Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:96

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho Keo lai trước đây mặc dù đã được áp dụng rộng rãi, nhưng lại không thể áp dụng hoàn toàn cho các giống mới chọn lọc này do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trường nên trong cùng một loài. Đề tài sẽ nghiên cứu sâu hơn về vấn đề này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Văn Thu Huyền NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Văn Thu Huyền NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS. Lê Sơn Hƣớng dẫn 2: TS. Đỗ Tiến Phát Hà Nội - 2021
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của TS. Lê Sơn và TS. Đỗ Tiến Phát. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là do tôi trực tiếp thu thập, đồng thời có kế thừa kết quả các đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo lai sinh trưởng nhanh bằng chỉ thị phân tử‖ và đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo lai và Keo lá tràm phục vụ trồng rừng gỗ lớn ở một số vùng sinh thái chính‖ do Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chủ trì thực hiện. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có) đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Văn Thu Huyền
Lời cảm ơn Sau khi hoàn thành các môn học trong chƣơng trình đào tạo thạc sĩ, đƣợc sự đồng ý của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tôi tiến hành khóa luận ―Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô’’. Khóa luận đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Đức Thắng – Bắc Từ Liêm - Hà Nội. Để hoàn thành khoá luận này tôi đƣợc sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Ban lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cũng nhƣ cũng nhƣ cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy lớp BIO-19A khóa 2019A, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Qua đây tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới sự giúp đỡ và đóng góp vô cùng quý báu đó. Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Đỗ Tiến Phát, TS. Lê Sơn đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và ngƣời thân đã giúp đỡ tôi có đƣợc bản luận văn này. Trong quá trình thực hiện, do năng lực và điều kiện nghiên cứu còn hạn chế nên khoá luận không tránh khỏi thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để khoá luận đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên thực hiện Văn Thu Huyền
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Viết tắt Nghĩa đầy đủ BAP 6- Benzyl Amino Purine HSNC Hệ số nhân chồi B5 Môi trƣờng Gamborg Ca(OCl)2 Canxi Hypoclorit GA3 Gibberellic Acid HgCl2 Clorua thuỷ ngân IAA Indol 3- Acetic Acid IBA Indol Butiric Acid Kn Kinetin MS* Môi trƣờng MS cải tiến NAA Naphthy Acetic Acid NaClO Hypoclorit Natri PVP Poly Vinyl Pyrrolidone Tb Trung bình TLBCHH Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu TLCHH Tỷ lệ chồi hữu hiệu WPM Môi trƣờng cho cây thân gỗ
Danh mục các bảng Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai ............................................ 44 Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu ............................. 47 Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản ............. 49 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn ở nồng độ khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .................. 51 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .......................................................................... 53 Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho nuôi cấy các dòng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển ................................................ 56 Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp.............. 57 Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dòng Keo lai dòng BV376, BV586 và BB055............................................................................... 59 Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai ............................. 62 Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai ............. 64
Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào .................................. 18 Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai sau 25 ngày khử trùng ................................. 48 Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dòng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy trong các môi trƣờng nhân chồi khác nhau ........................................................................... 50 Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai đƣợc nuôi cấy trong các công thức môi trƣờng nhân chồi khác nhau ............................................................................ 52 Hình 3.4. Các chồi Keo lai dòng BV568 sau 25 ngày nuôi cấy trong các công thức thí nghiệm khác nhau. ............................................................................. 54 Hình 3.5. Cụm chồi Keo lai sau các giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban đầu, cụm chồi sau nuôi cấy lần 1 và cụm chồi trong môi trƣờng tối ƣu ................ 58 Hình 3.6. Các chồi Keo lai dòng BB055 ra rễ trong môi trƣờng có bổ sung IBA và NAA.................................................................................................... 60 Hình 3.7. Các chồi Keo lai dòng BV376 ra rễ sau 10 ngày ........................... 61 Hình 3.8. Bình ra rễ Keo lai ............................................................................ 61 Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất .................................... 63 Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vƣờn ƣơm ........................................... 65
1 MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 6 1.1. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây rừng ...... 6 1.1.1. Trên thế giới ........................................................................................ 6 1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống cây rừng ở Việt Nam .................................................................................................. 12 1.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................................................................ 15 1.2.1. Khái niệm .......................................................................................... 15 1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ..................... 17 1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ................................................ 17 1.2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào ..................................... 17 1.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 19 1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy ......................................................................... 19 1.3.1.1. Môi trƣờng hóa học ........................................................................ 19 1.3.1.2. Môi trƣờng vật lý ........................................................................... 22 1.3.2. Vật liệu nuôi cấy ............................................................................... 23 1.3.3. Điều kiện vô trùng............................................................................. 23 1.3.4. Buồng nuôi cấy ................................................................................. 24 1.4. Những vấn đề trong nhân giống in vitro .............................................. 25 1.4.1. Sự nhiễm mẫu ................................................................................... 25 1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền .......................................................... 25 1.4.3. Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy .................................................... 25 1.4.4. Hiện tƣợng thủy tinh hóa .................................................................. 26 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống .................................. 27 1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ............................................................................ 27 1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ................................................................... 27 1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ....................................................................... 28
