Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho 2 dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 - Giống lai giữa Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

58
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giống là một trong những khâu quan trọng nhất của sản xuất nông lâm nghiệp, đặc biệt cây rừng có đời sống dài ngày, lâu thu hoạch sản phẩm, diện tích canh tác lớn và khó có điều kiện áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh như các cây nông nghiệp. Luận vawn tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho 2 dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 - Giống lai giữa Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho 2 dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 - Giống lai giữa Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- PHAN QUYỀN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHO HAI DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UP54 VÀ UP99: GIỐNG LAI GIỮA BẠCH ĐÀN URO(Eucalyptus urophyla) VÀ BẠCH ĐÀN PELLITA (Eucalyptus pellita) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2014 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- PHAN QUYỀN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHO HAI DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UP54 VÀ UP99: GIỐNG LAI GIỮA BẠCH ĐÀN URO(Eucalyptus urophyla) VÀ BẠCH ĐÀN PELLITA (Eucalyptus pellita) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nghiêm Quỳnh Chi Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii Sau một thời gian thực hiện đề tài, đến nay tôi đã hoàn thành đề tài của mình. Nhân dịp này cho phép tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nghiêm Quỳnh Chi là người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới lãnh đạo, tập thể cán bộ, nhân viên, đặc biệt các anh, chị, em Bộ môn CNTB thực vật của Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học lâm nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và làm nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học lâm nghiệp Do tôi là cộng tác viên của đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh một số giống keo và Bạch đàn mới bằng công nghệ tế bào thực vật’’ và được sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài nên các số liệu trong luận văn có sử dụng một phần kết quả nghiên cứu của đề tài Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Phan Quyền MỤC LỤC Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii Trang ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................... 5 1.1. Phân bố tự nhiên và khả năng sinh trƣởng của đối tƣợng nghiên cứu. ................................................................................................................ 5 1.1.1. Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T.Blake).............................. 5 1.1.2. Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita F. Muell) ................................. 6 1.2. Khả năng lai giống và tiềm năng sử dụng giống lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn pellita ................................................................................ 8 1.3. Khái niệm và cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................................................................ 10 1.3.1. Khái niệm ........................................................................................ 10 1.3.2. Cơ sở khoa học ............................................................................... 11 1.3.2.1. Tính toàn năng của tế bào ........................................................... 11 1.3.2.2 .Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào .................................. 11 1.3.2.3. Môi trường dinh dưỡng................................................................ 12 1.4. Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................. 12 1.4.1. Ưu nhược điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.4.2. Các giai đoạn trong quy trình nuôi cấy mô .................................... 13 1.4.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô .......................... 15 1.4.4. Những vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro và giải pháp khắc phục .................................................................................................. 