vậy, công tác thu thập đậu Nho nhe của 2 địa phương này để có được một tập đoàn giống phục vụ công tác lưu giữ và bảo tồn nguồn gen là mục tiêu cần hướng tới. Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp so sánh hình thái, nghiên cứu sẽ tiến hành đánh giá sự đa dạng ở mức độ DNA và mối quan hệ di truyền giữa các bộ giống nghiên cứu để làm cơ sở bước đầu phát hiện khả năng trùng lặp mẫu giống trong tập đoàn đậu Nho nhe; đồng thời phục vụ công tác bảo tồn, khai thác các nguồn gen đậu Nho nhe địa phương, tiến tới ứng dụng chọn tạo các giống đậu Nho nhe mới phù hợp với nhu cầu thực tiễn. 1
Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích và so sánh được đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Xác định và so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu. (2) Xác định đặc điểm hóa sinh liên quan tới hàm lượng protein tan, hoạt tính α-amilase, protease và hàm lượng isoflavone của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu. (3) Phân lập và xác định được trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thu được. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về cây đậu Nho nhe 1.1.1. Hệ thống phân loại Đậu Nho nhe còn có tên gọi khác là đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng, đậu đà, thua dài. Đậu Nho nhe là loại cây phát triển ở vùng nhiệt đới đặc biệt là Châu Á và được trồng chủ yếu để làm thực phẩm. Hạt và các bộ phận khác của đậu Nho nhe cũng được sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna umbellata, thuộc chi Vigna, họ Fabaceae, bộ Fabales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta. Công thức hoa chung của họ đậu là: ↑ K5C5A10-8-7G1 1.1.2. Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe Đậu Nho nhe là cây thuộc họ đậu có tuổi thọ ngắn (cây một năm), được trồng hàng năm. Thân của đậu Nho nhe thường mọc thay đổi, có thể thẳng đứng, bán thẳng đứng hoặc cuộn lại. Chiều cao của thân cây từ 30-100 cm, một số loài chiều cao thân lên tới 200 cm. Thân cây phân thành nhiều nhánh và có lông mịn phát triển trên thân. Hệ thống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh với một rễ chính phát triển sâu trong đất có chiều dài từ 100-150 cm. Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách, thường là lá kép ba lá chét với chiều dài của lá từ 6-9 cm. Cụm hoa hình chùm, mọc ở nách lá dài từ 5-10 cm, hoa có màu vàng hoặc vàng sáng. Hoa lưỡng tính, đều hoặc không đều, mẫu 5. Hoa thường có 10 nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ. Bộ nhụy gồm có 1 lá noãn với nhiều não đảo hay cong. Quả đậu, phôi lớn và thẳng, hạt không có nội nhũ hoặc nội nhũ kém phát triển. Quả của đậu Nho nhe có hình trụ cong, dài từ 7,5-12,5 cm chứa 6-10 hạt trong quả, hạt lõm một mặt có chiều dài từ 6-8 mm và có màu sắc thay đổi từ vàng xanh đến đen, vàng, nâu. Các loại hạt màu vàng nâu được cho là bổ dưỡng nhất. 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của đậu Nho nhe Độ ẩm: Độ ẩm của hạt đậu Nho nhe liên quan đến sự chín của hạt và sự tích lũy các chất dinh dưỡng trong hạt, đây là một tiêu chí quan trọng góp phần vào quá trình 3