2 1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ................................................................ 28 1.5.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên ........................................................ 29 1.6. Một số kết quả nổi bật về chọn giống Keo lai và trồng rừng Keo lai ở nƣớc ta ......................................................................................................... 30 1.7. Nghiên cứu về nhân giống in vitro các loài keo .................................. 31 1.7.1. Trên thế giới ...................................................................................... 31 1.7.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 34 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...36 2.1. VẬT LIỆU nghiên cứu......................................................................... 36 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 37 2.3.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm ............................................... 37 2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.......................................................... 37 2.3.3. Xử lý số liệu ...................................................................................... 41 2.3.3.1. Tính toán các chỉ tiêu theo dõi ....................................................... 41 2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm ........ 42 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................44 3.1. Xác định Phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp cho các dòng Keo lai nghiên cứu ................................................................................................... 44 3.2. Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho Keo lai .............................. 48 3.3. Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai ..................... 50 3.4. Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai ............... 52 3.5. Tối ƣu hóa phƣơng pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng ..................... 55 3.5.1. Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp .............................................. 55 3.5.2. Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dòng Keo lai ............ 56 3.6. Xác định môi trƣờng ra rễ cho Keo lai ................................................ 58 3.7. Xác định thời gian huấn luyện cây thích hợp ...................................... 62 3.8. Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô ...................... 63 3.9. Xây dựng quy trình nhân giống cho các dòng Keo lai nghiên cứu ..... 65 3.9.1. Mục tiêu quy trình ............................................................................. 66
3 3.9.2. Phạm vi áp dụng ................................................................................ 66 3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình .......................................... 66 3.9.3.1. Điều kiện khí hậu ........................................................................... 66 3.9.3.2. Nguồn giống ................................................................................... 66 3.9.3.3. Điều kiện nhân lực ......................................................................... 66 3.9.3.4. Cơ sở vật chất ................................................................................. 66 3.9.4. Nội dung quy trình ............................................................................ 67 3.9.4.1. Khử trùng mẫu ............................................................................... 67 3.9.4.2. Nhân tạo mẫu ................................................................................. 67 3.9.4.3. Nhân nhanh .................................................................................... 68 3.9.4.4. Nâng cao chất lƣợng chồi .............................................................. 68 3.9.4.5. Cho ra rễ ......................................................................................... 68 3.9.4.6. Huấn luyện cây ............................................................................... 68 3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất:..................................................... 69 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................70 4.1. Kết luận ................................................................................................ 70 4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................72 PHỤ LỤC .................................................................................................................78
4 MỞ ĐẦU Giống Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá tràm (thƣờng đƣợc gọi tắt là Keo lai) đã đƣợc ghi nhận là có nhiều đặc điểm ƣu việt hơn so với 2 loài bố mẹ nhƣ: sinh trƣởng nhanh, thích ứng đƣợc trên nhiều dạng lập địa và kháng sâu bệnh. Từ năm 1991, các dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát hiện, nghiên cứu chọn lọc và đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Ở nƣớc ta đến nay đã có trên 600.000 ha rừng Keo lai đã đƣợc trồng, trong đó nhu cầu diện tích trồng rừng hàng năm của Keo lai đƣợc dự đoán từ 20.000 - 30.000 ha. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà cho đến nay mới chỉ có khoảng 10 dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Mặt khác, rừng trồng các loài Keo nhiệt đới (bao gồm Keo lai và Keo tai tƣợng) gần đây đƣợc ghi nhận là bị ảnh hƣởng nặng nề bởi nấm bệnh cũng nhƣ điều kiện bất lợi của môi trƣờng và biến đổi khí hậu. Vì vậy, công tác chọn giống Keo lai cần đƣợc liên tục tiến hành để vừa chọn tạo đƣợc các giống mới có năng suất, chất lƣợng cao vừa đảm bảo đƣợc tính an toàn sinh học cho rừng trồng. Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính Keo lai gần đây đã chọn đƣợc các dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 là những dòng triển vọng và đã đƣợc công nhận là giống Tiến bộ kỹ thuật nhằm đƣa các giống này vào sản xuất. Để phát triển các giống này vào sản xuất thì việc nghiên cứu nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là hƣớng đi hiệu quả nhất. Mặc dù vậy, quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho Keo lai trƣớc đây mặc dù đã đƣợc áp dụng rộng rãi, nhƣng lại không thể áp dụng hoàn toàn cho các giống mới chọn lọc này do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trƣờng nên trong cùng một loài, với các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau cho dù là cùng loài (do đặc điểm về mặt di truyền không đồng nhất), mặt khác các công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào cho các dòng Keo lai mới chọn tạo chƣa có. Do đó, xác định và tối ƣu hóa phƣơng pháp nhân giống cho 3 dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là cần thiết và có ý nghĩa trong việc phát triển nhanh các giống có năng suất cao này vào trồng rừng sản xuất.