21 1.5. Thành tựu của công nghệ nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây lâm nghiệp ............................................................................................ 22 1.5.1. Ngoài nước ...................................................................................... 22 1.5.2. Trong nước ...................................................................................... 25 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv Chƣơng 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 28 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................... 28 2.1.1 Mục tiêu chung ................................................................................ 28 2.1.2 Mục tiêu cụ thể ................................................................................ 28 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 28 2.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 28 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 29 2.4.1 Vật liệu nuôi cấy .............................................................................. 29 2.4.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm .......................................... 29 2.4.3 Phương pháp tiến hành .................................................................... 29 2.5 Các bƣớc nhân giống in vitro cho Bạch đàn lai UP54 và UP99 ...... 31 2.5.1 Các công thức thí nghiệm ................................................................ 31 2.5.2 Thu thập và xử lý số liệu ................................................................. 34 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 38 3.1 Xác định phƣơng pháp khử trùng thích hợp .................................... 38 3.1.1 Ảnh hưởng của hóa chất, nồng độ và thời gian tới kết quả khử trùng ................................................................................................................... 38 3.1.2 Ảnh hưởng của thời điểm lấy mẫu trong năm tới kết quả khử trùng ................................................................................................................... 41 3.2 Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản ................................................ 43 3.3 Ảnh hƣởng của chế độ nuôi sáng – tối tới kết quả nhân chồi .......... 44 3.4 .Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi ............................. 47 3.4.1. Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) ........................................................................................... 48 3.4.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kinetin (Kn) đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu ................................................................................ 50 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v 3.5. Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi ............................... 53 3.5.1. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + NAA đến HSNC và TLCHH ..................................................................................................... 53 3.5.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + IAA đến HSNC và TLCHH. ................................................................................................................... 55 3.6 Xác định môi trƣờng ra rễ .................................................................. 57 3.6.1 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của Bạch đàn lai UP54 và UP99.......................................................................................................... 57 3.6.2. Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến hiệu quả ra rễ của Bạch đàn lai UP54 và UP99 ............................................................................... 59 3.6.3. Ảnh hưởng phối hợp của IBA + NAA đến hiệu quả ra rễ bạch đàn lai UP54 và UP99...................................................................................... 61 3.6.4. Ảnh hưởng phối hợp của IBA và IAA đến hiệu quả ra rễ bạch đàn lai UP54 và UP99...................................................................................... 63 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ cây sống và chiều cao của cây con ở vƣờn ƣơm ..................................................................... 