Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Pectinase ở một số chủng Bacillus

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

96
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Pectinase ở một số chủng Bacillus là nhằm nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp Pectinase của một số chủng Bacillus; nâng cao hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzym Pectinase từ các chủng Bacillus được chọn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Pectinase ở một số chủng Bacillus

THƯ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THỊ MAI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS-TS: PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2010
Lời cảm ơn Để có được kết quả của luận văn này, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS-TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Đã đưa ra phương hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em xin gởi lời cảm ơn đến: Anh TRẦN QUỐC TUẤN Đã luôn động viên và hỗ trợ em rất nhiều trong công việc. Em vô cùng biết ơn các Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm tp Hồ Chí Minh, đặc biệt là TS. TRẦN THỊ THANH THỦY, đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý báu trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn lớp cao học vi sinh K18 đã cùng tôi học tập, động viên và có những trợ giúp cần thiết đúng lúc cho tôi. Cuối cùng, con xin gởi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã yêu thương và luôn ủng hộ con tiếp bước trên con đường học vấn của mình.
Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện không sao chép của người khác. Đặng Thị Mai Phương
MỞ ĐẦU Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp. Trong số các enzym thì pectinase có ứng dụng khá rộng rãi chỉ sau amylase và protease. Trong ứng dụng, pectinase được chia làm hai nhóm chính là: pectinase acid và pectinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu được thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong li trích và chế biến các loại nước ép trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được li trích chủ yếu từ vi khuẩn và dùng trong chế biến các cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải và lên men trà, cà phê. Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật và nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase của một số chủng Bacillus ”. Mục tiêu của đề tài: - Nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase của một số chủng Bacillus - Nâng cao hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzym pectinase từ các chủng Bacillus được chọn. Nội dung của đề tài bao gồm: - Xác định đường kính vòng phân giải pectin của enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus. Từ đó chọn lọc một hoặc hai chủng có vòng phân giải lớn nhất - Nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được trên những môi trường nuôi cấy khác nhau (không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase. - Xác định và so sánh hoạt tính enzym pectinase trong canh trường vừa thu nhận được trong điều kiện có và không có chất cảm ứng. - Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao. - Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao nhất.
- Từ các nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn. - Khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn. - Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm thu được sản lượng pectinase cao. - Nuôi cấy thử nghiệm các chủng vi khuẩn Bacillus được chọn trên môi trường tối ưu hóa để kiểm tra mô hình tối ưu. - Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase như: pH, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời gian phân hủy cơ chất và xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại lên sự hoạt động của enzym. - Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính các chế phẩm enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ENZYM PECTINASE 1.1.1. Giới thiệu chung Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzym này. [44] Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997). [44] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001) [44] Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Đây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease. [9] Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym pectinesterase.[16] Nhiệt độ tối ưu của enzym pectinase thường khoảng 45-550 C[52] 1.1.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước  Nghiên cứu trong nước Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus.  Nghiên cứu ngoài nước
Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000). [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48] Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) đã “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” . [20], [23], [39], [46] Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). [18], [27], [31], [32], [45], [48] Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol,...gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37] 1.1.3. Cơ chất của enzym pectinase
Pectin là cơ chất của enzym pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl* của acid galacturonic có thể được ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na+, K+ hoặc NH4+, hay bị decacboxyl hoá …[30] Công thức nguyên của acid galacturonic: C6H10O7 Công thức cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1. Hình 1.1: Cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo của pectin Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986). [30]  Protopectin Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982). [30] Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau. Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. [16]  Acid pectic ( acid polygalacturonic)
Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng muối của acid pectic gọi là pectat.  Acid pectinic Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp)[30]  Pectin Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic là thành phần chủ yếu. [30] Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [55] Hàm lượng pectin Trái cây (% trọng lượng tươi) Táo 0,71-0,84 Chuối 0,59-1,28 Cà rốt 1,17-2,29 Nho 0,09-0,28 Bưởi 3,30-4,50 Chanh 2,80-2,99 Cam 2,34-2,38 Mơ 0,71-1,32 1.1.4. Phân loại[30] Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhóm chính: - Pectinesterase - Các emzim khử mạch polymer - Protopectinase Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30]
Pectinase Pectinesterase Emzim khử polymer Protopectinase Hydrolase Lyase PMG PG PMGL PGL Exo-PMG Endo-PMG Endo-PGL Endo-PG Exo-PG Exo-PMGL Exo-PGL Endo-PMGL 1.1.5. Cơ chế hoạt động của enzym pectinase  Trung tâm hoạt động của enzym pectinase Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đấn khả năng xúc tác của enzym. [53] 1.1.5.1. Pectinesterase(PE) Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. [30] PE PE PE
Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE) [13] 1.1.5.2. Protopectinase Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao. [30] 1.1.5.3. Các enzym khử mạch polymer Chia làm 2 tiểu nhóm: a. Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)  Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại: - Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin. Endo-PMG COOCH3 COOCH3 Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)[13] -Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin Exo-PMG COOCH3 COOCH3 Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)[13]  Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại: - Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic
Endo-PG COOH COOH COOH Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)[13] - Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. Exo-PG COOH COOH COOH Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG)[13] b. Enzym cắt (Lyase): Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) được đưa ra như sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, để lại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5.[69]
Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin [69] Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:  Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại: - Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid của pectin. - Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.  Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại: - Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid của acid pectic. - Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4- glycosid của acid pectic từ đầu không khử. 1.1.6. Ứng dụng pectinase Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải, lên men trà, cà phê. [30] Bảng 1.2: Một vài ví dụ về pectinase acid và pectinase kiềm của vi sinh vật Vi sinh vật Loại pectinase Aspergillug niger CH4 Endo-pectinase Pectinases acid Exo-pectinase Penicillium frequentans Endo-PG Sclerotium rolfsii Endo-PG Rhizoctonia solani Endo-PG