5 Trên cở sở đó đề tài: ―Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586 và BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào‖ đã đƣợc tiến hành nhằm đáp ứng yêu cầu thiết yếu của thực tiễn sản xuất.
6 1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY RỪNG 1.1.1. Trên thế giới Nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp nhân giống đƣợc thực hiện bằng nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trƣờng dinh dƣỡng đặc biệt hoàn toàn vô trùng và đƣợc kiểm soát. Vì vật liệu nuôi cấy thƣờng rất nhỏ và thực hiện trong môi trƣờng nhân tạo nên phƣơng pháp nhân giống này còn đƣợc gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm: nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy phôi, nuôi cấy các cơ quan (đỉnh sinh trƣởng, rễ, lá, bao phấn, ...) [1]. Nuôi cấy in vitro đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thƣơng mại ở nhiều nƣớc trên thế giới (Thụy Điển, Braxin, Australia,Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ, ...) và đã thu đƣợc những thành công đáng kể, đây là khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea abies), Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Australia… [2]. Ở Thụy Điển vào cuối năm 1980 công ty Hilleshoge đã nhân giống cây Vân sam (Picea abies) với số lƣợng 3 triệu cây/năm. Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy thành công. Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana. Cây mô có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ [3].
7 Tại Australia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn lọc cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài Bạch đàn trắng (E. camandulensis). Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. tereticornis, E. globulus, E. torelliana. Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc sản xuất với quy mô lớn cho loài E. camandulensis [3]. Trung Quốc là nƣớc có nhiều thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ đƣợc nuôi cấy nhƣ Dƣơng, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (Hông). Đến năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, ngƣời ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai của một số loài cây trồng rừng chủ yếu đã đƣợc chọn lọc qua khảo nghiệm. Những cây mô này đƣợc dùng nhƣ là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vƣờn ƣơm địa phƣơng hoặc dùng thẳng vào trồng rừng [3]. Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55 loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Tre mạnh tông Dendrocalamus asper với số lƣợng khoảng 1 triệu cây mỗi năm đáp ứng đƣợc nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng (dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4]. Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là: Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài cây lá kim đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô và đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh… Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có 4 loài đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp, Thông ra-đi-a-ta (P. radiate) ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. taera và P. seudotsuga menziesii ở Mỹ [3].
