Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Đăk Lăk

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:119

Thêm vào BST

Báo xấu

97
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài: phân lập các chủng vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Đăk Lăk, tuyển chọn các chủng có hoạt tính phân giải photphat khó tan cao của các chủng vi khuẩn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Đăk Lăk

1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn ñề Tây Nguyên vùng có tiềm năng dồi dào ñể phát triển nông lâm nghiệp, với trên 2 triệu ha ñất bazan màu mỡ, chiếm 60% diện tích ñất bazan của cả nước. Tây Nguyên là khu vực thích hợp cho phát triển cây công nghiệp hàng hoá như cà phê, cao su, hồ tiêu và cây lương thực là ngô. Theo số liệu thống kê năm 2008, Tây Nguyên có khoảng 470.000 ha cà phê, 144.000 ha cao su, 30.000 ha hồ tiêu và hàng trăm nghìn ha lúa, ngô và các cây công nghiệp ngắn ngày khác. Theo cơ cấu kinh tế năm 2009, nông nghiệp vẫn là ngành chủ ñạo trong phát triển kinh tế Tây Nguyên, trong ñó trồng trọt chiếm xấp xỉ 86% tổng sản phẩm và gần 35% tổng kinh tế toàn vùng. Có ñược những thành công trên là do có sự thay ñổi cơ cấu cây trồng, áp dụng những thành tựu khoa học - kỹ thuật vào quá trình sản xuất, tăng cường ñầu tư thâm canh… Một trong những biện pháp thâm canh ñem lại hiệu quả cao là tăng cường sử dụng các loại phân hoá học, việc ñó ñã làm tăng ñáng kể năng suất và chất lượng nông sản. Nhưng mặt trái của việc sử dụng phân bón hoá học là làm cho ñất ngày càng bị thoái hoá, chua hoá, chai cứng, ñồng thời làm cho hệ vi sinh vật có ích trong ñất ngày càng giảm ñi một cách nhanh chóng. Photphat là một trong nguyên tố dinh dưỡng ña lượng quan trọng, cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng như tổng hợp ATP nguồn năng lượng cho mọi hoạt ñộng sống của cơ thể và cấu tạo acid nucleic. ..[2] Trong tự nhiên sự chuyển hoá photphat xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của quá trình hoá học và sinh học [1]. Quá trình chuyển hoá hợp chất photphat khó tan trong ñất có phần ñóng góp quan trọng của các loại vi sinh vật.
2 Nhóm vi sinh vật phân giải photphat khó tan tồn tại nhiều trong ñất và cùng các loại vi sinh vật khác luôn giữ cho hệ vi sinh vật trong ñất ñược cân bằng sinh thái và dịch bệnh xảy ra nếu sự cân bằng bị phá vỡ. Các vi sinh vật phân giải photphat khó tan trong ñất hoạt ñộng như các nhà máy phân lân chuyển quặng khó tan thành dễ tan ñể cây trồng hấp thụ ñược, không cần axit mạnh và nhiệt ñộ cao. Do vậy bón vi sinh vật phân giải photphat khó tan vào ñất sẽ cung cấp một lượng photphat dễ tan cho cây trồng, không làm chua ñất và giúp cây hấp thụ các chất dinh dưỡng trong ñất tốt hơn [14]. Một số nghiên cứu trên thế giới ñã chỉ ra một số vi sinh vật có khả năng thể hiện ñược nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau, trong ñó có những vi sinh vật vừa chuyển hoá hợp chất photphat vừa có khả năng tạo các chất dinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật ñồng thời cũng có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng [3,6]. Đắk Lắk với hơn 310.000 ha là ñất bazan nâu ñỏ là loại ñất có hàm lượng lân tổng số cao nhưng hàm lượng lân dễ tiêu thấp do sự di ñộng của Fe, Al, hay hàm lượng Ca2+ cao dẫn ñến lân dễ bị cố ñịnh thành lân khó tiêu ( Ca3 (PO4 ) 2, AlPO4 , FePO4 ..) nên lượng lân dễ tiêu luôn ở mức nghèo[25]. Đất bazan nâu ñỏ rất thích hợp cho việc phát triển các cây công nghiệp dài ngày, nhưng trong nhiều năm qua nông dân thường chỉ dùng phân hoá học ñể bón cho cây trồng thiếu bón phân hữu cơ cũng như phân vi sinh vật làm cho ñất trồng bị thoái hoá, chai cứng, vi sinh vật ñất bị suy thoái, gây ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên ñất bazan nâu ñỏ ở ĐakLak .