Rhizoctonia solani Endo-PG Mucor pusilus PG PG Clostridium thermosaccharolyticum Polygalacturonate hydrolase Bacillus sp. RKG PGL Bacillus sp. NT-33 PG Bacillus polymxa PG Pectinases kiềm Bacillus pumilis PATE Amuloca sp. Pectate lyase Bacillus sp. P-4-N PG Penicillium italicum PMGL Bacillus sp. DT7 PMGL PMGL Bacillus subtilis PAL (Nguồn: Kashyap et al., 2001) 1.1.6.1. Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang Pectinase được dùng rộng rãi trong công nghiệp nước ép trái cây và rượu vang. Pectinase được bổ sung nhằm làm tăng hiệu suất li trích nước ép và làm trong nước ép trái cây. Trong công nghiệp nước ép trái cây, người ta thường tạo ra hai loại nước ép là nước ép trong và nước ép đục (hay purée). Phương pháp tạo nước ép trong thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục được dùng để sản xuất nước ép các loại citrus như cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm chuối,..
Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước ép trái cây[30] Trái cây Nghiền Bổ sung pectinase lần một Ép Ly tâm Bổ sung các Bổ sung pectinase enzym khác lần một Ly tâm Lọc Cô đặc Nước ép trái cây  Nước ép trong: Trong quá trình sản xuất nước ép trong, enzym pectinase được bổ sung hai lần (xem sơ đồ 1.2): + Lần một: pectinase có tác dụng làm lỏng lẻo cấu trúc màng tế bào thực vật, giúp làm trong hiệu quả li trích nước ép. + Lần hai: pectinase được bổ sung cùng với một số enzym khác (nếu cần thiết) nhằm làm trong nước ép trái cây.  Nước ép đục hay purée: Quá trình sản xuất nước ép đục chỉ cần bổ sung enzym pectinase một lần đầu tiên (xem sơ đồ 1.2) nhằm làm tăng hiệu quả trích li nước ép. Để ổn định độ đục của nước ép, sau khi ép người ta xử lí nhiệt dịch ép để làm bất hoạt enzym. [30] 1.1.6.2. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào. Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast( tế bào trần) cô lập từ tế bào soma(tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai. Đây có thể là một công cụ
hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên (Gleba, 1978) Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzym pectinase, sau đó tiếp tục xử lí với enzym cellulase để chuyển mô này thành protoplast. Nồng độ của enzym là pectinase 0,5%(W/V) và cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983).[ 30] 1.1.6.3. Xử lí nước thải có chứa pectin Nước thải từ công nghiệp chế biến các loại citrus rất giàu pectin. Lượng citrus này chỉ bị vi sinh vật phân hủy trong quá trình xử lí bùn (Tanabe và cộng sự, 1986). Năm 1987, Tanabe và cộng sự đã thử nghiệm một quy trình xử lí nước thải mới bằng cách sử dụng những vi sinh vật ưa kiềm. Chủng Bacillus sp. (GIR 621) được phân lập từ đất của họ có khả năng sản xuất ra enzym endopectat lyase ngoại bào trong môi trường kiềm pH 10,0. Người ta chứng minh rằng chủng vi khuẩn này có khả năng loại bỏ hữu hiệu pectin ra khỏi nước thải. Erwinia carotovora cũng có khả năng tiết endopectat lyase, cũng có tác dụng xử lí nước thải giàu pectin( Tanabe, 1986), tuy nhiên do chúng có khả năng gây bệnh thực vật nên người ta chỉ xử lí gián tiếp bằng enzym phân giải pectin được sản xuất ra từ vi khuẩn này. 1.1.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy Việc làm giấy là một quá trình lọc liên tục các huyền phù và những phần mịn của sợi, các chất độn vô cơ như đất sét, CaCO3 để tạo thành các phiến giấy. Vì vậy quá trình lọc sẽ ngày càng bị hạn chế do việc thoát nước qua các phiến lọc sẽ ngày càng giảm. Để giải quyết vấn đề này, người ta dùng các khung lọc có kích thước đủ lớn, tuy nhiên những lỗ này cũng làm cho những phần mịn và những chất độn đi qua. Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và làm tăng tốc độ thoát nước. Ngày nay, công nghiệp giấy và bột giặt đã bắt đầu đùng enzym pectinase để giải quyết những vấn đề trên trong quá trình sản xuất. [30] Do enzym pectinase kiềm của Bacillus sp. và Erwinia carotovora có tác dụng làm mềm hóa mạnh nên nó được dùng để giầm sợi libe của cây Misumata( Tanabe và Kobayashi, 1987). Những sợi libe đã được giầm này được dùng để sản xuất giấy Nhật như giấy Washi, giấy Wagami, ..( Horikoshi, 1990). Hiệu quả khi giầm bột giấy với vi khuẩn cao tương tự như phương pháp nấu với tro-soda thông thường. [43] 1.1.6.5. Ứng dụng trong quá trình trích li dầu thực vật Trước đây, dầu từ hạt cây cải dầu (Canola), phôi dừa , hạt hoa hướng dương, hạt cọ, quả ôliu được sản xuất theo kiểu truyền thống bằng cách li trích dung môi hữu cơ. Dung môi thường được sử dụng là hexan, một chất có khả năng gây ra ung thư. Ngày nay người ta sử dụng các enzym phân hủy vách tế bào
