Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:108

Thêm vào BST

Báo xấu

134
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn giới thiệu tới các bạn về việc phân lập và tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính Cellulase, nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM 19.1 và ĐM20.2, khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp Cellulase của hai chủng Bacillus.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thùy Dương NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thùy Dương NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. TRẦN THANH THỦY – Người đã hết lòng dạy dỗ, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy, Cô khoa Sinh học đặc biệt là cô Tuyến và Ths. Minh Định phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian theo học và tiến hành đề tài. Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục – Đào tạo tỉnh Tiền Giang, Trường THPT Vĩnh Bình – Tiền Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian đi học. Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên và luôn bên cạnh tôi.
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào. Tác giả luận văn Nguyễn Thùy Dương
iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i Lời cam đoan ................................................................................................................... ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục các chữ viết tắt .............................................................................................. vi Danh mục các bảng ....................................................................................................... vii Danh mục các hình ....................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3 1.1. Vi khuẩn Bacillus .................................................................................................. 4 1.1.1. Đặc điểm chung ............................................................................................. 4 1.1.2. Hệ enzyme của Bacillus.............................................................................. 6 1.1.3. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus .................................................. 7 1.2. Cellulose và enzyme cellulase ............................................................................... 9 1.2.1. Cellulose ..................................................................................................... 9 1.2.2. Sơ lược về enzyme cellulase ..................................................................... 10 1.2.3. Phương pháp nuôi cấy VSV để thu nhận enzyme cellulase ..................... 20 1.3. Sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme ..................................................................... 22 1.3.1. Hiện tượng cảm ứng ................................................................................. 22 1.3.2. Mô hình cảm ứng operon Lac ................................................................... 23 1.3.3. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng................................................................ 27 1.3.4. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme .................................................... 28 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30 2.1. Nguyên vật liệu.................................................................................................... 31 2.2. Hóa chất, thiết bị.................................................................................................. 31 2.2.1. Hóa chất .................................................................................................... 31 2.2.2. Thiết bị ...................................................................................................... 31 2.3. Các môi trường sử dụng ...................................................................................... 31
iv 2.4. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 33 2.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus ....................................................................... 33 2.4.2. Phương pháp bảo quản giống ................................................................... 34 2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc ..................................................................... 34 2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram .......................................................................... 34 2.4.5. Phương pháp nhuộm bào tử ........................................................................ 35 2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính catalase ..................................................... 36 2.4.7. Phương pháp định danh đến loài bằng sinh học phân tử .......................... 36 2.4.8. Phương pháp chiết dung dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy VK .. 37 2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ................................................................................................................ 38 2.4.10. Xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS39 2.4.11. Phương pháp định lượng cellulose ........................................................... 41 2.4.12. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng ................ 42 2.4.13. Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy để thu nhận cellulase .................................................................................................................. 42 2.4.14. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô ........................... 43 2.4.15. Phương pháp khảo sát một vài đặc điểm cellulase của chủng Bacillus được chọn ............................................................................................................... 43 2.4.16. Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................... 44 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................... 45 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase ............................. 46 3.1.1. Phân lập..................................................................................................... 46 3.1.2. Tuyển chọn sơ bộ ...................................................................................... 47 3.1.3. Tuyển chọn lần hai .................................................................................... 48 3.1.4. Tuyển chọn lần ba ..................................................................................... 50 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ................... 52 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng Bacillus ................................................................................ 54 3.3.1. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng ................................................. 54