3 2. Mục tiêu của ñề tài - Phân lập các chủng vi khuẩn phân giải photphat khó tan trên ñất bazan nâu ñỏ ở Đăk Lăk. - Tuyển chọn các chủng có hoạt tính phân giải photphat khó tan cao của các chủng vi khuẩn. 3.Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần làm sáng tỏ vai trò của vi sinh vật phân giải photphat khó tan . Các nghiên cứu của thế giới và Việt Nam về phân giải photphat khó tan dạng photphat sắt, photphat nhôm còn rất ít nghiên cứu. Đáng chú ý ñề tài nghiên cứu, tuyển chọn và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải photphat khó tan hiệu quả trên ñất bazan nâu ñỏ trong ñiều kiện cụ thể ở Đak Lak và góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật bản ñịa hữu ích. 4. Ý nghĩa thực tiễn Thành công của ñề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phân giải photphat khó tan trong sản xuất nông , lâm nghiệp nhằm cung cấp photphat dễ tan cho cây trồng, giảm chi phí ñầu tư, giảm sự thoái hoá ñất, góp phần cải thiện ñời sống của nông dân và bảo vệ môi trường nông thôn ở Đak Lak. 5. Giới hạn của ñề tài Trong quá trình thực hiện, do thời gian, trang thiết bị, hoá chất có hạn nên chúng tôi chỉ tiến hành phân lập trên một số mẫu ñất của tỉnh Đak Lak và chỉ theo dõi một số chỉ tiêu cơ bản. Mặt khác, ñây là lần ñầu tham gia nghiên cứu nên không thể tránh khỏi thiếu sót. Kính mong quý thầy cô và các bạn ñóng góp ý kiến.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Các dạng lân trong tự nhiên Photphat là nguyên tố ñóng vai trò ñặc biệt trong quá trình trao ñổi chất của cây, tham gia vào việc hình thành tế bào, acid nucleic, làm nhanh quá trình chín ở cây, các quá trình phân giải protein và các sản phẩm trung gian ở trong lá ñược tăng cường và chuyển ñến các cơ quan vào hạt, làm tăng sự phát triển ở rễ. Nếu trong ñất chỉ có nitơ mà không ñủ photphat thì cây không phát triển tốt ñược [29]. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng photphat bởi cây trồng không quá 25% , trong khi ñó một lượng lớn bị cố ñịnh trong ñất và chuyển thành dạng khó hấp thụ. Lượng dự trữ của photphat trong ñất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P2O5 nhưng chúng tồn tại trong ñất ở dạng không tan trong nước nên cây khó hấp thụ. Lượng lân trong ñất nhiều hay ít là do tính chất ñá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ quyết ñịnh [22]. Theo Sepfe-Satsaben (1960) thì hàm lượng lân trung bình ở nhiều loại ñất thường từ 0,02 - 0,08%. Do quá trình tích luỹ sinh học, hàm lượng lân trong lớp ñất mặt cao hơn ở lớp dưới. Trong các loại ñất khoáng, tỉ lệ lân hữu cơ thường từ 25 - 65%. Các cỡ hạt thuộc thành phần sét thường chứa nhiều lân hơn các cỡ thuộc thành phần cát. Do ñó: Ở các chân ñất nhẹ, ñất bạc màu… có ít keo sét, thì tỉ lệ lân thường thấp hơn các chân ñất khác. Ở Việt Nam, tỉ lệ lân trong ñất khác nhau tuỳ theo tính chất của ñá mẹ và những ñất phát sinh từ ñá mẹ chua như: Nai, mica, quartzit, … thường tỉ lệ lân thấp hơn là ñất phát sinh từ mẫu thạch không chua như: Bazan, ñá vôi,…
5 Như vậy, bón phân lân và tăng cường ñộ hoà tan các dạng lân khó tiêu là biện pháp rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Bón phân hữu cơ, vùi xác ñộng vật thực vật vào ñất ở mức ñộ nhất ñịnh cũng là biện pháp tăng cường hàm lượng lân cho ñất [27]. Trong tự nhiên nói chung và trong ñất nói riêng, lân thường ở các dạng chủ yếu như sau: 1.1.1. Lân hữu cơ Hàm lượng lân hữu cơ trong ñất chiếm một tỉ lệ cao khoảng 20 - 80% lân tổng số. Ở lớp ñất mặt, lân chiếm khoảng 50% [22]. Lân hữu cơ trong ñất chủ yếu ở trong thành phần mùn. Đất càng giàu mùn thì càng giàu lân hữu cơ. Theo Kletcôpxki và Petecbuaxki (1964) thì: Trong lân hữu cơ của ñất dạng phổ biến nhất là dạng fytat, có thể chiếm ñến 50% tổng số lân hữu cơ. Tuỳ theo môi trường chua hay kiềm mà tồn tại ở các dạng fytat khác nhau. Ở ñất chua, lân hữu cơ chủ yếu là fytat Fe, Al; ở ñất trung tính, kiềm tồn tại dạng phytat Ca, Mg. Lân hữu cơ trong cơ thể ñộng vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp các hợp chất chủ yếu như phytin, photpholipit, axit nucleic. Điều ñáng chú ý là lân ở tế bào vi sinh vật thì không trực tiếp tham gia vào việc dinh dưỡng cây trồng ñược và phải ñợi vi sinh vật chết ñi, tế bào bị khoáng hoá cây mới hút ñược [7]. Khi thực hiện quá trình khoáng hoá có sự tham gia của vi sinh vật phân giải lân, những hợp chất hữu cơ (trong ñó có lân hữu cơ) sẽ ñược khoáng hoá ñể giải phóng ra lân vô cơ hay lân hữu cơ, là nguồn dinh dưỡng cung cấp thức ăn cho cây trồng. Có 70 - 80 tập ñoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải lân. Trong quá trình khoáng hoá chất hữu cơ của ñất, lân hữu cơ ñược giải phóng ra dưới dạng photphoric và muối dễ tan của nó. Nhưng các dạng lân này lại bị ñất hấp phụ và bị vi sinh vật hút lại, nên trong ñất rất ít lân ở thể hoà tan. Nhiều tác giả