thu hái. Giá trị về độ ẩm trong hạt giống của 13 mẫu đậu Nho nhe phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống và dao động từ 10,32-11,81% [24]. Protein tổng số: Hàm lượng protein tổng số được xác định là hàm lượng nitơ tổng số có trong các nhóm amin của axit amin và vòng dị vòng của histidine, tryptophan, proline và hàm lượng hydroxyproline. Kochhar và Hira (1997) đã phân tích giá trị dinh dưỡng của các giống đậu Nho nhe Vigna radiata và chỉ ra hàm lượng protein thô dao động từ 18,12-26,87% [18]. Tiếp theo là nghiên cứu của Saikia và đồng tác giả (1999) đã chỉ ra sự thay đổi hàm lượng protein trong các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 16,91-18% [27]. Chất lượng dinh dưỡng của 17 loài đậu Nho nhe đã được Srivastava và đồng tác giả (2001) xác định. Hàm lượng protein thô thay đổi từ 20,34-22,97% [28]. Năm 2002, Khabiruddin và đồng tác giả đã phân tích các loài đậu khác nhau thể hiện đặc điểm hóa sinh khác nhau. Sự thay đổi hàm lượng protein tổng số trong hạt chín khô của đậu Nho nhe thay đổi từ 15,83-19,01% [17]. Sadana và đồng tác giả (2006) đã xác định 14 mẫu đậu Nho nhe và chỉ ra hàm lượng protein tổng số giao động từ 17,33-19,92% [24]. Các dữ liệu về năng suất, chất lượng và giá trị bổ sung của các giống đậu Nho nhe đã được Raiger và đồng tác giả (2010) nghiên cứu. Hàm lượng protein tổng số trong các giống đậu Nho nhe được trồng tại các địa điểm khác nhau ở Ấn Độ đạt từ 17,52-21,02% [22]. Trong khi, Katoch (2011) đã xác định 30 dòng đậu Nho nhe liên quan tới các đặc tính sinh lý và dinh dưỡng; đã chỉ ra hàm lượng protein thay đổi từ 16,14-19,13% [16]. Như vậy, hàm lượng protein trong hạt đậu Nho nhe giữa các giống là khác nhau. Chất béo tổng số: Thực phẩm thuộc cây họ đậu gồm đậu Nho nhe có chứa một lượng lớn chất béo không nhìn thấy. Tuy nhiên, thông tin thích hợp liên quan đến sự thay đổi thông số này đã được xem xét trên quan điểm chế độ ăn giống nhau. Năm 1991, Gopalan và đồng tác giả đã báo cáo về giá trị chất béo tổng số dao động từ 0,14-5,63% ở các mức tiêu thụ thông thường ngoại trừ đậu tương. Trong khi hàm lượng chất béo trong các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 3,46-4,03% [12]. Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 mẫu đậu Nho nhe và xác định hàm lượng chất béo dao động từ 1,97-3,73% [28]. Trong khi, báo cáo về hàm lượng chất béo của Sharma (2002) là 0,83% [27]. Năm 2011, Katoch đã phân 4
tích 30 mẫu đậu Nho nhe và xác định hàm lượng chất béo của đậu Nho nhe ở vụ mùa dao động từ 0,57-2,13% [16]. Chất xơ tổng số: Negi và đồng tác giả (2001) [20], Srivastava và đồng tác giả (2001) [28] đã nghiên cứu các thông số hóa sinh trong các giống đậu Nho nhe khác nhau chỉ ra giá trị của các tham số này giao động lần lượt từ 3,87-4,48% và 3,2-4,43%. Năm 2006, Sadana và đồng tác giả đã đánh giá 14 mẫu đậu Nho nhe liên quan tới chất lượng và chỉ ra chất xơ tổng số dao động từ 2,14-3,33% [24]. Trong khi, hàm lượng chất xơ của các mẫu đậu Nho nhe trồng tại Ấn Độ dao động từ 4,85-6,30% [22]. Nghiên cứu của Katoch (2011) trên 30 giống đậu Nho nhe liên quan đến đặc điểm dinh dưỡng và sinh lý học đã chỉ ra hàm lượng chất xơ dao động từ 4,23-6,03% [16]. Carbohydrate và đường hòa tan tổng số: Igbedioh và đồng tác giả (1995) đã phân tích hạt thô của các giống đậu Nho nhe và chỉ ra hàm lượng carbohydrate đạt 59,71-60,69% [14]. Nghiên cứu của Saikia và đồng tác giả (1999) đã chỉ ra hàm lượng đường hòa tan và carbohydrate tổng số của bốn giống đậu Nho nhe dao động lần lượt từ 4,91-5,62% và 52,21-55,03% [27]. Năm 2004, Saharan và đồng tác giả đã chỉ ra hàm lượng đường hòa tan và tinh bột trong các giống đậu Nho nhe lần lượt là 5,62% và 50,71% [25]. Sadana và đồng tác giả (2006) đã chỉ ra hàm lượng carbohydrate trung bình trong các giống đậu Nho nhe khác nhau đạt từ 60,59-63,41% [24]. Trong khi, Katoch (2011) chứng minh hàm lượng carbohydrate trong đậu Nho nhe thay đổi từ 59,28-76,89% [16]. Như vậy, hàm lượng đường hòa tan và carbohydrate tổng số của các giống đậu Nho nhe trồng ở các địa phương khác nhau là khác nhau. Hàm lượng methionin và tryptophan: Sadana và đồng tác giả (2006) đã xác định được hàm lượng methionin và tryptophan của 4 mẫu đậu Nho nhe dao động lần lượt từ 64,53-124,94 mg/gN và 53-102 mg/gN [24]. Trong khi, hàm lượng methionin và tryptophan được Katoch (2011) xác định ở đậu Nho nhe lần lượt đạt 0,52-0,67 g/16gN và 0,85-2,42 g/16gN [16]. Hàm lượng tanin: Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 giống đậu Nho nhe liên quan đến các yếu tố dinh dưỡng và phi dinh dưỡng. Kết quả nhận thấy, 5
hàm lượng polyphenol đạt từ 0,08-0,16% [28]. Năm 2002, Khabiruddin báo cáo sự thay đổi hàm lượng phenolic trong 15 giống đậu Nho nhe dao động từ 0,36-1,78% [17]. Saharan (2002) đã nghiên cứu các thông số lý hóa của các giống đậu tằm và đậu Nho nhe có năng suất cao. Nghiên cứu chỉ ra sự thay đổi hàm lượng polyphenol dao động từ 750-1698 mg/100g [25]. Priya (2005) đã xác định được tannin đặc có trong 30 giống đậu Nho nhe. Hàm lượng tannin đặc được xác định từ 26-105 mg/100g. Dữ liệu được trình bày trong báo cáo thường niên của AICRN về các loại cây trồng đến năm 2010 nhận thấy, hàm lượng tannin tổng số trong các giống đậu Nho nhe dao động từ 510-625 mg/100g [21]. Hàm lượng khoáng: Trong hạt đậu Nho nhe có chứa một số nguyên tố khoáng như canxi, sắt, kẽm. Hàm lượng của các nguyên tố khoáng này phụ thuộc vào từng giống đậu Nho nhe khác nhau. Sadana và đồng tác giả (2006) xác định hàm lượng canxi và kẽm có trong hạt đậu Nho nhe lần lượt đạt từ 0,27-0,35% và 2,19-3,39 mg/100g [24]. Năm 2010, Raiger và đồng tác giả đã xác định được hàm lượng canxi, sắt và kẽm trong các giống đậu tương khác nhau trồng tại Ấn Độ lần lượt đạt từ 307- 379; 3,87-8,95 và 2,55-4,30 mg/100g [22]. 1.1.4. Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe Các loài cây họ đậu là nguồn cung cấp protein rẻ, giàu dinh dưỡng và chất lượng cao; có thể được thay thế cho protein động vật. Các loài cây họ đậu cũng tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng như dược phẩm, chất dinh dưỡng và các sản phẩm phụ thân thiện với sinh thái như tannin, nướu, thuốc sát trùng, nhựa, véc ni, sơn, thuốc nhuộm và dầu diesel sinh học. Ngoài ra, các loài cây họ đậu còn được sử dụng làm thức ăn cho động vật. Các loài cây họ đậu còn góp phần phát triển nền nông nghiệp bền vững: chúng làm giàu nitơ trong đất thông qua các vi khuẩn cộng sinh và đóng vai trò quan trọng trong quá trình xen canh giữa cây ngũ cốc và cây rau [29]. Ở nước ta, đậu Nho nhe thường được trồng nhiều trên các nương ngô, trên đất đồi núi thổ canh, trồng xen canh gối vụ với ngô nương. Có khi cũng được trồng cho leo lên hàng rào quanh nhà, từ vùng đồng bằng tới vùng núi có độ cao 1500m. Cây mọc nhanh, tái sinh khỏe, có khả năng chịu khô hạn. Hạt đậu Nho nhe khô chứa 13,3% hàm lượng nước; 0,9% protein; 64,9% gluxit; 4,8% chất xơ; 4,2% tro. 100g 6