8 Gupta và các cộng sự đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây Tếch 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo đƣợc 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trƣởng thành và 3.000 cây từ 1 cây non trong một năm. Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm [5]. Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã đƣợc thử nghiệm nhân giống thành công bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Acer, Beluta, Fagus, Quercus, Carpinus... Các cây mô đã đƣợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy chúng có kiểu hình tƣơng đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây đƣợc huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn) [4]. Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria japonica) Bách xanh. Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có bốn loài đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempevirens) ở Pháp; Thông P. radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New Dilân; Thông P. taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [3]. Ngƣời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang đƣợc áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trƣởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng [3]. Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, báo cáo của McComb và Bennett (1986) cho biết đã có trên 38 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy mô thành công từ năm 1963, tiêu biểu là các công trình của Cresswell và Fossard (1974), Cresswell và Nitsch (1975), Durnad – Cresswell và Nitsch (1977), Furze và Cresswell (1985), Rao và Venkateswara (1985), Lakshmi Sita (1986), Warrag
9 và cộng sự (1987), (Warrag, và cộng sự, 1990). Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana và cả từ các cây trội có hàm lƣợng tinh dầu cao của bạch đàn chanh E. Citriodora [3]. Cây mô có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Autralia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài E. camaldulensis [6]. Năm 1983, Gupta và cộng sự đã báo cáo rằng các chồi E. torelliana và E. camaldulensis đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung Kn, BAP, Cal.Pan và Biotin. NAA ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của E. torelliana trong khi, với E. camaldulensis, IAA, IBA, IPA và NAA đều cho hiệu quả ra rễ. Tác giả cũng đề cập đến vai trò thúc đẩy quá trình ra rễ in vitro của than hoạt tính đối với 2 loài cây này. Kết quả là từ 1 đoạn chồi của cây trƣởng thành, sau 1 năm đã tạo ra đƣợc 50.000 cây con in vitro E. torelliana và 20.000 cây con đối với E. camaldulensis [6, 7]. Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của ánh sáng đến kết quả nuôi cấy mô bạch đàn Eucalyptus tereticornis của nhóm tác giả Das và Mitra (1990) cho thấy không có chồi ra rễ trừ khi các chồi in vitro Eucalyptus tereticornis đƣợc chuyển ra ngoài ánh sáng sau giai đoạn ủ tối [7]. Nghiên cứu của Warrag và cộng sự (1990) đã chỉ ra khoảng thời gian ủ tối 4 tuần đã thúc đẩy sự hình thành mô sẹo ở Bạch đàn lai [8]. Mullin và cộng sự (1997) đã thành công trong việc tái sinh chồi từ lá cây Bạch đàn E. camaldulensis, môi trƣờng đƣợc tác giả sử dụng là môi trƣờng cải tiến từ môi trƣờng của Muralidharan và Mascarenhas (1987) có bổ sung 1,0 g/l Casein, 16,2 µmol/l NAA, 0,44 µmol/l BAP, 50g/l đƣờng và 0,5% Phytagar (dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9].. Theo Ho và cộng sự (1998), môi trƣờng MS bổ sung 16,2 µmol/l NAA và 4,44 µmol/l 6- BAP có thể kích thích tạo mô sẹo và tái sinh chồi ở Bạch đàn E. camaldulensis [10]
10 Đến năm 2000, cũng nghiên cứu trên cùng đối tƣợng là cây Eucalyptus tereticornis, Sharma và cộng sự [11] lại thu đƣợc kết quả đối lập với kết quả của Das và Mitra (1990) khi quan sát thấy xuất hiện sự hình thành rễ từ các chồi khi ủ mẫu trong thời gian dài từ 8-10 ngày. Cùng thời gian này, Arezki và cộng sự đã tiến hành nuôi cấy mô phân sinh của Bạch đàn Caman trong môi trƣờng MS bổ sung 5 µmol/l IBA, 30 g/l đƣờng, 0,5% agar và 0,2% than hoạt tính. (dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9]. Báo cáo của González và cộng sự (2002) đã nhấn mạnh tỷ lệ mô sẹo hình thành từ lá mầm của Bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla là cao nhất khi ở chế độ ủ tối 30 ngày [12]. Joshi và cộng sự (2003) đã nuôi cấy mô từ chồi nách của cây mẹ trƣởng thành dòng FRI-6 Bạch đàn lai E. tereticornis x E. grandis. Môi trƣờng nhân chồi MS bổ sung 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA sau 150 ngày nuôi cấy, từ 1 chồi ban đầu có thể nhân ra đƣợc 20 - 25 chồi. 1/2MS là môi trƣờng tạo chồi đủ tiêu chuẩn ra rễ mà nhóm tác giả đã xác định đƣợc, môi trƣờng này tạo đƣợc 30 - 35 chồi/cụm, chiều dài chồi từ 1,5 - 2,0 cm, chồi xanh, sinh trƣởng, phát triển tốt. Báo cáo cũng ghi nhận, có 75% chồi ra rễ trong môi trƣờng 1/2MS bổ sung 1,0 mg/l IBA [13]. Roberson Dibax và cộng sự (2005) [12] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi Bạch đàn E. camaldulensis, kết quả cho thấy, các công thức phối hợp chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc thí nghiệm có tỷ lệ phần trăm chồi hình thành từ mô sẹo là đạt cao nhất (90,2%) với tất cả các nồng độ NAA khi ủ mẫu trong tối 30 ngày. Cũng theo tác giả, ở chế độ này tỷ lệ mẫu bị hoại tử đã giảm đi đáng kể. Kết quả này cũng trùng lặp với kết quả nghiên cứu trên Bạch đàn E. grandis của tác giả Laine và David (1994) [14]. Trong báo cáo, Roberson Dibax và cộng sự cũng đƣa ra môi trƣờng nhân nhanh chồi cho Bạch đàn Caman là MS bổ sung 2,7µmol/l NAA và 4,44 µmol/l BAP, sau 30 ngày nuôi cấy thu đƣợc 11,8 chồi/cụm. Môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi và ra rễ là 1/2MS bổ sung 0,2% than hoạt tính sẽ tạo ra các chồi non cao 1 - 8 cm, lá xanh thẫm; sau 10 - 15 ngày tỷ lệ ra rễ là 80%, có 8 rễ/cây, cây cao từ 2 - 4 cm [15].