6 nghiên cứu cho rằng: Nếu chất hữu cơ vùi trong ñất là chất hữu cơ nghèo lân thì qua quá trình phân giải không những hàm lượng lân hữu cơ trong ñất không tăng lên mà còn sụt xuống (Ivanop 1955). Theo những công trình nghiên cứu của Kaila (1954) nếu chất hữu cơ vùi xuống ñất chứa ít hơn 0,2 - 0,3% P2 05 thì quá trình phân giải không có tăng thêm về lân dễ tiêu cho cây vì vi sinh vật hút hết. Cường ñộ hút lân hữu cơ của ñất thông qua sự phân giải của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt ñộ. Theo Sepfe-Satsaben (1960) trong ñiều kiện nhiệt ñộ bình thường, ở các nước ôn ñới, sự khoáng hoá lân hữu cơ tiến hành rất chậm và lượng lân cung cấp cho cây từ những hợp chất hữu cơ không ñáng kể. Trái lại, ở nhiệt ñộ từ 35 - 500C thì quá trình khoáng hoá ñó tăng lên rất mạnh và cung cấp cho cây ñược nhiều lân từ những hợp chất hữu cơ. Vì thế, ở nước ta bón phân chuồng cũng có khả năng giải quyết ñược phần nào những triệu chứng thiếu lân của cây. 1.1.2. Lân vô cơ Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối của những nguyên tố Ca, Fe, Al. Ở ñất trung tính và ñất kiềm thì photphat Ca là chủ yếu, còn ở ñất chua thì photphat Fe, Al là chủ yếu. Photphat Ca dễ ñược huy ñộng ñể làm thức ăn cho cây hơn là photphat Fe, Al. Sự tồn tại của ion photphat trong môi trường ñất bị chi phối bởi ion photphat bị chuyển ñổi hoá trị. Trong thực tế, H2PO4- là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất. Các dạng lân còn lại thường là những loại khó hoà tan mà cây trồng không thể ñồng hoá ñược, muốn cây trồng sử dụng ñược phải qua chế biến, biến chúng thành dạng dễ tan. Cũng như các yếu tố khác, lân trong tự nhiên luôn luôn tuần hoàn chuyển hoá. Nhờ vi sinh vật, lân hữu cơ ñược vô cơ hoá biến thành dạng muối của axit photphoric. Các dạng lân này một phần ñược cây trồng sử dụng biến thành dạng lân hữu cơ, một phần bị cố ñịnh dưới dạng khó tan như Ca3(PO4)2, FePO4, AlPO4 . Những dạng khó tan này trong các môi trường có pH thích
7 hợp sẽ chuyển hoá và biến thành dạng dễ tan. Trong quá trình này vi sinh vật giữ vai trò quan trọng [4]. 1.1.3. Vòng tuần hoàn lân trong tự nhiên Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của nitơ. Trong khi nitơ luôn khan hiếm trong ñất thì lân tồn tại nhiều trong ñất ở dạng khó phân giải [2,14]. Nitơ ñược ñưa vào ñất nhờ vi sinh vật cố ñịnh ñạm từ không khí, còn ñối với lân, chúng ñược các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau. Vòng tuần hoàn của lân ñược biểu diễn trong sơ ñồ sau: Cây xanh Động vật PO43- trong dung dịch ñất PO43- bị hấp thụ Quá trình khoáng Hòa tan Quá trình cố ñịnh Lân vô cơ Cố ñịnh tạm thời Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật Chất hữu cơ mùn hóa 1.2. Sự chuyển hoá lân trong ñất 1.2.1. Đối với lân hữu cơ Tuỳ loại ñất tỷ lệ hữu cơ thường chiếm từ 20 - 80% lân tổng số trong ñất. Trong tầng ñất mặt, lân hữu cơ thường chiếm 50% tổng số lân trong ñất. Trong ñất, nhiều loại vi khuẩn và nấm có thể phân huỷ các
8 chất hữu cơ phức tạp ñể giải phóng lân dưới dạng vô cơ. Myskow cho rằng 70 - 80 tập ñoàn vi sinh vật ñất có khả năng khoáng hoá lân hữu cơ. Các vi sinh vật ñất tiết ra các enzyme khử photphoryl ñồng thời giải phóng ion photphat. Phản ứng men nhanh khi nó tác ñộng ñến các chất vừa mới bón vào ñất, phản ứng men chậm lại khi hợp chất lân ñã cải biến và phát triển trong ñất bằng cách tạo thành các phức liên kết với Fe, Al, các chất hữu cơ phân tử lượng cao như: Các dẫn xuất của phytin, axit nucleic , và bị giữ chặt trên các phần tử sét trong ñất. Tốc ñộ giải phóng lân phụ thuộc vào bản chất các hợp chất hữu cơ có lân: Axit nucleic dễ khoáng hoá hơn phytin. Nguyên nhân do hầu hết các vi sinh vật khoáng hoá lân hữu cơ ñều tiết ra các enzyme tương ứng ñể phân giải axit nucleic [19]. Nếu lượng C/P cao hơn 300 thì lân sẽ bị các vi sinh vật trong ñất cố ñịnh. Còn ở mức C/P nhỏ hơn 200, lân sẽ thừa nên ñược khoáng hoá [19]. pH tối thích là 6 – 7. Ở môi trường kiềm lân vô cơ ñược phóng thích nhanh hơn lân hữu cơ [19]. - Nhiệt ñộ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hoá lân hữu cơ. Tối thích là 40 – 50oC. Do ñó trong mùa hè tốc ñộ khoáng hoá lân mạnh hơn các mùa khác [19]. 1.2.2. Đối với lân vô cơ Sự tồn tại các loại ion photphat trong ñất phụ thuộc vào pH ñất. Do vậy, thực tế trong ñất, lân tồn tại chủ yếu ở hai dạng: H2PO4- và HPO42-. H2PO4- HPO42- PO43- Dung dịch acid Dung dịch kiềm Ở pH = 7 tỷ lệ 2 loại ion này gần bằng nhau. H2PO4- dễ ñồng hoá hơn HPO42-, nên về mặt lý thuyết ở pH = 5 – 6 dinh dưỡng lân của cây thuận lợi nhất. Song trong ñất do có mặt của nhiều ion khác mà vấn ñề trở nên phức tạp hơn.