thực vật, trong đó hệ enzym pectinase , để li trích dầu thực vật theo phương pháp li trích với nước. Các enzym này có tác dụng làm hóa lỏng các thành phần cấu trúc vách tế bào của cây có chứa dầu. Gần đây enzym phân hủy vách tế bào đã được dùng trong quá trình li trích dầu ôliu. Các enzym này được thêm vào trong quá trình nghiền hạt ôliu, do đó dầu được phóng thích ra dễ dàng trong quá trình tiếp theo(West, 1996). Ví vậy, việc xử lí enzym làm tăng sản lượng của dầu ôliu. Sự tăng sản lượng này phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, và liều lượng enzym được dùng. [30] 1.1.6.6. Ứng dụng trong lên men trà và cà phê Pectinase đóng vai trò quan trọng trong lên men trà, cà phê. Trong quá trình lên men cà phê, người ta dùng các vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê( ba phần tư lớp vỏ nhầy này là pectin). Enzym thương mại được phun vào hạt với liều lượng 2-10 g/tấn ở 15-20 0C. Khi được xử lí với enzym pectinase, giai đọan lên men của quá trình chế biến cà phê được thúc đẩy và giảm từ 40-80 giờ còn khoảng 20 giờ. Do việc xử lí cá phê với enzym thương mại thì đắt và không kinh tế nên người ta dùng lớp vỏ nhầy của cà phê thải ra để nuôi vi khuẩn sinh enzym pectinase. Canh trường sau khi lên men được lọc và sau đó phun vào hạt ( Amorim, 1997; Carr,1985; Godfray, 1985). Pectinase nấm mốc được dùng trong chế biến trà. Việc xử lí enzym thúc đẩy quá trình lên men mặc dù liều lượng của enzym phải được đều chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến lá trà. Việc thêm enzym pectinase cũng cải thiện tính tạo bọt của bột trà bằng cách phân hủy pectin trà (Carr, 1985). [30] 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS 1.2.1. Vị trí phân loại [51] Cohn (1872) phân loại Bacillus như sau: Bacillus thuộc Giới : Bacteria Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales Họ : Bacillaceae Giống : Bacillus
Hình 1.8: Đặc điểm hình thái của Bacillus[51] 1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là nhóm vi khuẩn gram dương, có hình que( trực khuẩn). Chúng có khả năng hình thành nội bào tử có hình oval hoặc hình cầu. [51] Bảng 1.3: Đặc điểm các nhóm vi khuẩn Bacillus theo khoá phân loại của Priest [47] %G+ Đặc điểm Nhóm Đặc điểm sinh lí, sinh hoá Đại diện C bào tử Phình, hình Kỵ khí không nghiêm ngặt, I 38-54 B. polymyxa oval không lên men đường sinh axit Không Hiếu khí hoặc hiếu khí không II 33-45 phình, hình nghiêm ngặt, không lên men B. subtilis oval đường sinh axit Phình, hình Hiếu khí nghiêm ngặt, không III 39-55 oval B. brevis lên men đường sinh axit Phình, hình Hiếu khí nghiêm ngặt, một số IV 36-42 cầu B. sphaericus lên men đường sinh axit V Phình hoặc Nhiệt độ thích hợp để phát 39-69 Themophiles không, oval triển: 500C VI 52-60 Chịu nhiệt, chịu axit AlicycloBacillua 1.2.3. Đặc điểm sinh thái của Bacillus  Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus Phần lớn vi khuẩn Bacillus cư trú trong đất. Một số sống hoại sinh, chúng tiết ra những enzym thuỷ phân cellulose, tinh bột, glucan, pectin và protein. Đại đa số vi khuẩn này thuộc nhóm B. subtilis ( B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. subtilis) và nhóm B. sphaericus. Số lượng vi khuẩn Bacillus quyết định độ phì của đất. Thông thường, đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu cfu/1g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang, vi khuẩn Bacillus rất hiếm. Ngoài những vi khuẩn