hạt cung cấp năng lượng là 1373 KJ. Ngoài ra trong thành phần hạt đậu còn chứa nhiều canxi, sắt, phốt pho và các loại vitamin nhóm B như thianin, niacin, riboflavon. Năm 1996, de Carvalho và đồng tác giả nhận thấy hàm lượng protein của các loài đậu Nho nhe hoang dại như Vigna minima cao hơn so với các dòng canh tác, vì vậy các loài hoang dại có tiềm năng để cải thiện hàm lượng protein, nâng cao chất lượng giống. Ngoài ra, hàm lượng axit amin tổng số có trong đậu Nho nhe rất tốt cho con người. Đậu Nho nhe là một loại cây giàu dinh dưỡng, nhiều protein cung cấp cho người và gia súc, đồng thời là một cây phân xanh phủ đất rất tốt đối với các cây đồi núi. Cây, lá non và quả non cũng được dùng làm rau ăn. Hạt có giá trị dinh dưỡng cao, dùng làm nhân bánh, nấu chè, thổi xôi, hầm thịt, nấu canh… Ngoài ra để làm thuốc người ta còn sử dụng nó như đậu Đỏ. Ở Ấn Độ, lá đậu Nho nhe cùng với bột gạo được dùng làm thuốc đắp vào bụng để trị đau dạ dày. 1.2. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp phân loại truyền thống này bên cạnh các ưu điểm, trong nhiều trường hợp còn gặp một số khó khăn và hạn chế như: nhiều sinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau); ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác, phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép chúng ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó, sinh vật có thể được định danh và được xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã 7
vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau. Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã. Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1-5,8S-ITS2. Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy. Lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5,8S. Vùng 5,8S khá bảo thủ, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành. Do đó các locus 5,8S có thể phục vụ như là một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận diện. Tiện ích của vùng bảo thủ như 5,8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [27]. Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys (UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của gen trnK và chưa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật [27]. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là hướng nghiên cứu mới. Nhận thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầu tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật,...) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam. Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triển khai ở một số cơ sở nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trung trên một số đối tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về mã vạch DNA. 8
