Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu được môi trường nhân giống quýt Bắc Kạn phù hợp trong ống nghiệm; xác định được giá thể phù hợp cho việc chuyển cây từ môi trường nuôi cấy ra vườn ươm. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÍ HỮU VIỆT NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÍ HỮU VIỆT NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đã trực tiếp làm các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được là trung thực, không chỉnh sửa, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu của luận văn này chưa từng được công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Tác giả luận văn Phí Hữu Việt i
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài này. Các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Cán bộ kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật – Khoa Sinh học- Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 3 năm 2017 Tác giả luận văn Phí Hữu Việt ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii MỤC LỤC ......................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................. vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt ... 3 1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ......................................... 3 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ............................................... 4 1.2. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 5 1.2.1. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới ................................................ 5 1.2.2. Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam ................................................. 5 1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật ................. 6 1.3.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro ................................ 7 1.3.2. Quy trình nhân giống in vitro ............................................................ 9 1.4. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật ..................................................................................... 11 1.4.1. Auxin ............................................................................................... 12 1.4.2. Cytokinin ......................................................................................... 13 1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm 14 1.6. Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro............................................................................................................ 15 iii
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 19 2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ................................ 19 2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................. 19 2.1.2. Hoá chất, thiết bị.............................................................................. 19 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 20 2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro.............................................. 20 2.2.2. Phương pháp đưa cây ra vườn ươm ................................................ 22 2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................ 23 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 24 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt Bắc Kạn ......................................................................................................... 24 3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP hoặc kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ......................................................................................................... 27 3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ........ 27 3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ..... 30 3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn........................................................................................... 33 3.3.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi cây quýt Bắc Kạn ............................................................................................ 33 3.3.2. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi quýt Bắc Kạn ..................................................................................................... 35 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ cây quýt Bắc Kạn .......... 38 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra ngoài tự nhiên ................................................................................................ 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 43 1. Kết luận...................................................................................................... 43 2. Đề nghị....................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 44 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 47 iv
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid BAP : Benzylamino purine cs : Cộng sự CT : Công thức DNA : Deoxyribo nucleic acid ĐC : Đối chứng IAA : indol acetic acid IAA : indole acetic acid IBA : Indol butyric acid Kinetin : 6-furfurylamino purine MS : Murashige and Skoog (1962) α-NAA : α- naphthalene acetic acid iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS ........................................ 19 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần nuôi cấy) .............................................. 25 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn ... 28 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn 31 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn .......................................................................... 34 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn .......................................................................... 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ của cây quýt Bắc Kạn... 39 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần)................................................ 41 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần) ............................................................. 26 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn..... 30 Hình 3.3. Ảnh của kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần) ................................................................................... 32 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 35 Hình 3.5. Ảnh hường của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 37 Hình 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành và phát triển rễ của cây quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 40 Hình 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần) ................................................ 42 vi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là cây ăn quả được nhiều người biết đến với vị ngọt mát, thơm đặc trưng, có chứa nhiều vitamin, chất khoáng và các chất dinh dưỡng cần thiết khác cho con người. Các chuyên gia về dinh dưỡng khuyên ta nên tích cực ăn quýt hàng ngày. Cây quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò tích cực trong việc phát triển kinh tế của nhiều địa phương. Do chất lượng quả tốt nên nhu cầu tiêu thụ quýt trên thị trường ngày càng tăng với số lượng lớn. Giá thành ổn định đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng quýt, nhiều hộ gia đình đã thoát nghèo và vươn lên làm giàu từ cây quýt. Trồng quýt còn có vai trò phủ xanh đất trống đồi trọc, giúp tạo cảnh quan và bảo vệ môi trường sinh thái. Với chiều cao cây từ 2,0-3,5m, lá xanh che phủ quanh năm, thích nghi với điều kiện sống khô hạn, nên cây quýt rất phù hợp với vùng trung du và miền núi. Do đó, có thể trồng quýt trên các đồi dốc vừa đem lại hiệu quả kinh tế vừa phủ xanh đồi trọc chống xói mòn, bảo vệ môi trường sinh thái. Không những thế, quýt cũng có thể trồng trong vườn nhà, cây cao vừa phải, lá thường xanh, hoa quả màu sắc đẹp, có tinh dầu tỏa ra mùi thơm mát, do đó nó còn được trồng để làm cảnh. Cây quýt Bắc Kạn được trồng chủ yếu ở huyện Chợ Đồn, có vị nọt mát, hương thơm đặc trưng, là loại quả quý cần được bảo tồn. Đồng thời, cây quýt đã được Ủy ban Nhân dân tỉnh Bắc Kạn xác định là cây trồng thế mạnh đóng vai trò chiến lược trong phát triển kinh tế, do đó đã có nhiều chính sách và chế độ phát triển cây quýt. Tính đến năm 2015, diện tích quýt của toàn tỉnh Bắc Kạn lên tới 2200 ha, tăng gấp 5 lần so với năm 2005, tổng sản lượng khoảng 10000 tấn/năm đã mang lại giá trị sản xuất trên 100 tỷ đồng cho nông dân. Tuy nhiên, giá trị đó vẫn chưa xứng tầm với tiềm năng sẵn có của địa phương. Một 1
trong những lí do làm năng suất của cây quýt còn thấp là nhiều vườn quýt khai thác lâu năm đã bị thoái hóa không những làm năng suất thấp mà chất lượng quả cũng bị giảm. Do đó, để tăng năng suất và nâng cao chất lượng thì cần có biện pháp trồng cải tạo những diện tích quýt thoái hóa. Bên cạnh đó, chiến lược trong những năm tới, tỉnh định hướng khoảng 1000 ha quýt chăm sóc theo tiêu chuẩn VietGap nên nhu cầu cây giống tốt là rất lớn. Phương pháp nhân giống in vitro giúp tạo ra một số lượng lớn giống cây trồng trong khoảng thời gian ngắn, các cây con mang đặc điểm giống nhau và giống với dòng mẹ nên có thể tạo quần thể đồng nhất. Đặc biệt, nhân giống in vitro còn tạo ra giống cây sạch bệnh do được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, từ đó đáp ứng yêu cầu sản suất rau quả sạch ngày nay. Từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu nhân giống cây quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật". 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu được môi trường nhân giống quýt Bắc Kạn phù hợp trong ống nghiệm. Xác định được giá thể phù hợp cho việc chuyển cây từ môi trường nuôi cấy ra vườn ươm. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khử trùng hạt quýt Bắc Kạn nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin lên sự phát sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của α- NAA tới sự phát sinh rễ từ chồi giống quýt Bắc Kạn. Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt 1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học Cây quýt thuộc bộ cam quýt: Rutales, họ cam quýt: Rutaceae, chi: Citrus, loài quýt: Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus suhuiensis Hort. ex Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [111]. Cây quýt có bộ lá xanh quanh năm, lá đơn, mọc cách và có eo lá. Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc nào cũng xanh lá. Trong lá có nhiều túi tiết tinh dầu nên khi vò lá có mùi thơm [3]. Quýt là cây thân gỗ, thiết diện tròn, mầu nâu thẫm, cao 2-3m, hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong vỏ cây có chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc lớn, trồng cây bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc. Quýt có rễ cọc khỏe, lan rộng, rễ phát triển ở nhiệt độ 10-37oC, khi nhiệt độ cao hay thấp hơn, độ ẩm của đất 1% thì sự phát triển của rễ sẽ ngừng lại. Tỉ lệ ôxi trong đất từ 1,2 - 1,5% thì rễ cũng ngừng phát triển. Cây trồng bằng chiết cành thì không có rễ chính rõ ràng mà có nhiều rễ cạnh có thể phát triển to nhưng không đâm sâu xuống đất như trồng bằng hạt. Hoa thường được hình thành ở nách lá, hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, cánh hoa rời nhau và mẫu bốn. Trong hoa thường có đĩa mật thích nghi với việc thụ phấn nhờ sâu bọ. Nhị hoa thường có số lượng nhiều gấp ba đến bốn lần số cánh hoa. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hàng năm, phần lớn sinh ra cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 sinh ra hoa, đợt 3 tháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt. Trong các lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất [3]. 3
Quả quýt thuộc dạng quả mọng gồm vỏ, thịt và hạt. Vỏ có túi tinh dầu, thịt quả có nhiều múi, trong múi có các tép mọng nước, mỗi quả có 9- 13 múi. Quả quýt hình dẹp, vỏ màu vàng và mỏng, vỏ dễ bóc, múi dễ chia, trọng lượng trung bình đạt từ 35 đến 145 gam tùy giống. Quả có vị ngọt, chua nhẹ và có hương thơm đậm đặc trưng rất dễ để phân biệt vơi bất kì loại quả nào trong nhóm cây ăn quả có múi. Trong mỗi quả có từ 18 đến 20 hạt tùy giống. Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có 2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều linhin, màng trong mỏng. Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10oC đến 30oC, tốt nhất là 25- 30oC [3]. 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, chất khoáng cần thiết cho sức khỏe con người, đặc biệt có chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh tật, tăng cường sức đề kháng. Trong 100 gam múi quýt (phần ăn được) có thành phần dinh dưỡng gồm: nước 66,5%, protein 0,6%, lipit 0,7%, gluxit 6,4% xelulozo 0,4%, năng lượng 32kcalo, canxi 25,9mg, photpho 12,6mg, sắt 0,3mg, caroten 0,44mg, vitamin B1 0,06mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,2mg, vitamin C 41mg và một số axit hữu cơ [3], [277]. Trong quả quýt ngoài vitamin, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ. Các chất xơ khi vào ống tiêu hóa bị trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn bã của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp với đường và axit tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số chất dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cần thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dự trữ ở các mô gây béo phì [266]. Qủa quýt được nhiều người ưa chuộng, là loại quả sử dụng để ăn tráng miệng, làm nước giải khát, làm mứt. Quả quýt có vị chua tính ấm, có tác dụng làm mát tim, khai uất, trừ đàm, tan khí kết, giải rượu. Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành, đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm, ăn 4
quýt rất tốt. Vỏ quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vị. Y học đã chứng minh, tinh dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạ dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, có tác dụng tốt với các chứng bệnh đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, kém ăn, buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt vị đắng tính bình, vào hai kinh can và thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị đắng, tính bình vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữa đau mạng sườn, sa nang, đau vú, u cục ở vú [266], [277]. 1.2. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới Cam quýt là loại quả quan trọng, đứng trên cả nho, chuối, táo. Quýt được trồng tập trung chủ yếu ở các nước có khí hậu cận nhiệt đới như Mêhico, Brazin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và các nước ven Địa Trung Hải, các nước ở vĩ tuyến 30- 350. Ngày nay, sản xuất cam quýt từ vùng nhiệt đới đã tăng lên gần bằng các nước cận nhiệt đới. Nguyên nhân là do điều kiện tự nhiên, kĩ thuật canh tác tiến bộ, nhiệt độ vùng ôn đới hạ thấp hơn ảnh hưởng đến sản lượng quýt. Nguyên nhân quan trọng hơn là dân số các nước vùng nhiệt đới tăng nhanh, điều kiện kinh tế phát triển hơn, nhu cầu tiêu thụ cam quýt tăng, kéo theo sản xuất cũng tăng. Theo FAO (năm 2013) tổng sản lượng cam quýt trên thế giới đạt 135,169 triệu tấn. Trong đó, năm quốc gia có sản lượng cao nhất là Trung Quốc 32,1 triệu tấn, Brazin 19,9 triệu tấn, Mỹ 10,3 triệu tấn, Ấn Độ 9 triệu tấn, Mehico 7,18 triệu tấn [29]. 1.2.2. Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp với nhiều loại cây. Do vậy, cây quýt ở nước ta được trồng trải dọc từ Bắc xuống miền Nam. Ở miền Bắc, quýt được trồng nhiều ở một số tỉnh Hà Tây, Hưng Yên, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hà Giang...Do nhu cầu tiêu thụ cao nên diện tích trồng 5
quýt ở các địa phương ngày càng được mở rộng, nhiều vườn quýt được trồng lại bằng các giống cho năng suất và chất lượng cao. Theo FAO, năm 2012 tổng sản lượng cam quýt nước ta đạt 958000 tấn, sang năm 2013 sản lượng đã tăng lên và đạt 971000 tấn. Về năng suất trung bình trong năm 2012 đạt 119,53/ha, sang năm 2013 chỉ số này đã tăng lên 119,77/ha. Tuy nhiên, việc sản xuất quýt trong nước vẫn chưa đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước nên mỗi năm nước ta vẫn phải nhập khẩu quýt từ các nước, trong đó chủ yếu là từ Trung Quốc [29]. 1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1]. Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau: (1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công tác chọn giống. (2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây cảnh, cây dược liệu… (3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virus. (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai. (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1],[15]. 6
1.3.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng và số lượng cây giống tăng lên nhanh chóng trên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường toàn cầu. Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân giống nào có được. Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ nhân nhanh. Đồng thời, tạo cây con giống cây mẹ, đáp ứng yêu cầu của việc bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây. Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh. Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây cũng chỉ nặng 15kg); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ 40C trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%. Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm. Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống cây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền. Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩm hoàn toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mất trong tự nhiên [122]. 7
Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng [1]. Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy rất khó thành công. Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy là làm sạch virus cho cây trồng. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10mm. Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồi cũng giảm. Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng, hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng. Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ [122]. Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh. Tuy nhiên, trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh. Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là: + Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm như dứa sợi, mía… + Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm) Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phong lan, dứa, huệ. Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn 8
chỉnh. Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể. Do đó, đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn, như ở phong lan vì có phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành (protocorm) nên nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi. Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ đề, cam, quýt… Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ thể thực vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được. Các bộ phận đó là: Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh…; mảnh lá ở thuốc lá, cà chua, bắp cải… ; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…và nhánh củ ở tỏi, hành… Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cây cũng khá đồng đều về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do đó nhất thiết phải sử dụng các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [8], [10], [144]. 1.3.2. Quy trình nhân giống in vitro Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ 9
thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị. Tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiến hành theo các bước: (1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy (2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro). Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy các mảnh. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 - 2 tháng tùy loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu. Ví dụ, từ một đỉnh sinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên 2000 10
- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma. Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu. Giai đoạn 4: Tạo rễ Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất. Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần. Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro. Đối với một số loài có thể chuyển cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt. Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [144]. 1.4. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin [6], [7]. 11