11 Năm 2007, Sotelo M và Monza J đã nuôi cấy mô cho E. maidenii từ các đoạn chồi 50 x 3 cm, mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt bằng xà phòng và dung dịch Benlate (2g/l ) và dung dịch Captan (2g/l) trong thời gian 60 phút và dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl2) 0,1% trong 5 phút sau đó tráng sạch 3 lần với nƣớc và ngâm trong Polyvinil pirrilidona (PVP) 1,5 g/l trong vòng 60 phút ở 40C. Tác giả ghi nhận môi trƣờng nhân nhanh chồi cho E. maidenii là QL (môi trƣờng do Quoirin và Lepoivre, 1977) đƣợc bổ sung 0,2 mg/l BAP và 0,02 mg/l IBA. Để nâng cao chất lƣợng chồi, nhóm tác giả đã nghiên cứu hiệu quả của Cytokinin và Auxin khi kết hợp cùng nhau trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng thời nghiên cứu hiệu quả tăng chiều cao chồi nhờ GA3. Kết quả cho thấy, môi trƣờng phù hợp là QL bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA cho 4 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình trên 2 cm. Đặc biệt, tác giả còn nghiên cứu ảnh hƣởng của auxin và chế độ ánh sáng đến khả năng ra rễ của các dòng Bạch đàn, kết quả chỉ ra rằng môi trƣờng 1/4QL bổ sung 10mg/l Thiamine và 2mg/l IB, ủ tối 7 ngày là công thức ra rễ tốt nhất [16]. Trong báo cáo về ra rễ in vitro cho Bạch đàn lai E. urophylla x E. grandis, Sophie Nourissier và cộng sự (2008) cũng đƣa ra nhận định, chế độ ánh sáng ảnh hƣởng tới việc kéo dài chồi và ra rễ. Tỷ lệ ra rễ của Bạch đàn lai E. urophylla x E. grandis đạt tới 81% khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng 1/2MS có bổ sung 5 μM IBA và 12.5 μM NAA [17]. Năm 2012, Girijashankar đã lấy các đoạn chồi từ cây mẹ 18 tháng tuổi Bạch đàn E. camaldulensis để khử trùng. Mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt với 3 công thức: công thức 1 - dùng cồn 70% trong thời gian 1 phút; công thức 2 - ngâm trong NaOCl2 1% có bổ sung 1 vài giọt Tween trong thời gian 15 phút, sau đó tráng với 3 lần nƣớc sạch; công thức 3 - ngâm mẫu trong HgCl2 0,1%. Kết quả cho thấy, sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 – 15 phút làm mẫu bị hóa nâu, bị hoại tử và thậm chí bị chết. Sử dụng NaOCl2 trong thời gian 15 – 17 phút giúp giảm số lƣợng mẫu nhiễm tƣơng tự nhƣ khi sử dụng HgCl 2 0,1% nhƣng phƣơng pháp này lại không làm tổn thƣơng mẫu. Môi trƣờng nhân nhanh chồi đƣợc xác định là MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA cho 6,3 chồi/cụm. Môi trƣờng 1/2MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số
12 lƣợng chồi tăng lên 3 lần, chiều dài chồi trên 2 cm. Môi trƣờng 1/2MS bổ sung 1 mg/l IBA cho 60% chồi ra rễ, có 2 - 8 rễ/cây, rễ dài 2 - 7 cm [6]. Khi nghiên cứu nuôi cấy mô cho Bạch đàn lai HFRI-5 (E. camaldulensis Dehn x E. tereticornis Sm), Natasha Mahajan và cộng sự (2012) đã thực hiện trên chồi đỉnh, chồi cành và lá cây mẹ 4 - 8 tuổi. Vật liệu đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 1 – 2 h với một vài giọt Tween 20, sau đó đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách lắc trong cồn 70% trong thời gian 30 giây, tiếp theo vật liệu đƣợc ngâm trong HgCl2 trong 2 phút. Kết quả cho thấy việc bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy MS với 10% nƣớc dừa và 500 mg/l PVP có ảnh hƣởng lớn tới khả năng nhân chồi Bạch đàn lai. Nồng độ 3,0 mg/l BAP là nồng độ thích hợp để nhân nhanh lƣợng chồi bạch