v 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ................................................ 56 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng Bacillus ............................................................................................... 58 3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ............................................................ 58 3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................... 59 3.4.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu ...................................................................... 63 3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................ 65 3.5. Định danh chủng ĐM19.1 đến loài bằng sinh học phân tử ................................. 68 3.6. Thu nhận cellulase thô từ canh trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens ĐM19.1 69 3.7. Khảo sát một vài đặc điểm CPE cellulase của B. amyloliquefaciens ĐM19.1 ... 70 3.7.1. Khảo sát giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzyme ........................ 70 3.7.2. Khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzyme .............. 72 3.7.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme ...................... 73 3.7.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên lượng glucose tạo thành75 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 77 4.1. Kết luận ............................................................................................................... 77 4.2. Kiến nghị............................................................................................................. 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 79 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 89
vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE Chế phẩm enzyme CPE B Chế phẩm enzyme của chủng B. amyloliquefaciens CMC Carboxymethyl cellulose DNS Acid 3,5 – dinitrosalicylic KL Khuẩn lạc KHV Kính hiển vi MT Môi trường NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NXB Nhà xuất bản OD Mật độ quang TB Tế bào STT Số thứ tự VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số enzyme ngoại bào của Bacillus ...................................................... 6 Bảng 1.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ B. subtilis .............................................. 14 Bảng 2.2. Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS ........................................................................................................................... 40 Bảng 3.1. Vòng phân giải CMC của 69 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase ....... 48 Bảng 3.2. Tóm tắt khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .......... 50 Bảng 3.3. Hoạt độ cellulase của 8 chủng VK được chọn ......................................... 51 Bảng 3.4. Kết quả 3 lần tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase cao ........ 52 Bảng 3.5. Đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ........................... 52 Bảng 3.6. Hàm lượng cellulose trong các loại cơ chất ............................................. 54 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ........................................................................................................... 55 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ........................................................................................................... 56 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ..... 57 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus 60 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ...................................................................................................................... 62 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus64 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus .... 66 Bảng 3.14. Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp cellulase của 2 chủng Bacillus ........................................................................................................... 67 Bảng 3.15. Kết quả thu nhận enzyme thô từ Bacillus amyloliquefaciens ĐM19.1 .. 69 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B .......................................... 70 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của CPE B ..................... 71 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B .................................. 73 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của CPE B ................................. 74
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của exoglucanase ......................................................... 11 Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của endoglucanase ...................................................... 11 Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của β –glucosidase ....................................................... 12 Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson ................................................. 12 Hình 1.5. Cấu trúc của operon lac ............................................................................. 23 Hình 1.6. Promoter của operon lac............................................................................ 24 Hình 1.7. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy không có chất cảm ứng .... 25 Hình 1.8. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy có chất cảm ứng ............... 26 Hình 1.9. Sự điều hòa enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược ................................ 29 Hình 3.1. Hình thái KL của một số chủng VK phân lập được .................................. 46 Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của một số chủng VK phân lập được bằng phương pháp cấy chấm điểm .................................................................................................. 47 Hình 3.3. Vòng phân giải CMC của một số chủng VK phân lập được bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân ......................................................................... 49 Hình 3.4. Vòng phân giải CMC của 8 chủng VK có hoạt tính cellulase cao nhất ... 50 Hình 3.5. Hoạt độ cellulase của 8 chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải lớn nhất ...................................................................................................................... 51 Hình 3.5. Hình thái KL của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 .................................... 53 Hình 3.6. Hình thái tế bào của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ................................ 53 Hình 3.7. Bào tử của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ............................................... 53 Hình 3.9. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ........................................................................................................... 55 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ........................................................................................................... 57 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ... 58 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus 60 Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ...................................................................................................................... 62
ix Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus64 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ..... 66 Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B .......................................... 70 Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của CPE B ...................... 72 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B .................................. 73 Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của CPE B ................................. 75