65 3.8. Thảo luận chung .................................................................................. 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 72 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nghĩa đầy đủ BAP 6- Benzyl Amino Purine HSNC Hệ số nhân chồi B5 Môi trường Gamborg BT Bình thường Ca(OCl)2 Hypoclorit canxi GA3 Gibberellic Acid H2O2 Ôxi già HgCl2 Clorua thuỷ ngân IAA Indol 3- Acetic Acid IBA Indol Butiric Acid Kn Kinetin MS* Môi trường MS cải tiến NAA Naphthy acetic Acid NaClO Hypoclorit natri PVP Polyvinyl Pyrrolidone Sd Sai tiêu chuẩn mẫu Tb Trung bình UP E. urophylla x E. pellita TLBCHH Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu TLCHH Tỷ lệ chồi hữu hiệu WPM Môi trường cho cây thân gỗ Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1 Kết quả thí nghiệm khử trùng mẫu cho bạch đàn lai: UP54 và 39 UP99 (sau 25 ngày khử trùng) 3.2 Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi bạch đàn 42 lai UP54 và UP99 (sau 25 ngày khử trùng) 3.3 Ảnh hưởng của loại môi trường đến khả năng nhân chồi bạch 43 đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy chuyển) 3.4 Ảnh hưởng của chế độ nuôi sáng – tối tới kết quả nhân chồi 45 Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.5 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu 49 hiệu Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày nuôi cấy) 3.6 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn đến HSNC và TLCHH 51 Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày nuôi cấy) 3.7 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + NAA đến HSNC và 54 TLCHH Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.8 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + IAA đến HSNC và 55 TLCHH Bạch đàn lai UP54 và UP99(sau 15 ngày cấy) 3.9 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của Bạch đàn lai 58 UP54 và UP99(sau 15 ngày cấy) 3.10 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT đến hiệu quả ra rễ 60 Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày) 3.11 Ảnh hưởng phồi hợp của IBA + NAA đến hiệu quả ra rễ 62 Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.12 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và IAA đến hiệu quả ra rễ Bạch 63 đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy) 3.13 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ cây sống và 66 chiều cao của cây con ở vườn ươm (sau 1 tháng cấy vào giá thể) Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
viii DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1.1 Phân bố tự nhiên của bạch đàn urô 6 1.2 Phân bố tự nhiên của bạch đàn pellita 7 3.1 Cây vật liệu dùng để vào mẫu, sau khi đã được tuyển chọn dẫn 41 giống về trồng ở vườn ươm 3.2 Các chồi bất định Bạch đàn lai UP54 và UP99 sau 25 ngày khử 41 trùng 3.3 Ảnh hưởng của chế độ nuôi sáng- tối tới hiệu quả nhân chồi 47 dòng UP99 3.4 Ảnh hưởng của BAP và Kn tới khả năng nhân chồi cho bạch 52 đàn lai UP99(sau 15 ngày nuôi cấy) 3.5 Chồi Bạch đàn lai UP54(trái) và UP99(phải) trong các môi 56 trường nâng cao chất lượng chồi 3.6 Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ của bạch đàn lai UP99 59 3.7 Bình ra rễ của Bạch đàn lai UP54 và UP99 64 3.8 Ảnh hưởng của ABT, IAA và NAA đến hiệu quả ra rễ của 65 bạch đàn lai UP54 3.9 Bạch đàn ra rễ được huấn luyện trước khi cấy vào giá thể 67 3.10 Cây con UP54 và UP99 ngoài vườn ươm 67 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống là một trong những khâu quan trọng nhất của sản xuất nông lâm nghiệp, đặc biệt cây rừng có đời sống dài ngày, lâu thu hoạch sản phẩm, diện tích canh tác lớn và khó có điều kiện áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh như các cây nông nghiệp, nên việc sử dụng giống có chất lượng di truyền được cải thiện, phù hợp với mục tiêu kinh tế được đặt ra và phù hợp với từng vùng sinh thái là vô cùng quan trọng. Các hoạt động cho một chương trình cải thiện giống cây rừng tuần tự như sau: Chọn lọc và khảo nghiệm loài  xuất xứ  chọn lọc cây trội  xây dựng rừng giống và vườn giống  lai giống  nhân giống  rừng trồng mới. Như vậy có thể thấy nhân giống là khâu cuối cùng trong công tác giống, song rất quan trọng bởi nó giúp cung cấp