9 1.2.2.1. Sự chuyển hoá lân ở ñất chua Trong ñất chua nghèo chất hữu cơ: Fe, Al và Mn thường nằm dưới dạng hoà tan phản ứng với H2PO4- tạo thành hợp chất không tan cây không ñồng hoá ñược Al3+ + H2PO4- + 2H2O 2H+ + Al(OH)3.H2PO4 Không tan Ở các loại ñất rất chua, Al3+ và Fe3+ vượt các ion H2PO4- nhiều làm cho phản ứng trên càng nghiêng theo chiều thuận, tạo thành lân không tan khiến cho chỉ còn một lượng rất nhỏ H2PO4- trong ñất. Ở ñất chua, ion H2PO4- không những phản ứng với Fe3+, Al3+ hoà tan mà còn phản ứng với các oxit ngậm nước của các nguyên tố ñó như gibbsit (Al2O3.3H2O) và goethit (Fe2O3.3H2O). Ở ñất chua số lượng lân bị các oxit sắt, oxit nhôm ngậm nước cố ñịnh còn vượt quá cả số lượng lân bị kết tủa với Fe, Al và Mn hoà tan. Al(OH)3 + H2PO4- Al(OH)2.HPO4- + H2O Điều ñáng lưu ý là hầu hết các loại ñất ñều chứa oxit sắt, nhôm ngậm nước nên ñây cũng là kiểu cố ñịnh khá nhiều lân và diễn ra trên phạm vi rộng. Trong môi trường chua còn có hai quá trình cố ñịnh lân liên quan tới sét. Đó là do sự tồn tại các ion OH- lộ trên bề mặt khoáng sét. Sự cố ñịnh này ñi kèm với việc giải phóng kiềm theo phản ứng sau: Sét – OH + Ca(H2PO4)2 sét – H2PO4- +1/2Ca(OH)2 Khả năng cố ñịnh thay ñổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ tự sau ñây: Illit > Kaolinit > Montmorillonit. [Al] + H2PO4- + 2H2O 2H+ + Al(OH)2.H2PO4
10 Vai trò của sắt và nhôm thể hiện qua thực tế là việc cố ñịnh các anion mạnh lên khi tỉ lệ SiO2/seoquioxit giảm, với các loại ñất ñã mất vôi nếu các seoquioxit cũng mất ñi thì khả năng cố ñịnh lân cũng giảm. Về vai trò của can xi, người ta thấy khi ñể cho sét hấp thụ Ca2+, tỉ lệ anion photphat ñược hấp thu tăng lên, bất chấp ngưỡng kết tủa canxi photphat. Điều ñó chứng tỏ rằng ñây là quá trình cố ñịnh ion chứ không phải bằng con ñường hoá học. Tính ổn ñịnh của quá trình giữ chặt này phụ thuộc vào ñiều kiện môi trường và việc giải phóng anion có thể xảy ra khi ñiều kiện môi trường thay ñổi và ñặc biệt là nếu sét bị giải keo. Ở ñất chua, các hydroxit sắt, nhôm lưỡng tính có thể mất 1 nhóm OH- trở thành keo dương tính tham gia hấp phụ trao ñổi anion: Al(OH)3 + H+ = Al(OH)2+ + H2O 1.2.2.2. Sự chuyển hoá lân ở ñất kiềm Trong môi trường kiềm giàu Ca, ion H2PO4- phản ứng mạnh với Ca tạo thành các hợp chất ít tan hơn theo các phản ứng lần lượt như sau [29]: Ca(H2PO4)2 + CaCO3 + H2O → 2CaHPO4.2H2O + CO2 6CaHPO4.2H2O + 2CaCO3 + H2O → Ca8H2(PO4)6.5H2O + 2CO2 Ca8H2(PO4)6.5H2O + CaCO3 → Ca3(PO4)2 + CO2 + 6H2O Lân trở nên kém hoà tan hơn khi gặp ñiều kiện thuận lợi và ñủ thời gian Ca3(PO4)2 có thể chuyển thành các hợp chất không tan hơn nữa như hydroxy, cacbon và ngay cả fluoro apatit. 1.3 Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân Vi sinh vật (microorganisms) là tên chung dùng ñể chỉ tất cả các loại sinh vật nhỏ bé chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi. Theo Hoàng Lương Việt (1978) trung bình một gam ñất khô có ñến gần 200 triệu tế bào vi sinh vật. Vi sinh vật có các nhóm chính sau: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi
11 tảo, virut [8]. Các nhóm có khả năng phân giải photphat là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Nghiên cứu của Puneet và cộng sự cho thấy: Việc nhiểm một số chủng nấm sợi có khả năng hoà tan photphat như Aspergillus flavus và Aspergillus niger với vi khuẩn cố ñịnh nitơ Azotobacter sp ñã tăng năng suất hạt 17.7% [6], trong khi ñó nhiễm Azotobacter sp chỉ làm tăng 9% . Kopoor và cộng sự cũng ñạt kết quả tương tự khi nghiên cứu sự phối hợp giữa chủng Azotobacter sp với các vi khuẩn phân giải photphat thuộc các chi Agrobacterium sp, Bacillus sp và Pseudomonas sp…[41]. Những vi sinh vật này có vai trò vô cùng quan trọng ñối với sản xuất nông, lâm nghiệp và con người.Vi sinh vật phân giải lân ñược chia thành 2 nhóm: Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ và vi sinh vật phân giải lân vô cơ. 1.3.1 Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ Sự chuyển hoá các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4 (Stoklaza – 1991, Menkina – 1952) theo sơ ñồ sau [4]: Nucleoprotein protein Acid nucleic 4C5H10O C6H5O C5H5O5 C5H5O5O2 C4H5O5O 4H3PO Acid amin O NH3 CO2 H2S H2O Chất khác