1 MỞ ĐẦU Lí do chọn đề tài Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên, ở Jerico người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, việc nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… đã được thực hiện. Ở các mức độ khác nhau, đây là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. So với nguồn enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ VSV có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ VSV rất ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp. Qua nhiều năm, việc sử dụng VSV như một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn với giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể và làm giảm tác động xấu tới môi trường. Trong các VSV phải kể đến các loài VK thuộc chi Bacillus. Các ứng dụng của Bacillus có liên quan đến enzyme ngày càng tăng và hiệu quả ngày càng cao. Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu. Hệ enzyme của Bacillus rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, pectinase. Trong đó,
2 cellulase - hệ enzyme thủy phân cellulose – là một enzyme đã được sản xuất với qui mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi trong trong nhiều ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt, tẩy, sản xuất ethanol; trong nông nghiệp, cellulase được dùng trong xử lý đất để tăng độ màu mỡ. Nhằm đa dạng hóa nguồn cung cấp enzyme cellulase từ VSV và nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp cellulase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn”. Mục tiêu của đề tài Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulase của các chủng Bacillus phân lập từ đất vườn . Nhiệm vụ của đề tài 1. Phân lập được một số chủng Bacillus sinh enzyme cellulase từ đất vườn. Từ đó, tuyển chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao. 2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng đã chọn. 3. Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase cao. Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase cao. 4. Xác định các điều kiện môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase. 5. Phân loại đến loài 1 chủng Bacillus sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao nhất. 6. Xác định hiệu suất thu nhận của chế phẩm enzyme thô từ chủng cho hoạt tính cellulase cao nhất. 7. Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm enzyme thô. Thời gian và địa điểm nghiên cứu − Thời gian: từ tháng 11/2011 đến tháng 09/2012 − Địa điểm: thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh-Sinh hóa, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4 1.1. Vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Đặc điểm chung Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Vibrio subtilis”. Bacillus là VK Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 – 2,5)x(1,2 – 10)μm. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động. Bacillus có khả năng sinh bào tử. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, có khả năng tồn tại trong nhiều năm. Bào tử của VK không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ hình thức thích nghi giúp VK vượt qua những điều kiện sống bất lợi. Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao đổi năng lượng thông qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếu khí. Nhiều loài Bacillus tiết enzyme ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hóa các hợp chất cao phân tử trong môi trường (những chất không thể chuyển vào TB vì quá lớn) thành các chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn cacbon và năng lượng. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophilus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus acidocaldrius [5]. Có nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt độ cao (450C – 750C) hay ưa lạnh (50C – 250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 300C – 370C. Phần lớn Bacillus là những VK dị dưỡng hóa năng, thu năng lượng do oxy hóa các hợp chất hữu cơ. Một số VK ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc (B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO 2 và CO là nguồn cacbon duy nhất. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác (B. sphaericus, B. cereus) cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, acid amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B. popilliae, B. lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy thông thường như: NA, NB [46]. Các loài thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong nước, không khí đặc biệt là trong đất do có khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Dưới đây là một số loài Bacillus thường gặp.
5 B. subtilis – KL khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, hơi nhăn, tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào MT thạch. Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, TB đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Bào tử hình bầu dục, phân bố lệch tâm. B. amyloliquefaciens có hình thái KL và TB tương tự B. subtilis nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa. Thành phần G + C của B. subtilis khoảng 41,5% - 43,5%, còn trong chủng B. amyloliquefaciens là 43,5% - 44,9%. B. amyloliquefaciens có khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm. B. licheniformis là VK hoại sinh, bào tử hình oval, phát tán chủ yếu trong đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. KL nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B. subtilis. KL nhỏ, TB gần giống tế bào B. subtilis. B. megaterium – KL hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép tròn hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem. Tế bào B. megaterium dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm. B. simplex – KL có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường. Tế bào B. simplex nhỏ, thường đứng riêng rẽ, không gắn thành chuỗi, bào tử hình bầu dục nằm lệch tâm. B. brevis – KL màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh, mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc.Trực khuẩn đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, nằm cuối tế bào làm cho TB có một đầu hơi phồng. B. polymyxa – KL vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào B. polymyxa đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn. bào tử hình bầu dục, trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa TB. B. aslersporus – KL nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày, đồng chất. TB đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, nằm giữa TB. Khi hình thành bào tử TB phồng lên một chút giống như dạng Clostridium.
6 1.1.2. Hệ enzyme của Bacillus Bacillus có hệ enzyme ngoại bào rất đa dạng. Một số enzyme ngoại bào phổ biến của Bacillus được tóm tắt ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Một số enzyme ngoại bào của Bacillus [64], [68] Enzyme Tên chủng Bacillus Amylase B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. polymyxa, B. stearothermophilus, B. caldolyticus, B. subtilis, B. Licheniformis, B. megaterium, Bacillus spp. Cellulase B. subtilis, B. brevis, B. fimus, B. polymyxa, B. pumilus, B. amyloliquefaciens. Xylanase B. amyloliquefciens, B. fimus, B. polymyxa, B. subtilis var. amylosacchariticus. Alkalophilic Alkalophilic Bacillus spp. protease Serine-metal B. licheniformis, B. pumilus. protease Serine protease B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. subtilis var. amylosacchariticus. Metal protease B. amyloliquefciens, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. polymyxa, B. subtilis, B. subtilis var. amylosacchariticus, B. thermoproteolyticus, B. thuringiensis.  Amylase là nhóm enzyme thủy phân tinh bột bao gồm nhiều enzyme khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng lên tinh bột (vị trí khác nhau trên mạch tinh bột) như α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi hơn cả, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm.