đàn, trong khi đó, không có chồi nào đƣợc tạo thành khi ở nồng độ BAP nhỏ hơn 3,0 mg/l và ở nồng độ lớn hơn 5,0 mg/l. Tác giả cũng khẳng định chế độ ánh sáng là nhân tố vô cùng quan trọng đối với sự tái sinh chồi ở Bạch đàn [18]. Có thể nói nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các loài cây nông lâm nghiệp đang đƣợc áp dụng trên quy mô lớn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Đối với ngành lâm nghiệp nƣớc ta, đây là phƣơng pháp tối ƣu để đƣa nhanh các giống mới chọn lọc vào trồng rừng sản xuất. 1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống cây rừng ở Việt Nam Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đƣợc phát triển từ những năm 70 và đã đƣợc một số đơn vị nhƣ: Trƣờng Đại học Nông Nghiệp, Viện CNSH, Viện KHKT NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng (nay là Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp), ... nghiên cứu ứng dụng thành công cho nhiều loài cây trồng nông lâm nghiệp. Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nƣớc ta là Công ty Giống lâm nghiệp Trung ƣơng, Trung tâm Khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, Xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Công ty CP Giống cây trồng Nguyên Hạnh, Công
13 ty Lâm nghiệp Quy Nhơn, Công ty Lâm nghiệp Tiền Phong… [4]. Hiện nay một số tỉnh và địa phƣơng đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã đạt đƣợc những thành công đáng kể, góp phần không nhỏ trong việc phát triển trồng rừng dòng vô tính ở nƣớc ta. Trồng rừng bằng cây từ nuôi cấy mô hoặc cây hom lấy từ dòng mẹ vô tính tốt nhất của cây lai đời F1 (đã qua chọn lọc và đánh giá) thì rừng trồng vừa sinh trƣởng nhanh vừa khá đồng đều. Chính vì thế trong công văn số 268 BNN- KHCN ngày 13/01/1998, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã khuyến cáo các đơn vị không dùng hạt Keo lai để gây trồng rừng sản xuất mà nên dùng dòng vô tính Keo lai đã đƣợc khảo nghiệm và đánh giá để gây trồng rừng [19]. Dƣơng Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và bạch đàn nâu (E. urophylla) từ cây trội của 2 loài này đã tạo đƣợc một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2 lần [20]. Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho giống lai của Bạch đàn trắng đã đƣợc Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1997) thực hiện thành công từ năm 1993 thấy rằng dùng BAP thêm vào môi trƣờng MS có thể tạo đƣợc 20-30 chồi/mẫu. Môi trƣờng MS + IBA có thể đạt tỉ lệ ra rễ 80%. Tuy nhiên chất lƣợng các chồi thu đƣợc chƣa cao, tỷ lệ sống cây con ngoài vƣờn ƣơm chƣa đáp ứng đƣợc yêu cầu sản xuất (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4]. Thông qua chƣơng trình hợp tác với Trung Quốc một số dòng Bạch đàn có năng suất cao: U6, U16 và công nghệ nhân giống đã đƣợc chuyển giao cho các đơn vị trong nƣớc nhƣ: Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng, Trung tâm ứng dụng KHSX nông lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, sau đó các nghiên cứu nhân giống cho cây lâm nghiệp đã đƣợc nhiều đơn vị tiến hành. Mai Đình Hồng (1995) đã đƣa ra môi trƣờng nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng U6 là: môi trƣờng nhân chồi (MS + 3% đƣờng + 4,5 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trƣờng tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đƣờng + 5g/l agar