12 Sơ ñồ của quá trình phân giải nucleoprotein [7] cụ thể như sau: 1. Nucleoprotein Nuclein axit nucleic Nucleotic H3PO4 2. Lơxitin Glixerphosphat H3PO4 Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Pseudomonas. - Bacillus mycoides: Vi khuẩn hình que, dài khoảng 1,6 – 3,6 µ, rộng khoảng 0,5 - 1µ, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là vi khuẩn yếm khí, có tiêm mao ở ñầu và quanh cơ thể. Trên môi trường thạch, khuẩn lạc gần giống khuẩn lạc của nấm. Nó có thể phân giải lân hữu cơ, amôn hoá protit nhưng không sinh H2S [7] . - Bacillus megaterium var phosphaticum: Vi khuẩn hình que, có nha bào, yếm khí tuỳ tiện, có khả năng phân giải lân hữu cơ rất mạnh [7]. Bacillus là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử, chiều ngang của bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do ñó khi có bào tử vi khuẩn không thay ñổi hình dạng, bào tử của vi khuẩn này có sức sống rất lâu. Ngoài ra, còn có các vi khuẩn như: Bacillus cereus, Bacillus asterosporus, Pseudomonas sp cũng có khả năng phân giải lân hữu cơ. Ngày nay, ngoài vi khuẩn, người ta còn thấy xạ khuẩn, nấm cũng có khả năng phân giải lân hữu cơ [7]. 1.3.2. Vi sinh vật phân giải lân vô cơ Từ năm 1900 ñã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu vấn ñề này. J.Stoklasa dùng ñất ñã tiệt trùng có bón bột apatit và cấy vi khuẩn. Ông dùng Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus bytyricus. Sau khi cấy vi khuẩn và bón cho yến mạch có tác dụng tăng năng suất. Nhiều vi
13 khuẩn như Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hoá, một số vi khuẩn hệ rễ, nấm, xạ khuẩn cũng có khả năng phân giải Ca3 (PO4)2 và bột apatit. Ngoài ra, trong quá trình lên men butiric, lên men lactic, quá trình lên men dấm trong phân chuồng cũng có thể xúc tiến quá trình hoà tan Ca3(PO4)2. Vi khuẩn vùng rễ phân giải Ca3(PO4)2 mạnh. Ở hệ rễ lúa mì, thường có 30% vi khuẩn có khả năng phân giải Ca3 (PO4)2 và lượng phân giải so với ñối chứng tăng 6-18 lần [7]. Trong số nấm ñã thí nghiệm thì Aspergillus niger có khả năng phân giải lân mạnh nhất. Nhưng về cơ chế quá trình phân giải thì ñại ña số các nhà nghiên cứu ñều cho rằng sự phân giải Ca3(PO4) 2 có liên quan mật thiết với sự sản sinh axit trong quá trình sống của vi sinh vật, trong ñó axit cacbonic rất quan trọng. Chính H2 CO3 ñã làm cho Ca3 (PO4 )2 phân giải. Quá trình có thể phân giải theo phương trình sau [7]: Ca3 (PO4 )2 + 2 H2CO3 + H2 O → Ca(H2PO4 )2 . H2 O + 2 Ca(HCO3 )2 Trong ñất, vi khuẩn nitrat hoá và vi khuẩn chuyển hoá lưu huỳnh cũng có tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3 (PO 4 )2 . Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tích luỹ trong ñất HNO3 và H2 SO4 . Quá trình hoà tan có thể biểu thị theo các phương trình sau: 1. Ca3(PO4 ) 2 + 4 HNO 3 = Ca(H2 PO4 )2 + 2 Ca(NO3) 2 2. Ca3(PO4 ) 2 + 2 H2 SO4 = Ca(H2PO4 )2 + 2 CaSO4 Ngoài ra, theo một số tài liệu thì vi sinh vật ñất còn tham gia vào quá trình khử muối của axit photphoric ñể hình thành hidrophosfua [7]. 1.3.3. Các ñiều kiện ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của vi sinh vật - Độ pH: nhìn chung pH ít ảnh hưởng ñến khả năng phân giải lân. Tuy nhiên pH trong khoảng 7,8 – 7,9 ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân [27].