7 Amylase của Bacillus có thể chịu được nhiệt độ cao, có thể giữ được hoạt lực ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn. Tính bền nhiệt này là một ưu điểm lớn được sử dụng để xử lí nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt độ cao hoặc MT nhiệt đới như ở nước ta. Ở Nhật, hàng năm sản xuất tới 7 000 tấn amylase từ VK [21].  Protase là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide của protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Nhiều protease còn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc amin [3], [2]. Protease Bacillus có đủ loại, tùy theo pH thích hợp người ta chia ra protease acid tính, kiềm tính và trung tính. Protease cũng như amylase có ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm.  . Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-D-glucosid trong cellulose. Cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường. Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là không ít. Ngày nay, nhiều nước đã sản xuất chế phẩm cellulase từ VSV trong công nghiệp ở qui mô lớn và áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. 1.1.3. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả năng sinh các loại enzyme như protease, amylase, cellulase, lipase, urease… Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide acid, inosinic acid, guanilic acid, kháng sinh. Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin hay subtilin có hoạt tính kháng khuẩn [49]. Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh hóa khác như tổng hợp protein tinh thể (B. sphaericus, B. thurigiensis) hay tổng hợp một số chất kháng khuẩn bản chất polypeptide (baxitraxin, tyroxidin, gramixidin,
8 polymidin). Nhiều kháng sinh polypeptide được mô tả chi tiết về tính chất hóa học và chức năng. Căn cứ vào thành phần cấu tạo và chức năng tác dụng, người ta chia kháng sinh polypeptide thành 3 lớp: - Adeine: có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào VK. - Baxitraxin: có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng TB. - Gramixidin, polymidin, tyroxidin: có tác dụng sửa đổi và cấu tạo chức năng của màng [76]. Baxitraxin là nhóm quan trọng nhất, được tổng hợp từ VK B. licheniformis và B. subtilis. Baxitraxin có hoạt tính sinh học đa dạng: kích thích phân giải TB, tạo TB trần, ngăn cản sự đồng hóa các acid amin tổng hợp mucopeptide thành TB. Baxitraxin có hiệu lực chống các VK Gram dương như: Actinomyces, Clostridium, Staphylococcus, Haemophilus, Diplococcus, Corynebacterium… Baxitraxin được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm để bảo quả thịt cá, trong y học điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong bảy loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng và phòng chống bệnh [19]. Hiện nay, một số chủng Bacillus như B. laterosporus, B. fimus và B. cereus đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate). Bacillus pasteurii được đưa vào đất ướt để tạo ra calcite – một chất xi măng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các toà nhà và giúp chúng chịu được động đất [77] . Trong công nghệ thực phẩm, người ta ứng dụng VK Bacillus để sản xuất các enzyme quan trọng. Chế phẩm amylase từ B. subtilis, B. diastaticus chịu nhiệt độ cao được dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột trước khi đường hóa rất tốt, ở nhiệt độ 80 – 900C/ 10 – 15 phút α-amylase của VK bị vô hoạt một phần rất nhỏ [22]. Chế phẩm protease từ B. subtilis có khả năng thủy phân tốt protein (gọi tên là subtilizin), từ B. mensentericus thủy phân tốt protid đến acid amin và đông tụ được sữa nên được ứng dụng để thay thế một phần renin sản xuất phomat, rút ngắn thời gian trong trong quy trình sản xuất nước mắm và cải thiện hương vị của nước mắm.
9 Trong chế phẩm sinh học, B. thuringiensis được ứng dụng làm thuốc trừ sâu vi sinh, B. thuringiensis làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng. Do có khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với các VSV gây bệnh (Streptococcus pyogenes, E. coli, Samonella, Vibrio spp) nên Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người. Trong công nghệ sinh học, Bacillus còn được dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzyme, acid amin, vitamin và polysaccharide. Các chủng B. brevis có khả năng tiết nhiều protein nhưng không tiết protease vào MT nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật có vú và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1-β của bò, hormon tăng trưởng của cá bơn, antigen virus viêm gan B,…[54], [68], [76]. 1.2. Cellulose và enzyme cellulase 1.2.1. Cellulose Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murahima, 2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm. Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác, giấy vụn, mùn cưa…Trong số này có đến 30% là màng TB thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ. Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là disaccharid gọi là cellobiose có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, có những phần đặc biệt gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình [30].