Chi Vigna thuộc họ Fabaceae và được chia thành bảy phân họ, gồm hơn 150 loài phân bố khắp vùng nhiệt đới. Các loài thuộc chi Vigna là các loại đậu thực phẩm có tầm quan trọng kinh tế lớn trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Các đặc điểm hình thái truyền thống của các loài này không có sự khác biệt nhiều. Một vài hệ thống mã vạch DNA đã được sử dụng nhiều năm trong nghiên cứu đa dạng các loài thực vật. Các hệ thống đánh dấu (chỉ thị) thường được sử dụng là: chỉ thị đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP), đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD), đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (AFLP), chuỗi lặp lại đơn giản giữa (ISSRs), Chuỗi lặp lại đơn giản lục lạp (cpSSR). Gần đây, mã vạch DNA đã được sử dụng để xác định dựa vào vùng bảo thủ của hệ gen lục lạp; các vùng bảo thủ này được giải trình tự từ các mẫu giúp cho việc so sánh để phân biệt các mẫu dễ dàng [18]. Do đó, một số locus trong hệ gen lục lạp đã được kiểm tra để xác định mã vạch DNA. Trong đó, việc kết hợp giữa gen rbcL và matK đã được đề xuất là mã vạch thực vật ưa thích [19]. Giống như gen rbcL và matK, các nghiên cứu chứng minh các vùng gen ITS có tiềm năng trong phân loại các loài thực vật, trong đó có các loài thuộc chi Vigna. Năm 2015, Raveendar và đồng tác giả đã sử dụng vùng gen ITS2 và gen matK để phân loại các loài thuộc chi Vigna. Kết quả cho thấy, trong tổng số 298 trình tự từ 52 loài Vigna trong nghiên cứu, đã xác định tỉ lệ 4 loại nucleotit lần lượt là A=23,3±1,5%, T=25,4±4,7%, G=28,5±1,6%, C=22,8±3,4%; chiều dài của vùng gen ITS2 là 413 nucleotit và gen matK là 469 nucleotit. Sử dụng vùng gen ITS2 và gen matK chia 52 loài thành 6 nhóm: nhóm I (gồm các loài và dưới loài của V. friesiorum), nhóm II (các loài của V. membranacea), nhóm III (loài V. schimperi), nhóm IV (các loài V. unguiculata, V. radiate, V. lobatifolia, V. angivensis, V. vexillata), nhóm V (gồm các loài V. hosei, V. racemose, V. fischeri, V. oblongifolia, V. marina, V. luteola) và nhóm VI gồm những loài còn lại [23]. Chen và đồng tác giả (2016) đã sử dụng chỉ thị maker SSR để xác định các loài đậu Nho nhe Vigna umbellata L. Trong nghiên cứu này, khoảng 26 triệu trình tự cDNA từ các loài đậu Nho nhe đã được xác định và được lắp ráp thành 71929 trình tự có chiều dài trung bình khoảng 986 bp. Trong số các trình tự này có 38840 trình tự có 9
sự tương đồng protein và trình tự nucleotit với các trình tự trên NCBI; 3018 trình tự đã được xác định là chỉ thị SSR tiềm năng trong phân loại các loài V. umbellate [10]. Năm 2004, Ba và đồng tác giả đã sử dụng chỉ thị RAPD để xác định 26 giống đậu nho nhe (5 giống thuần chủng và 21 giống địa phương) từ Tây, Đông và Nam Phi. 28 cặp mồi được sử dụng để nhân dòng cho 202 băng; trong đó có 180 băng thể hiện sự đa hình giữa các giống thuần chủng/181 giống địa phương. Kết quả chứng minh được các giống địa phương có sự đa dạng hơn so với các giống thuần chủng [9]. Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta. 1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu trên nhóm cây họ Đậu dựa trên trình tự gen ITS như nghiên cứu của Krishna và đồng tác giả (2015) trên các giống đậu tương về hệ thống phát sinh loài và các mối quan hệ hệ gen dựa trên vùng gen ITS của rDNA. Các mối quan hệ phát sinh loài trong tất cả 18 loài thuộc giống đậu tương Glycine được suy ra từ trình tự nucleotide biến đổi trong vùng đệm (ITS) của rDNA. Hệ số phân ly dao động từ 0,2% (một nucleotide đơn) giữa loài Glycine max và Glycine soja đến 8,6% giữa loài Glycine hirticaulis và Glycine falcata. Độ dài của gen ITS1 và ITS2 dao động tương ứng từ 215-238 nucleotide và từ 