14 - Nhiệt ñộ: các chủng vi sinh vật có nhiệt ñộ thích hợp cho quá trình phân giải lân là khác nhau. Nhìn chung khoảng nhiệt ñộ thích hợp nằm trong khoảng 20 – 40oC [27]. - Hợp chất hữu cơ: chất hữu cơ làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Do ñó khả năng phân giải lân của chúng sẽ tăng lên. - Độ ẩm: ở những nơi có ñộ ẩm cao, do hoạt ñộng của vi sinh vật mạnh nên tạo ra nhiều axit hữu cơ làm tăng phân giải lân [27]. - Hệ rễ: hệ rễ cây trồng khích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật. Do ñó phân giải lân cũng ñược tăng cường [27]. Tuy nhiên một số loài cây có thể tiết ra các chất ñộc ngăn cản sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật. - Tỷ lệ N và C trong môi trường: N, C là những thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Tỉ lệ N, C trong môi trường cao sẽ thúc ñẩy khả năng phân giải lân [27]. 1.4. Hàm lượng lân trong ñất nâu ñỏ trên ñá bazan Đất bazan là một loại ñất rất giàu lân tổng số,nhưng các quá trình cố ñịnh lân từ dễ tiêu thành dạng khó tiêu thường xuyên xảy ra nên lượng lân dễ tiêu luôn ở mức nghèo. Theo Fridland (1973) ñất bazan nâu ñỏ là loại ñất hình thành trên ñá bazan, trong ñiều kiện nhiệt ñới ẩm, các bazơ bị rửa trôi mạnh , ñất có phản ứng chua , sắt nhôm tích luỹ nhiều .Đây là nguyên nhân chủ yếu của quá trình giữ chặt lân trên ñất bazan. Nguyễn Tử Siêm (1990) , Nguyễn Vy (1993) lân là yếu tố hạn chế hàng ñầu ñối với tất cả các cây trồng trên ñất ñồi nói chung và ñất bazan nâu ñỏ nói riêng [23, 31]. Các tác giả Lê văn Căn (1978), Vũ Cao Thái (1989), Lê Đình Sơn, Đoàn Triệu Nhạn (1990) khi nghiên cứu tính chất hoá học ñất ñỏ bazan ñều có chung nhận xét ñất giàu lân tổng số nhưng nghèo lân dễ tiêu [1, 28,25].
15 1.5. Tổng quan về ñất bazan nâu ñỏ ở Đak Lak Theo hệ thống phân loại ñất của FAO – UNESCO (1995), Đak Lak có 11 nhóm và 84 ñơn vị ñất ñai. Trong ñó, nhóm ñất xám chiếm diện tích lớn nhất 44%. Nhưng nhóm ñất xám thường phân bố ở những vùng ñất dốc, về bản chất có ñộ phì thấp, chua, hàm lượng lân tổng số và lân dễ tiêu thấp. Như vậy, nhóm ñất xám không thuận lợi cho việc trồng các loại cây trồng. Nhóm ñất chiếm diện tích nhiều thứ 2 ở Đak Lak là ñất bazan ñỏ (Ferrasols). Diện tích ñất bazan ñỏ khoảng 311.340 ha, chiếm 23.7% diện tích ñất tự nhiên. Phân bố tập trung tại các khối bazan Buôn Ma Thuột. Nhóm ñất này có các ñơn vị phân loại: Nâu ñỏ trên Bazan (Fk), nâu vàng trên bazan (Fu), là nhóm ñất có tầng B tích tụ nhôm rõ nhất. Đất ñược phân bố tập trung ở khối bazan Buôn Ma Thuột chảy từ bắc xuống Nam, từ Đông sang Tây. Phía Bắc cao nguyên (Ea H'Leo) có ñộ cao 800m, phía Nam ñộ cao 400 m, phía Tây cao 300m (khu vực huyện Cư M'gar), bề mặt cao nguyên rất bằng phẳng [32]. Đất bazan nâu ñỏ hình thành và phát triển trên các cao nguyên Bazan phần lớn có ñộ dốc thấp, tầng ñất mịn dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khi ẩm, ñộ xốp trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt... Rất thích hợp với các loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao: cà phê, cao su, tiêu và những cây ăn quả khác... [32]. Tuy nhiên, ñiểm hạn chế của nhóm ñất này là hàm lượng lân dễ tiêu thấp, lượng P2O5 dễ tan nhỏ hơn 1,0 mg/100 g ñất. Trong khi ñó, lân tổng số của nhóm ñất này lại cao, P2O5 tổng số trên 0.2% [32]. 1.6. Vai trò sinh lý của nguyên tố lân trong cây Lân là thành phần cấu trúc bắt buộc của các chất hữu cơ trong cây, ñóng vai trò hoạt hoá các ñường ñơn, axit amin , các nhóm hoạt ñộng (NAD, NADP,...), tham gia vào các quá trình trao ñổi chất, trao ñổi năng lượng (ATP), phân chia tế bào , thúc ñẩy ra hoa, hình thành quả, quyết ñịnh phẩm