kể trên, trong đất giàu dinh dưỡng còn có các loài: B. alvei. B. macerans, B. polymyxa. Sự có mặt của vi khuẩn sinh bào tử gắn liền với tính chất đặc trưng của chúng. Ví dụ: trong đất kiềm, có nhiều vi khuẩn ưa kiềm, vi khuẩn ưa nhiệt chiếm ưu thế ở những vùng đất có nhiệt độ cao.[49] Nước và bùn cửa sông có mặt bào tử và tế bào Bacillus, phần lớn là Bacillus nhóm II, đặc biệt B. firmus, và B. lentus thường được phân lập từ nước chứa nhiều natri clorua. Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn loại này thường rất ít, nhất là những nơi có nồng độ muối khá cao. Bacillus có mặt ở đại dương tiêu biểu B. firmus, B. licheniformis, B. subtilis và B. marinus.  Bacillus ưu nhiệt, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa axit Một trong những đặc điểm hấp dẫn và lôi cuốn sự chú ý đến vi khuẩn Bacillus trong lĩnh vực công nghệ sinh học là khả năng chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu axit, chịu kiềm của chúng. Ngay từ đầu thế kỉ, nhiều Bacillus ưu nhiệt đã được mô tả và phân loại. Theo Gordon[42], Bacillus ưu nhiệt có tên B. coagulans, B. stearothermophilus, B. brevis, B. kaustophilus, B. thermodenitrificans. Từ lâu, enzym Bacillus đặc biệt là -amylase của Bacillus ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp dệt [3]. Enzym của Bacillus ưu nhiệt thường chịu được nhiêt độ cao hơn enzym của Bacillus ưu nhiệt trung bình (trừ -amylase chịu nhiệt của B. licheniformis). Nhiều enzym chịu nhiệt đã được đưa ra thị trường như: protease trung tính, lipaza, pullulanaza. Người ta cũng tách được dòng gen tổng hợp - amylase của B. stearothermophilus và biểu hiện tính trạng di truyền trong vi khuẩn ưu nhiệt trung bình giúp giải quyết nhiều vấn đề trong lên men công nghiệp. Bởi thế Bacillus ưu nhiệt là đối tượng nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực: sản phẩm công nghệ, tách dòng gen, nguồn gen có lợi. Đối lập với Bacillus ưu nhiệt, Bacillus ưa lạnh ít được quan tâm hơn. Nhiệt độ để phát triển thích hợp của Bacillus ưa lạnh là: 0-150C, cao nhất: 200C. Bacillus có khả năng phát triển trong môi trường có pH cao (8-9) được gọi là Bacillus ưa kiềm. Đối với Bacillus ưa kiềm bắt buộc, pH thích hợp: 10 hoặc cao hơn. Chúng không phát triển trong môi trường có pH trung tính. Ứng dụng chính của nhóm Bacillus ưa kiềm trong lĩnh vực công nghệ sinh học là sản xuất enzym công nghiệp. Protease của B. licheniformis có những tính chất như: chịu nhiệt, chịu pH và chịu tác nhân oxy hoá được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy. 1.2.4. Đặc điểm sinh lí của Bacillus Phần lớn Bacillus là những vi khuẩn dị đưỡng hoá năng, thu năng lượng do oxy hoá các hợp chất hữu cơ. Một số vi khuẩn ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc:
(B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2 và CO là nguồn cacbon duy nhất. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác (B. sphaericus, B. cereus) cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B. popilliae, B. lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: NA, NB. [19] 1.2.4.1. Quan hệ với oxy Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao đổi năng lượng thông qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếm khí. Phần lớn Bacillus nhóm I kỵ khí không bắt buộc, lên men hầu hết các loại đường. Bacillus nhóm II phần lớn hiếu khí, chỉ một vài loài lên men. B. licheniformis lên men glucoza, sản phẩm chính của quá trình lên men glucoza là : butanediol, glycerol, ethanol, format, acetat, succinate, pyruvat và CO2. B. cereus và B. thurigiensis cũng có khả năng lên men glucoza, tạo ra butanediol và acid. Riêng B. subtilis rất bí ẩn, chúng là những vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy, sinh axetoin và 2,3-butaediol từ pyruvat bằng con đường axetolactat. Chúng cũng có thể tái sinh NAD- từ phản ứng axetoin thành butanediol. Đến nay vẫn chưa giải thích lý do tại sao chúng không phát triển mạnh trong điều kiện kỵ khí như B. cereus hoặc B. licheniformis. Bacillus nhóm III và VI nhìn chung hiếu khí bắt buộc, không phát triển khi thiếu oxy, nhưng một vài loài khử nitrat bằng phản ứng nitrat kỵ khí. 1.2.4.2. Chuyển hoá cacbon Nhiều loài Bacillus tiết enzym ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hoá các hợp chất cao phân tử trong môi trường (những chất không thể chuyển vào tế bào vì quá lớn) thành các chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn cabon và năng lượng. Một số enzym ngoại bào phổ biến của Bacillus được tóm tắt ở bảng 1.3. Amylase và protease có lẽ là hai nhóm enzym quan trọng nhất của chủng Bacillus.