205-222 nucleotide, gen 5,8S là 168 nucleotide trên tất cả các loài. Dựa trên nghiên cứu này, nhóm tác giả đã đưa ra các ký hiệu bộ gen mới là HH cho loài Glycine arenaria, HlHl cho loài Glycine hirticaulis, H2H2 cho loài Glycine pindanica, I1 cho loài Glycine albicans, và 1111 cho loài Glycine lactovirens. Nhóm cây đậu đỗ ở Việt Nam đã được một số tác giả nghiên cứu như: Lê Quang Vĩnh (2009) tiến hành “Theo dõi sự phát triển của một số loại cây phân xanh họ đậu trồng xen với cây trồng lâm nghiệp trên vùng gò đồi ở trại Hương Vân, huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế”. Kết quả nghiên cứu nhận thấy các cây phân xanh họ đậu như cốt khí, muông hoa vàng, keo đậu được trồng thành băng giữa hai hàng cây lâm nghiệp. Thời gian đầu các cây phân xanh phát triển chậm (15-20 ngày), sau đó phát triển nhanh dần và sau 30-40 ngày thì phát triển mạnh, nhiều nhánh và phủ 10
đất nhanh. Thời gian che phủ đất của 2 loại cây phân xanh sau 80-90 ngày kể từ khi gieo. Độ ẩm đất trồng cây phân xanh họ đậu lớn hơn so với đối chứng. Năm 2016, Trần Thị Trường và đồng tác giả tiến hành nghiên cứu chọn giống đậu tương kháng bệnh phấn trắng (Microphaera diffusa) nhận thấy, tác nhân gây bệnh phấn trắng trên cây đậu tương tại 6 vùng thu thập mẫu nấm ở Việt Nam là loài nấm có giai đoạn sinh sản vô tính thuộc chi Oidium sp. và xác định được 8 mẫu giống kháng cao; Đã xác định được hệ số tương đồng di truyền giữa 34 giống đậu tương dao động trong khoảng 0,1-0,74 và chỉ ra 3 chỉ thị có liên kết với gen kháng bệnh phấn trắng; Đã chọn được 12 dòng đậu tương triển vọng và khảo nghiệm 2 giống kháng bệnh phấn trắng và năng suất đạt 25,36-26,64 tạ/ha [7]. Hướng nghiên cứu về đa dạng di truyền: Phạm Thị Ngọc và đồng tác giả (2016) đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu cô ve bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR của 60 mẫu giống đậu cô ve thu thập trong nước và nhập nội dựa trên chỉ thị hình thái (đặc điểm thực vật học, nông sinh học) và chỉ thị phân tử SSR. Kết quả phân tích đa dạng di truyền dựa trên 16 chỉ thị hình thái đã phân chia các mẫu giống đậu cô ve thành 7 nhóm với hệ số tương đồng là 0,17. Sử dụng 20 chỉ thị SSR, kết quả phân tích PCR trên các mẫu giống của nghiên cứu, chỉ có 15 chỉ thị xuất hiện băng DNA đa hình và 5 chỉ thị không xuất hiện băng DNA là: BM188, BMd-1, GATS91, C33 và C106. Kết quả thu được tổng số 69 allen đa hình, trong đó chỉ thị BM152 có hệ số đa dạng cao nhất là 0,73. Dựa trên kết quả phân tích ma trận đồng hình, các mẫu giống đậu cô ve có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,57-1. Kết quả chứng tỏ các mẫu giống đậu cô ve thu thập có sự đa dạng cao về mặt di truyền. Nếu mức tương đồng di truyền là 0,69 có thể chia 60 mẫu giống thành 4 nhóm di truyền. Kết quả của nghiên cứu thể hiện khả năng ứng dụng cao của chỉ thị SSR trong phân tích đa dạng di truyền đối với nguồn gen đậu cô ve. Phân tích đa dạng 60 mẫu giống làm cơ sở lựa chọn mẫu giống cho chương trình chọn giống đậu cô ve cho các mục đích khác nhau [4]. Năm 2007, Nguyễn Thị Lang đã sử dụng 30 giống đậu nành từ ngân hàng gen của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu và đánh giá đa dạng nguồn gen. Dùng hai loại chỉ thị phân tử (chỉ thị RAPD và SSR), được thiết lập giữa các 11