16 chất nông sản, hạt giống, kích thích rễ phát triển và hạn chế tác hại của việc bón thừa ñạm Phạm Đình Thái , Nguyễn Duy Minh , Nguyễn Lương Hùng , 1987 [29]. Theo Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng 2006 [26] : lân tham gia vào thành phần của axit nucleic (ADN và ARN) có vai trò quan trọng trong quá trình di truyền của cây, quá trình phân chia tế bào và sinh trưởng của cây. Do vậy giai ñoạn còn non hoặc giai ñoạn hoạt ñộng sống mạnh thì hàm lượng lân trong cây thường cao hơn các giai ñoạn khác. Lân tham gia vào thành phần của photpholipit. Đây là hợp chất rất quan trọng cấu tạo nên màng sinh học trong tế bào như màng sinh chất, màng không bào, màng quang hợp. các màng này có chức năng bao bọc , quyết ñịnh tính thấm, sự trao ñổi chất và năng lượng. Lân có mặt trong hệ thống ADP, ATP là các chất dự trữ và trao ñổi năng lượng sinh học trong cây. Chúng như những acqui tích luỹ năng lượng của tế bào. Liên kết cao năng phosphat (˜ P) chứa 7- 10 Kcal năng lượng và là phương thức tích luỹ năng lượng quan trọng nhất ñược sử dụng cho tất cả các hoạt ñộng sống trong cây, tham gia vào nhóm hoạt ñộng của các coenzym oxy hoá khử là NAD, NADP, FAD, FMN. Đây là các coenzym cực kì quan trọng trong các phản ứng oxy hoá khử trong cây, ñặc biệt là quá trình hô hấp, quá trình ñồng hoá nitơ. Theo Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ và Lê Thị Hoa (1991) trong các quá trình trao ñổi chất, phospho giữ vai trò trung tâm vì nó tham gia trong việc cấu tạo nên ADP, ATP là những hợp chất giàu năng lượng sinh học. ATP ñược hình thành trong quang hợp, hô hấp, ñược sử dụng cho nhiều quá trình sinh lý quan trọng như hút nước và các chất khoáng, trao ñổi và vận chuyển các chất trong cây và ñặc biệt là trong quá trình sinh tổng hợp những chất hữu cơ quan trọng như protein. Vì vậy, khi thiếu photphat thì cây phát triển chậm, quá trình hô hấp trong rễ bị cản trở, hô hấp bị ức chế dẫn ñến thiếu các sản phẩm trung gian tiếp nhận NH4+ từ ñất, ảnh hưởng ñến chu trình trao ñổi nitơ của cây [10].
17 Trong cây, lân chủ yếu nằm dưới dạng hữu cơ và một phần nhỏ dưới dạng vô cơ. Lân vô cơ ñóng vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ thống ñệm của tế bào và là nguồn dự trữ cần thiết cho sự tổng hợp lân hữu cơ. Đủ lân, biểu hiện trước hết là cây sinh trưởng tốt, hệ thống rễ phát triển, ñẻ nhánh khỏe, xúc tiến hình thành cơ quan sinh sản..., tiến hành trao ñổi chất và năng lượng mạnh mẽ, xúc tiến các hoạt ñộng sinh lý ñặc biệt là quang hợp và hô hấp... kết quả là tăng năng suất cây trồng Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch và Vũ Quang Sáng (2006) [26]. Thiếu lân làm cho các quá trình sinh lý trong cây bị rối loạn, sự tổng hợp diệp lục bị ảnh hưởng, các quá trình photphoryl hoá, hút dinh dưỡng, tổng hợp chất hữu cơ và các chất thơm bị giảm sút, ñồng thời làm giảm khả năng chống chịu với các ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi, hạn chế và kéo dài quá trình hình thành, phân hoá mầm hoa, chất lượng nông sản giảm... Phạm Đình Thái, Nguyễn Duy Minh và Nguyễn Lương Hùng (1987) [29]. Theo Nguyễn Tử Siêm, Trần Khải (1996) khi nhiệt ñộ tăng, ñất có ñộ ẩm cao thì lân ñược hấp thu tốt hơn. Sự phát triển của bộ rễ có ý nghĩa quyết ñịnh với dinh dưỡng lân. Độ dài rễ và tốc ñộ ra rễ tỉ lệ thuận với tỉ lệ lân hấp thụ [24]. Lân làm tăng sự phát triển của hệ rễ làm cho cây hút ñược nhiều nước , nhiều chất dinh dưỡng trong ñất hơn (Võ Minh Kha, 1996) [15]. Như vậy, lân ñóng vai trò rất quan trọng trong việc kích thích sự phát triển của bộ rể, tăng cường khả năng hút nước và các chất khoáng của cây. Khi ñủ lân, bộ rễ phát triển mạnh do ñó năng lực hút nước và trữ nước của bộ rễ sẽ cao hơn, nên khả năng huy ñộng nước ở tầng sâu lên và giữ ở vùng rễ (thông qua lực hút và dịch rễ) tốt hơn, nhờ vậy ẩm ñộ ñất ở tầng ñất mặt sẽ ñược nâng cao và ổn ñịnh.