giống với số lượng lớn và chất lượng di truyền ổn định, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng. Có hai phương pháp nhân giống chủ yếu, đó là (i) nhân giống hữu tính (bằng hạt), được thực hiện ở các cấp khác nhau (rừng giống hay vườn giống); (ii) nhân giống sinh dưỡng bằng hom và bằng mô tế bào. Tuỳ từng đối tượng cụ thể mà áp dụng phương pháp nhân giống thích hợp nhằm đưa lại hiệu quả cao nhất. Tuy nhiên, nhân giống sinh dưỡng hiện được dùng phổ biến để cung cấp cây giống với số lượng lớn và chất lượng ổn định cho trồng rừng thương mại, bởi nhân giống sinh dưỡng là phương thức nhân giống dựa trên cơ sở của phân bào nguyên nhiễm, lối phân bào không có sự tái tổ hợp của thể nhiễm sắc trong quá trình phân chia, do đó cây hom hoặc cây mô sẽ giữ được các đặc tính di truyền của cây giống, đặc biệt là để nhân các dòng cây lai đời F1. Hiện nay, nhân giống sinh dưỡng bằng phương pháp nuôi cấy mô (tissue culture) được xem là giải pháp công nghệ hàng đầu bởi từ một mẫu nuôi cấy, chủ yếu là các bộ phận tách rời của thực vật (các mô phân sinh như mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm – 1,0 cm) có thể tạo ra hàng triệu Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 cây con đồng nhất về kiểu gen nếu đủ thời gian cấy chuyển. Tuy nhiên, cây lâm nghiệp (cây thân gỗ) với đặc tính khó phát sinh hình thái trong điều kiện nuôi cấy vô trùng (in vitro) (so với cây thân thảo) do tốc độ phát triển của chồi nuôi cấy hoặc mô sẹo (callus) cũng như sự tái sinh các mô nuôi cấy là rất chậm và bất ổn, thì việc nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô cho từng đối tượng loài/ giống/ dòng cụ thể là bắt buộc. Đối với các loài Bạch đàn, xu thế sử dụng giống lai, đặc biệt lai khác loài, là rất phổ biến để tận dụng ưu thế lai (heterosis hoặc hibrid vigour) gia đình (tổ hợp lai) và cá thể do bố mẹ thường ở thể dị hợp tử (Lê Đình Khả 2001). Tuy nhiên, ưu thế lai thường biểu hiện rõ rệt ở đời F1, có tính phân ly hết sức đa dạng ở các đời sau (từ F2). Vì thế, muốn sử dụng giống lai một cách có hiệu quả phải chọn lọc cẩn thận các cây lai, tiến hành nhân giống sinh dưỡng và khảo nghiệm dòng vô tính để chọn dòng có ưu thế lai cao nhất. Phần lớn các giống lai Bạch đàn được khảo nghiệm và phát triển đều là thế hệ đầu tiên (F1) của lai tự nhiên (lai ngẫu nhiên) hoặc lai có kiểm soát. Các giống Bạch đàn lai được phát triển thành giống thương mại hiện nay là giống lai thuận nghịch của E. grandis và E. urophylla, E. grandis và E. camaldulensis, và lai một chiều của các loài E. urophylla, E.saligna, E. pellita, E. exserta, E. degluptus và E. Tereticornis (Dungey H.S. and Nikles D.G. 2000). Các giống lai này chiếm phần lớn trong hơn 25 triệu ha diện tích rừng trồng Bạch đàn trên thế giới, và đã góp phần nâng cao năng suất rừng trồng và đóng một vai trò rất quan trọng trong sản xuất lâm nghiệp cung cấp gỗ nguyên liệu cho sản xuất bột giấy, ván nhân tạo, ván bóc, gỗ xẻ và sợi cellulose cho công nghiệp dệt. Để cung cấp cây giống chất lượng cao, đồng đều và với số lượng lớn cho trồng rừng sản xuất, nghiên cứu nuôi cấy mô cho các loài Bạch đàn đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Nam Phi, Ấn Độ, Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 Thái Lan. Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn E. camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana. Cây mô có nguồn gốc từ cây ưu việt sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Ở Trung Quốc đến nay đã có hàng chục xưởng nuôi cấy mô của các công ty trồng rừng cũng như các vườn ươm tư nhân chuyên nhân giống các dòng Bạch đàn lai phục vụ trồng rừng với tổng công suất khoảng 300 triệu cây mô sản xuất hàng năm (Xu Jianmin-trao đổi). Ở Thái Lan, công ty AA và công ty SCG cũng có hàng chục nhà nuôi cấy mô chuyên nhân giống các dòng Bạch đàn lai K7, H4, K62 với tổng công suất khoảng 30 triệu cây mô được sản xuất hàng năm. Ở Việt Nam, giống Bạch đàn lai đầu tiên được phát hiện là giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và Bạch đàn đỏ (E. robusta) vào cuối những năm 1960 tại các tỉnh miền Bắc có thể tích thân cây gấp 3 – 4 lần các loài cây bố mẹ (Lê Đình Khả, 1970) [5]. Bắt đầu từ những năm 1990, nghiên cứu lai giống cho các loài Bạch đàn uro (E. urophylla), Bạch đàn camal (E. camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E. exserta) được tiến hành (Nguyễn Việt Cường và ctv 2002). Kết quả đánh giá cho thấy các giống lai khác loài này đã thể hiện ưu thế lai về sinh trưởng rất rõ rệt, so với các loài bố mẹ, đặc biệt là hậu thế thụ phấn tự do của các cây bố mẹ tham gia lai giống, (Nguyễn Việt Cường, 2002). Đến năm 2000, Bạch đàn pellita (E. pellita) bắt đầu được quan tâm trong nghiên cứu lai giống do đặc tính sinh trưởng nhanh, hình dạng thân đẹp và có khả năng chống chịu sâu bệnh hại tốt. Những tổ hợp lai thuận nghịch UP (Eucalptus urophylla × pellita) và PU (E. pellita × urophylla) đã được tạo ra và khảo nghiệm giống lai đã được xây dựng trên một số lập địa ở miền Bắc và Bắc Trung bộ. Năm 2012, trên cơ sở đánh giá các khảo nghiệm dòng vô tính, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã công nhận 6 dòng Bạch đàn lai UP (UP35, UP54, UP72, UP95, UP97, và Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 UP99) là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật (theo Quyết định số 65/QĐ-BNN-TCLN, ngày 11/1/2013 của Bộ NN & PTNT). Cùng với những kết quả về cải thiện giống như trên, công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy mô dần được hoàn thiện. Hiện nay, Viện Giống đã thực hiện nhiều đề tài nghiên cứu cấp Bộ về hoàn thiện quy trình nhân giống cho các giống Bạch đàn và Keo. Song do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của kiểu gen với điều kiện môi trường là rất khác nhau. Thực tế cho thấy các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống hoàn toàn khác nhau cho dù là cùng loài (do đặc điểm về mặt di truyền không đồng nhất), do đó không thể áp dụng một quy trình chung cho tất cả các giống. Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài“ Nghiên cứu nhân nhanh một số giống keo và bạch đàn mới bằng công nghệ tế bào thực vật’’, tôi đã quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho 2 dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99: giống lai giữa Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita)” làm nội dung nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ của mình. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Phân bố tự nhiên và khả năng sinh trƣởng của đối tƣợng nghiên cứu. 1.1.1. Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T.Blake) Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) có phân bố tự nhiên tại các quần đảo thuộc Indonesia và Đông Timor, bao gồm đảo Flores (Egon và Lewotobi), Adona, Pantar, Wetar và Timor, trải dài từ 7030 đến 100 vĩ độ Nam và 122 – 1270 kinh độ Đông (Hình 1.1), tập trung ở các dốc núi và trong các thung lũng trên các loại đất bazan, diệp thạch (schits) và phiến thạch, đôi khi mọc ở núi đá vôi. Bạch đàn urô có phân bố ở độ cao 300 – 2960 m so với mực nước biển (chủ yếu ở độ cao 1000 – 2000 m), lượng mưa trung bình hàng năm 600 – 2200 mm, với 2 – 8 tháng khô, nhiệt độ trung bình tối cao 290C, nhiệt độ trung bình tối thấp 8 – 120C. Tại nơi nguyên sản Bạch đàn urô có thể cao 25 – 45 m, cá biệt có thể cao 55 m, đường kính có thể đạt 1 – 2 m. Ở những nơi thấp Bạch đàn urô có thể mọc lẫn với Bạch đàn E. alba (Dẫn từ Lê Đình Khả, 2005). Bạch đàn urô có khả năng thích nghi với nhiều dạng lập địa và đang được gây trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới như Indonesia, Malaysia, Australia, Brazil, Nam Phi, Congo, Trung Quốc, v.v. Ở Việt Nam, Bạch đàn urô là loài cây thích hợp với các lập địa có đất sâu ẩm ở các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng Trung tâm miền Bắc là Lewotobi và Egon Flores (Nguyễn Dương Tài, 1994; Lê Đình Khả, 1996), cho vùng Tây Nguyên (Mang Linh và Lang Hanh – Đà Lạt) là Egon Flores (Lê Đình Khả, 1996; Phạm Văn Tuấn và c.s, 2001), cho vùng Bắc Trung bộ (Đông Hà – Quảng Trị) là Lembata (Lê Đình Khả 2005). Trong điều kiện canh tác thông thường sau 8,5 năm, các xuất xứ này có thể đạt chiều cao 13,2 m với đường kính ngang ngực 11,4 cm, thể tích thân cây 154,4 dm3. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 Hình 1.1. Phân bố tự nhiên của bạch đàn uro (nguồn: Eldridge et al, 1993) 1.1.2. Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita F. Muell) Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita) có 3 vùng phân bố chính, đó là Irian Jaya của Indonesia, Keru của Papua New Guinea và Đông bắc Queensland (Qld) của Australia. Bạch đàn pellita được phân bố từ 7 đến 190 vĩ độ Bắc, song tập trung chủ yếu ở 14 – 150 vĩ độ Bắc (Hình 1.2), tại các vùng ven biển có lượng mưa 1200 – 2300 mm/ năm (Harwood, 1998). Bạch đàn pellita là cây gỗ lớn, ở nơi nguyên sản có thể cao 25 - 40 m, đường kính có thể đạt trên 1 m. Trên đất nghèo dinh dưỡng Bạch đàn pellita chỉ ở dạng cây bụi không quá 10 m, còn trên các lập địa tốt có thể cao 30 m. Trong điều kiện rừng trồng, Bạch đàn pellita thuộc nhóm loài sinh trưởng nhanh đồng thời có chất lượng gỗ rất tốt đáp ứng được nhu cầu đa dạng cho các loại gỗ chất lượng cao như đồ gỗ trong nhà, đồ gỗ ngoài trời, gỗ xây dựng và ván sàn (Bootle, 1983). Bạch đàn pellita đã được gây trồng thành công ở nhiều nước nhiệt đới như Indonesia, Malaysia và Brazil (Harwood, 1998). Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 Hình 1.2. Phân bố tự nhiên của Bạch đàn pellita (Nguồn: Harwood, 1998) Ở Việt Nam, loài này đã được khảo nghiệm ở một số nơi và thuộc nhóm có sinh trưởng nhanh hơn E. tereticornis. Các xuất xứ có sinh trưởng nhanh nhất ở Đông Hà (Quảng Trị) là Kuranda và Helenvale (Qld), ở Lang Hanh (Lâm Đồng) là Helenvale (Qld), còn ở vùng Đông Nam Bộ các xuất xứ này cho thấy có sinh trưởng nhanh nhất và chưa bị nhiễm bệnh như các loài bạch đàn khác ở giai đoạn 8 - 9 tuổi. Do đó, Bạch đàn pellita là một trong số những loài Bạch đàn có triển vọng trồng rừng thuần loài gỗ lớn hoặc lai với các loài khác để tận dụng đặc điểm ưu việt của loài này trong giống lai. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 1.2. Khả năng lai giống và tiềm năng sử dụng giống lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn pellita Bạch đàn pellita có khả năng lai giống với các loài Bạch đàn khác như Bạch đàn brassiana (E. brassiana), Bạch đàn uro (E. urophylla) và Bạch đàn caman (E. camaldulensis) tạo ra các giống lai có ưu thế lai rất tốt về sinh trưởng, đồng thời có tính chất gỗ tốt và có khả năng chống chịu sâu bệnh và các điều kiện hạn hán tốt (Harwood, 1998). Nghiên cứu của Glori (1993) cho lai giống giữa các loài Bạch đàn Eucalyptus pellita, E. degluptus và E. urophylla đã thấy rằng sau 4 năm các tổ hợp lai E. degluptus × E. pellita và E. pellita × E. urophylla có thể cao 18,0 – 19,9 m với đường kính 16,0 – 16,5 cm, trong lúc các chỉ tiêu tương ứng của E. degluptus là 10,6 m và 9,0 cm; của E. pellita 11,0 – 12,3 m và 9,0 - 10,2 cm; của E. urophylla là 10,0 m và 8,1 cm. Tại Congo và Philippines đã triển khai chương trình lai giống đối với xuất xứ Queensland của E. pellita. Cụ thể, Công ty PICOP của Philippines khảo nghiệm một số tổ hợp lai giữa E.deglupta × E. pellita, E.urophylla × E. pellita (Siarot, 1986 - dẫn từ Harwood, 1998). Bạch đàn lai giữa E. pellita × E. urophylla cũng được quan tâm tại Congo. Kết quả khảo nghiệm sau 4 năm thu được chiều cao trung bình tổ hợp lai E. pellita × E. urophylla đạt 20 m, gia đình tốt nhất của E.urophylla đạt 17 m, trong khi đó xuất xứ Queensland của E. pellita tốt nhất là 15 m (Bouvet và Vigneron, 1995). Kết quả nghiên cứu của Mulawarman và cộng sự, (2007) tại Indonesia cho thấy giống lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn grandis với Bạch đàn pellita có sinh trưởng nhanh, vượt từ 20 – 25% so với các loài bố mẹ. Giống lai giữa E.urophylla và E. grandis với E. pellita còn được kỳ vọng có thể tăng tỷ trọng gỗ vượt hơn so với rừng trồng E.urophylla hay E. grandis thuần loài là từ 10 – 15 % qua đó nâng cao sản lượng bột giấy. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 Ở Việt Nam, nghiên cứu lai giống cho các loài Bạch đàn được bắt đầu từ những năm 1990. Nghiên cứu về lai khác loài cho ba loài Bạch đàn uro, Bạch đàn trắng (E.camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E. exserta) với việc tạo ra tổ hợp lai có năng suất cao 1,5 – 3 lần các giống bố mẹ tùy theo điều kiện lập địa cụ thể (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) và gần đây là giống lai khác loài giữa Bạch đàn uro với Bạch đàn pellita, chúng cho thấy ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ của chúng (Nguyễn Việt Cường, 2005) Đến năm 2000, trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu lai tạo giống một số loài Bạch đàn, Tràm, Thông