Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hạt Nano Chitosan làm tá chất cho Vacxin cúm A/H1N1 và thử nghiệm đáp ứng miễn dịch

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:114

Thêm vào BST

Báo xấu

341
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài: nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt Nano Chitosan đến khả năng hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1, đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng của vacxin cúm A/H1N1 có tá chất là Nano Chitosan.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hạt Nano Chitosan làm tá chất cho Vacxin cúm A/H1N1 và thử nghiệm đáp ứng miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus Swiss) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus Swiss) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 604230 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS TS. Lê Văn Hiệp PGS TS. Nguyễn Anh Dũng BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Nguyễn Thị Ngọc Hà
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn: GS.TS Lê Văn Hiệp – Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, Người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền ñạt kiến thức cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tại Viện Vacxin Nha Trang. PGS.TS Nguyễn Anh Dũng - Trường Đại học Tây Nguyên, Người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền ñạt kiến thức và ñóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Lãnh ñạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo Phòng Đào tạo Sau ñại học, Khoa KHTN và CN. Các thầy Cô giáo ñã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu trong quá trình học tập. Các cán bộ nhân viên Phòng Nghiên cứu và Phòng Kiểm ñịnh Viện Vacxin Nha Trang. Lãnh ñạo và tập thể cán bộ giáo viên trường Trường THPT Trần Phú, TP Buôn Ma Thuột. Cuối cùng xin gửi những tình cảm thân thương tới gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn!
CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC : Antigen- presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) CS : Chitosan DNA : Deoxyribo nucleic Acid FCA : Freund’s complete adjuvant FIA : Freund’s incomplete adjuvant HA: : Haemagglutinin HAU : Haemagglutination Unit (Đơn vị kháng nguyên) HI test : Haemagglutination Inhibition test (Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu) HIU : Haemagglutination Inhibition Unit (Đơn vị hiệu giá kháng thể kháng HA) IgG : Immunoglobulin IVAC : Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang kDa : Kilo Dalton KN : Kháng Nguyên MIC : Nồng ñộ ức chế tối thiểu RNA : Ribonucleic Acid TPP : Tripolyphosphate WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Protein của virus cúm ....................................................................... 18 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano CS ñến hiệu suất hấp phụ (LE) và khả năng hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A H1N1 ........................... 43 Bảng 3.2: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất khác nhau (n=5)................................................................................................ 46 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các loại tá chất khác nhau ñến tỷ lệ ñáp ứng miễn dịch trên chuột với vacxin cúm A/H1N1. ................................................................. 48 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại tá chất ñến hiệu giá kháng thể trung bình của chuột (n = 9) ..................................................................................................... 50 Bảng 3.5: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất nano chiotsan có khối lượng phân tử khác nhau (n=5) ...................................... 54 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử tá chất nano CS cho vacxin cúm A/H1N1 ñến tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch trên chuột ............................................... 56 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử tá chất nano CS của vacxin cúm A/H1N1 ñến hiệu giá kháng thể trung bình (HIU) ........................................... 57 Bảng 3.8: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất nano CS có khối lượng phân tử khác nhau (n=5) .............................................. 60 Bảng 3.9 ảnh hưởng của liều lượng vacxin cúm A/H1N1 khi sử dụng tá chất nano chitosan ñến ñáp ứng miễn dịch trên chuột .............................................. 62
Bảng 3.10: ảnh hưởng của liều lượng vacxin cúm A/H1N1 khi sử dụng tá chất nano CS ñến ñáp ứng miễn dịch trên chuột ....................................................... 63 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản vacxin hấp phụ trên hạt nano CS ñến ñáp ứng miễn dịch trên chuột .................................................................... .66 Bảng 3.12: Kết quả kháng thể kháng HA trên chuột sau khi tiêm vacxin chứa tá chất nano CS ñược bảo quản trong khoảng thời gian khác nhau ....................... 67
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo của nano chitosan .................................................... 3 Hình 1.2: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion. .................. 7 Hình 1.3: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa. ........................ 8 Hình 1.4: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp sấy phun. ..................... 9 Hình 1.5 : Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp mixel ngược pha........ 10 Hình 1.6 : Cấu tạo của Virus cúm typ A .............................................................. 16 Hình 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến hiệu suất hấp phụ (LE) kháng nguyên cúm A/H1N1........................................................... 44 Hình 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến khả năng hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A H1N1. ......................................................... 44 Hình 3.3: Tăng trọng chuột của các lô vacxin cúm A/H1N1 hấp phụ các loại tá chất khác nhau ..................................................................................................... 47 Hình 3.4 : Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch của vacxin cúm A/H1N1 với tá chất nano chitosan và các tá chất khác. ....................................................................... 49 Hình 3.5: Ảnh hưởng của các nhóm tá chất ñến hiệu giá kháng thể trung bình trên chuột nhắt. .................................................................................................... 51 Hình 3.6: Kết quả tăng trọng của chuột ở các nhóm vacxin có tá chất nao chitosan khác nhau. ............................................................................................. 55
Hình 3.7: Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ñối với các nhóm vacxin sử dụng tá chất nano chitosan với khối lượng phân tử khác nhau .......................................... 57 Hình 3.8: Hiệu giá kháng thể trung bình ở các nhóm vacxin sử dụng tá chất nano chitosan với khối lượng phân tử khác nhau.......................................................... 58 Hình 3.9: Tăng trọng trung bình của chuột ở các nhóm vacxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau ..................................................................................... 61 Hình 3.10: Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ở các nhóm vacxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau ..................................................................................... 62 Hình 3.11: Hiệu giá kháng thể trung bình ở các nhóm vacxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau ..................................................................................... 64 Hình 3.12: Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ở các nhóm vacxin có thời gian bảo quản sau hấp phụ khác nhau ................................................................................ 66 Hình 3.13: Hiệu giá kháng thể trung bình ở các nhóm vacxin có thời gian bảo quản sau hấp phụ khác nhau .............................................................................. 68
1 PHẦN MỞ ĐẦU Những năm 1918-1919, thế giới ñã xảy ra ñại dịch cúm “Tây Ban Nha” do virus cúm týp A/H1N1 gây ra. Đây thực sự là cơn ác mộng cho loài người vì chỉ trong vài tháng ñã có hơn 1 tỉ người mắc bệnh (chiếm 1/2 dân số thế giới thời kì bấy giờ) và cướp ñi sinh mạng của hơn 20 triệu người, gấp ñôi số tử vong trong chiến tranh thế giới thứ nhất. Mới ñây nhất ñại dịch cúm 2009 là dịch cúm do một loại virus thuộc chủng A/H1N1, lần ñầu tiên ñược các cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009. Sự bùng phát căn bệnh giống như bệnh cúm ñã ñược phát hiện lần ñầu ở ba khu vực thuộc Mexico và lây lan rất nhanh. Theo tổ chức Y tế thế giới, tính ñến ngày 12 tháng 6 năm 2009 ñã có 29669 trường hợp ñược xác ñịnh nhiễm cúm A/H1N1 tại 74 quốc gia và ñã có hàng trăm người chết. Tính ñến ngày 10/02/2010, Việt Nam cũng ñã ghi nhận 11.186 trường hợp dương tính với cúm A/H1N1 và 58 trường hợp tử vong. Đại dịch cúm xảy ra tác ñộng rất lớn ñến nền kinh tế, sức khoẻ, tính mạng của con người cũng như các hoạt ñộng xã hội khác nên việc nghiên cứu, sản xuất vacxin và thuốc kháng virus là hai mục tiêu lớn mà nhiều quốc gia ñang hướng tới. Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất ñể phòng ngừa, kiểm soát và ñẩy lùi bệnh dịch nói chung và bệnh cúm nói riêng. Hiện nay, trên thế giới năng lực sản xuất vacxin phòng cúm chỉ ñáp ứng 10% dân số khi ñại dịch xảy ra. Vì thế mục tiêu nghiên cứu hiện nay là sản xuất loại vacxin có hiệu giá cao, rẻ và an toàn khi sử dụng. Hiệu quả miễn dịch và giá thành của vacxin lại phụ thuộc rất lớn vào tá chất. Một số tá chất thường ñược sử dụng cho người Al(OH)3, MF59, chitosan,….Vì vậy, việc nghiên cứu loại tá chất cho vacxin là rất cần thiết trong sản xuất vacxin.
2 Hạt nano chitosan an toàn sinh học, tương hợp sinh học, có kích thước nanomet, mang ñiện tích dương và dễ dàng ñi qua màng tế bào nên có thể mang vacxin, nhất là vacxin qua niêm mạc mũi với tính an toàn, hiệu quả và ñáp ứng miễn dịch cao, kéo dài. Hạt nano chitosan với những ñặc tính ưu việt như: khả năng tương hợp sinh học, hỗ trợ ñiều hoà miễn dịch, ñược enzyme trong cơ thể phân hủy... Vì vậy trong y học, hạt nano chitosan ñược sử dụng phổ biến ñể mang thuốc, protein, vacxin, kháng khuẩn, làm vector chuyển gen... Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi sử dụng hạt nano chitosan làm ñối tượng nghiên cứu với tên ñề tài “Nghiên cứu hạt nano chitosan làm tá chất cho vacxin cúm A/H1N1 và thử nghiệm ñáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng (Mus musculus Swiss)” Mục tiêu của ñề tài 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến khả năng hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1. 2. Đánh giá tính an toàn và ñáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng của vacxin cúm A/H1N1 có tá chất là nano chitosan.
3 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về chitosan Hình 1.1: Công thức cấu tạo của nano chitosan Chitosan là một biopolymer (polyglucosamine), là sản phẩm deacetyl của chitin, một polysaccharide có trong thành phần cấu trúc của các loài giáp xác như tôm, cua, côn trùng và vách tế bào nấm. Chitin có cấu tạo tương tự cellulose, nhưng có sự khác biệt là ñơn vị cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các ñơn vị này nối với nhau bằng liên kết β-1-4-glycoside. Tính chất và hoạt tính sinh học của chitin và chitosan phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử (Mw) và mức ñộ deacetyl hóa (DD: degree of deacetyllation). Mức ñộ deacetyl hóa dùng ñể chỉ % số nhóm acetyl trong phân tử chitin, chitosan bị khử. Mức ñộ deacetyl hóa tỉ lệ thuận với mật ñộ của nhóm NH3+ trong phân tử do ñó ảnh hưởng tới tính chất ña ñiện và ñộ tan của chitin, chitosan. Mức ñộ deacetyl trung bình của chitin nằm trong khoảng 10-15%. Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một
4 phần (partially deacetyl chitin) có mức ñộ deacetyl hóa từ 30-40%. Trong khi ñó chitosan phải có mức ñộ deacetyl hóa >50%. Nhờ ñó chitosan mới dễ tan trong một số axit hữu cơ loãng như axit acetic, axit lactic, axit glutamic, axit chlohydric. Khi hoà tan chitosan trong môi trường axit, nhóm amine của chuỗi nhận proton và chuyển sang mang ñiện tích dương. Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể ñược xác ñịnh bằng HPLC. Tuy nhiên phương pháp nhanh nhất và ñơn giản nhất là ño ñộ nhớt dựa vào các hằng số và K trong phương trình Mark- Houwink: a -3 0.93 [η ] = K.M = 1.81x10 M Trong ñó: η là ñộ nhớt biểu kiến của chitin, M là khối lượng phân tử Chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau từ 50-2000kDa, ñộ nhớt khác nhau (1% chitosan trong axit acetic 1% có ñộ nhớt
5 - Không gây ñộc do các sản phẩm sau thuỷ phân ñều là các chất chuyển hoá tự nhiên. - Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hoà miễn dịch. - Có thể sử dụng dưới nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt, màng, tấm xốp (scaffolds), bông, sợi và gel [3], [26]. 1.2. Tổng quan về nano chitosan Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet. Chitosan nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng ñi qua màng tế bào, có diện tích bề mặt lớn và mang ñiện nên ñược ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, mang vacxin, trong công nghệ sinh học ñược dùng làm vector chuyển gen. 1.2.1 Các phương pháp tạo hạt nano chitosan Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo chitosan nanoparticles. Theo Sulnin (2004) có 5 phương pháp chủ yếu ñể tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt (coacervation) trong NaOH-methanol, phương pháp sấy phun (dry spraying), phương pháp tạo gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây (sieving method). Trong ñó phổ biến nhất là phương pháp tạo hạt gel trong tripolyphosphate [29]. Quan Gan (2005) nghiên cứu các yếu tố ảnh huởng ñến kích thước hạt nano chitosan như nồng ñộ chitosan, pH dung dịch, tỷ lệ chitosan: tripolyphosphate,... [25]. Anna Vila (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến kích thước hạt nano [34]. Ngoài ra, còn nhiều nghiên cứu khác của Ming Lang Tsai (2008), Yavuz (2007), Jing Mou Ju (2008),...
6 1.2.1.1. Phương pháp tạo hạt nano chitosan bằng liên kết cộng hoá trị Ohya ñã nghiên cứu tạo hạt nano chitosan ñể nhốt thuốc chống ung thư 5- FU bằng cách cho dung dich chitosan khâu mạch cộng hóa trị với glutaraldehyde. Nhóm kép –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm – NH2 của chitosan ñể khâu mạch (cross – linking) tạo hạt nano chitosan. Phương pháp này có ưu ñiểm là kích thước và tính chất hạt nano rất ổn ñịnh [14]. 1.2.1.2. Phương pháp tạo gel ion Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan ñiện tích dương và TPP, polyacrylic axit, polyaspartic, plasmid DNA (pDNA) mang ñiện tích âm. Để tạo hạt nano chitosan – TPP : dung dich chitosan ñược hỗn hợp với TPP sau ñó khuấy từ 10 – 60 phút sẽ thu ñược hạt nano chitosan. Có thể li tâm 15000 vòng/ phút trong 1 giờ ñể thu ñược hạt nano chitosan nanoparticles. Quan Gan (2005) nghiên cứu tạo hạt chitosan nanoparticles trong TPP với nồng ñộ chitosan khác nhau, khối lượng phân tử chitosan khác nhau và tỉ lệ chitosan/TPP khác nhau. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử và nồng ñộ chitosan càng lớn thì kích thước hạt chitosan nanoparticles cáng lớn. Thí nghiệm cho thấy tỉ lệ chitosan/TPP càng lớn thì kích thước hạt chitosan nanoparticles càng lớn. pH cũng có những ảnh hưởng nhất ñịnh ñến kích thước hạt, pH thích hợp nhất ñể tạo hạt là 5,5 [25].
7 Hình 1.2: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion. 1.2.1.3. Phương pháp tạo giọt coasecva ( phương pháp kết tủa ) Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch có pH kiềm tính. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH – Methanol ethanediamine. Dung dịch chitosan sẽ ñược một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm ñể tạo hạt nano như hình . Phương pháp này có thể ñược cải tiến hơn bằng cách nhỏ giọt dung dịch sodium sulfate vào dung dịch chitosan (pH axit) trong ñiều kiện khuấy nhẹ có tác ñộng của sóng siêu âm (ultrasonic). Hạt nano ñược thu bằng cách li tâm, sau ñó tiếp tục bước làm cho cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde.
8 Hình 1.3: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa. 1.2.1.4. Phương pháp sấy phun (Spray- drying) Sấy phun là kĩ thuật thường ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm ñể tạo bột, tạo hạt thực phẩm như sữa, tạo bột thuốc với tá dược. Kĩ thuật này dựa trên nguyên tắc huyền phù ñược làm khô khi ñược phun trong dòng khí nóng. Chitosan ñược hòa tan thành dung dịch, dược phẩm ñược hòa tan vào dung dịch chitosan, sau ñó ñược bổ sung hoạt chất khâu mạch và ñược phun vào dòng khí nóng như sơ ñồ hình 1.4 [25].
9 Hình 1.4: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp sấy phun 1.2.1.5. Phương pháp tạo mixel ngược pha Trong phương pháp này, các chất hoạt ñộng bề mặt ñược hòa tan trong dung môi hữu cơ ñể tạo hệ mixel ngược pha. Sau ñó, dung dịch chitosan ñược thêm vào và khuấy ñều ñể tránh bị ñục, thêm dung dịch chất khâu mạch. Tiếp tục khuấy ñều qua ñêm. Sau ñó cho bay hơi dung môi hữu cơ và chất hoạt ñộng bề mặt ñược kết tủa bằng muối, cuối cùng hỗn hợp ñược li tâm và thu ñược hạt nano như trong hình 1.5[25].
10 Hình 1.5 : Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp mixel ngược pha Ngoài ra hạt nano chitosan khi phối hợp với polyethylene glycon (PEG) hoặc ñược phủ một lớp alginate sẽ tăng hiệu quả vacxin viêm gan B qua ñường uống (Boges, 2007) [11]. Kích thước hạt nano nằm trong khoảng 100nm. Sarmento (2006) cũng sử dụng phương pháp này ñể nhốt hormone insulin. 1.3. Một số ứng dụng của chitosan, nano chitosan trong y học Chitosan với những ñặc tính ưu việt, là sản phẩm tự nhiên, không ñộc, có khả năng phân hủy sinh học. Đồng thời Chitosan còn có các hoạt tính sinh học cao như kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào, giảm cholesterol trong máu, ức chế khối u phát triển, kháng vi sinh vật....Hayashi nghiên cứu sử dụng chitosan khối lượng phân tử thấp ứng dụng ñiều trị béo phì và tiểu ñường typ 2. [13]. Trong những năm gần ñây nhiều nghiên cứu chế tạo vật liệu chitosan microparticles, nanoparticles, chitosan microspheres ñể làm tăng hoạt tính thuốc, ly giải chậm thuốc, mang thuốc ñến tế bào ñích, tăng hoạt tính kháng ung thư,