18 1.7. Công nghệ lên men 1.7.1. Giống vi sinh vật Muốn có sản phẩm tốt ngoài qui trình công nghệ thì khâu giống là quan trọng nhất, nó quyết ñịnh chất lượng sản phẩm và giá trị kinh tế của qui trình sản xuất. Trong công nghệ lên men, người ta sử dụng rộng rãi nhiều loại vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam, nấm men, nấm mốc, tảo. - Tiêu chuẩn của giống: vi sinh vật tốt; có khả năng sinh tổng hợp tạo sinh khối với hiệu suất cao; có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm, các phế thải; trong quá trình lên men không tạo ra các phẩm phụ không mong muốn; ít mẫn cảm ñối với sự tạp nhiễm do vi sinh vật khác; sản xuất sinh khối có thể tách dễ dàng ra khỏi môi trường dinh dưỡng. Tuy nhiên trong quá trình sản xuất, các tiêu chuẩn trên không phải gắn liền với nhau. Các vi sinh vật thuộc nhóm Eukaryote có kích thước tế bào lớn thể hình sợi, do ñó dễ dàng tách chúng ra khỏi môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp lọc ly tâm thông thường. Nhưng ở chúng thường tồn tại một qui tắc chung là kích thước tế bào tỷ lệ nghịch với hoạt tính trao ñổi chất. - Các công việc chủ yếu của công tác giống trong sản xuất: Kiểm tra ñộ thuần khiết của giống trong lên men; Kiểm tra khả năng hồi biến của giống; Hoạt hoá giống sau một thời gian sử dụng, ñể hoạt hoá giống người ta sử dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất kích thích sinh trưởng; Giữ giống bằng phương pháp thích hợp có thể duy trì những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hoá, mất hoạt tính. - Các phương pháp giữ giống :
19 Hiện nay thường sử dụng 4 phương pháp chính ñể giữ giống vi sinh vật ñó là: + Bảo quản trên môi trường thạch, ñịnh kì kiểm tra cấy truyền Giống vi sinh vật ñược giữ trên môi trường thạch nghiêng (ñối với các giống vi sinh vật hiếu khí) hoặc trích sâu vào môi trường thạch (ñối với vi sinh vật kị khí). Các ống giống ñược bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ñộ 3 - 50C. Định kì kiểm tra ñể cấy truyền giống, tuỳ từng giống vi sinh vật khác nhau mà ñịnh kì cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối ña là 3 tháng. + Giữ giống trong cát hoặc ñất sét vô trùng Do cấu trúc hoá lý cát và sét là những cơ chất tốt mang các tế bào vi sinh vật, chủ yếu là nhóm vi sinh vật có bào tử. Cách làm như sau: Cát và ñất ñược xử lý sạch, sàng lọc qua rây, xử lý pH ñạt trung tính, sấy khô và khử trùng. Sau ñó bằng thao tác vô trùng trộn bào tử và cơ chất cát hoặc ñất trong các ống nghiệm. Dùng paraffin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm ñể giúp cho ống giống không bị ẩm trở lại. Ngoài cát và ñất, người ta còn giữ giống trong hạt ngũ cốc hay trên silicagen…Phương pháp bảo quản giống trên chủ yếu cho nấm mốc và xạ khuẩn. + Giữ giống bằng phương pháp lạnh ñông Bằng phương pháp này dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh vật, ñưa chúng vào ñiều kiện lạnh sâu ở -250C ñến -700C. Người ta trộn vi sinh vật với dung dịch bảo vệ hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá như glycerin 15%, huyết thanh ngựa (loại không cho chất bảo quản), dung dịch glycose hoặc lactose 10%…Việc làm lạnh ñược tiến hành một cách từ từ. Khi ñộ lạnh ñạt -200C, nếu tiếp tục làm lạnh thì tốc ñộ làm lạnh phải ñạt 1 – 2oC/phút. Phương pháp bảo quản này có ưu ñiểm là bảo quản ñược lâu.
20 + Giữ giống bằng phương pháp ñông khô Về nguyên tắc cũng giống như phương pháp ñông lạnh nhưng khác ở chỗ là ñưa chất bảo vệ vào như glutamate 3% hay lactose 1,2% + pepton 1,2% hay saccharose 8% + sữa 5% + gelatin 1,5%. Đây là phương pháp bảo quản tối ưu nhất hiện nay, có thể tới vài chục năm mới phải làm lại. 1.7.2. Nhân giống vi sinh vật Mục ñích của việc nhân giống là ñể tăng số lượng tế bào vi sinh vật. Trong quy trình lên men thì tuỳ chủng giống vi sinh vật khác nhau mà nhân theo cơ chất và môi trường nhân khác nhau. Thường có hai dạng giống: tế bào sinh dưỡng và bào tử. - Trường hợp giống là tế bào sinh dưỡng: Để thu ñược lượng tế bào sinh dưỡng, người ta chọn môi trường nhân sinh khối là môi trường ñảm bảo cho vi sinh vật tồn tại thích hợp nhất, ñể với thời gian ngắn nhất cho sinh khối vi sinh vật lớn nhất. Trong trường hợp này thường dùng môi trường dịch thể (nuôi cấy chìm). - Trường hợp giống là bào tử ñính: Thông thường chọn môi trường ñặc (nuôi cấy bán rắn: cám gạo, bột ngô, thóc …). Khi kết thúc mỗi khâu nhân giống cần kiểm tra ngay ñộ thuần của giống và mật ñộ tế bào vi sinh vật cần nhân. 1.7.3. Lên men Là giai ñoạn nuôi cấy vi sinh vật ñể chúng tạo sản phẩm hoặc sinh khối vi sinh vật….Đây là khâu quyết ñịnh một quy trình lên men. Để thực hiện lên men, người ta thường sử dụng hai phương pháp là lên men bề mặt và lên men chìm.