và Keo” giai đoạn 2001 – 2005, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng (nay là Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp) đã tạo ra được hơn 40 tổ hợp lai giữa các loài Bạch đàn uro (U), Bạch đàn camal (C), Bạch đàn tere (T)… với Bạch đàn pellita (P), trong đó Bạch đàn pellita chủ yếu dùng làm cây bố (Nguyễn Việt Cường và cs 2006). Kết quả khảo nghiệm giống lai cho thấy một số giống lai CP có sinh trưởng nhanh trên một số lập địa ở miền Đông Nam Bộ và 1 tổ hợp PU có sinh trưởng nhanh nhất trong các tổ hợp khảo nghiệm tại Ba Vì, Hà Nội . Trong khuôn khổ dự án Sida-SAREC về nghiên cứu cải thiện giống cây rừng, Viện cũng đã có thêm những nghiên cứu lai giống giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn pellita. Kết quả trong giai đoạn 2005 – 2006 đã tạo ra được hơn 60 tổ hợp lai UP và PU (chủ yếu là UP) và một số khảo nghiệm hậu thế giống lai đã được xây dựng tại Hà Nội, Nghệ An, Quảng Trị và Bình Dương. Đặc biệt nhiều tổ hợp lai UP vẫn duy trì được sức sống mạnh mẽ với tán lá khỏe mạnh trong điều kiện mùa đông lạnh và khô ở Ba Vì, điều này có thể được giải thích do khả năng chịu hạn tốt nhờ bộ rễ ăn sâu của Bạch đàn pellita . Các kết quả trên cho thấy Bạch đàn pellita là loài cây rất có triển vọng trong trồng rừng ở Việt Nam đặc biệt là vùng trung du miền Bắc, duyên hải miền Trung và Đông Nam Bộ. Giống lai giữa Bạch đàn pellita với các loài Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 Bạch đàn khác có thể có khả năng thích nghi rất tốt với các dạng lập địa khác nhau và biểu hiện ưu thế lai rất lớn về sinh trưởng. Ngoài ra, Bạch đàn pellita có tỷ trọng gỗ cao và rất phù hợp cho làm gỗ xẻ. Do đó giống lai giữa Bạch đàn pellita và các loài Bạch đàn khác được kỳ vọng có ưu thế lai về sinh trưởng tốt đồng thời có tính chất gỗ tốt cho các mục tiêu sử dụng gỗ khác nhau. Tuy nhiên, ưu thế lai thường biểu hiện rõ rệt ở đời F1, có tính phân ly hết sức đa dạng ở các đời sau (từ F2). Vì thế, muốn sử dụng giống lai một cách có hiệu quả phải chọn lọc cẩn thận các cây lai, tiến hành nhân giống sinh dưỡng và khảo nghiệm dòng vô tính để chọn dòng có ưu thế lai cao nhất (Lê Đình Khả 2001). Nhân giống sinh dưỡng bằng phương pháp nuôi cấy mô (tissue culture) được xem là giải pháp công nghệ hàng đầu để duy trì ưu thế lai và luôn đạt mức độ đồng đều về mặt di truyền. Công nghệ này là quá trình nuôi cấy vô trùng (in vitro) các bộ phận tách rời của thực vật, đặc biệt là các mô phân sinh như mô đỉnh chồi và cành. Các mô phân sinh này được nuôi dưỡng thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro và từ một mẫu nuôi cấy người ta có thể tạo ra hàng triệu cây con đồng nhất về kiểu gen nếu đủ thời gian cấy chuyển. Hơn nữa, cây được tạo ra từ nuôi cấy mô thường sạch bệnh, độ trẻ hóa cao, thân mềm, phần gốc thân tròn, bộ rễ phát triển gần như cây hạt. Chính vì thế, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng tương đối sớm ở một số nước tiên tiến như Pháp, Đức, Braxin, Trung Quốc … và ngày càng trở nên phổ biến ở Việt Nam. 1.3. Khái niệm và cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1. Khái niệm Vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô (tissue culture) để nhân giống thực vật, bắt đầu Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác để tạo cây hoàn chỉnh. 1.3.2. Cơ sở khoa học Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo vô trùng một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và sự phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. 1.3.2.1. Tính toàn năng của tế bào Tế bào bất kỳ nào của cơ thể sinh vật đa bào nào cũng đều có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Đó là tính toàn năng của tế bào (theo Gottlied Haberlandt - trích dẫn trong cuốn “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”). 1.3.2.2 .Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào phôi sinh. Ở giai đoạn đầu tế bào phôi sinh phân chia thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể. Quá trình phân hoá có thể biểu thị như sau: Quá trình này gồm có các giai đoạn: (i) Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy ra trong mô phân sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên một cách đáng kể. (ii) Sự giãn tế bào: Tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn