Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng IgY nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:69

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên nang F1 ở gà, tinh sạch kháng thể đa dòng IgY, nghiên cứu thăm dò khả năng sản sản xuất kháng thể đơn dòng IgG có ái lực cao với kháng nguyên F1, ứng dụng các chế phẩm kháng thể trong sản xuất que thử miễn dịch phát hiện nhanh kháng nguyên F1. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng IgY nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT MAI THỊ THU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA DÒNG IgY NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA PESTIS VÀ ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 11/2017
2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu là do tôi tự thực hiện. Tất cả các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chưa được bất kỳ tác giả nào công bố trước đây. Nếu lời cam đoan không đúng sự thật tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Mai Thị Thu
3 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các cấp Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học, Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017 Học viên Mai Thị Thu
4 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ ......................................................................7 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT......................................................................9 LỜI MỞ ĐẦU .........................................................................................................10 CHƯƠNGI: TỔNG QUAN ...................................................................................12 I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch ...........................................12 I.1. Bệnh dịch hạch...................................................................................................12 I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam .................................................13 I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới ....................................................................13 I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam...................................................................14 I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch ............................................................................16 I.3.1. Dịch hạch thể hạch .......................................................................................... 16 I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết ....................................................................18 I.3.3. Dịch hạch thể phổi .......................................................................................... 19 I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis .........................................20 I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch ...................................................................20 I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis .......................................................... 22 I.5. Kháng nguyên nang F1 ......................................................................................24 I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên nang F1 ....................................................................24 I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1 ............................................................. 25 I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis......................................................................................................................25 I.6.1. Phương pháp miễn dịch .................................................................................25 I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................................30 I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng........................................................... 31 I.7.1. Định nghĩa IgY ............................................................................................... 31 I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà ..................................................................31 I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY ............................................................................32
5 I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c ........................... 33 I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng ..............................................33 I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng .......................................................34 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................37 II.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................... 37 II.1.1. Động vật thí nghiệm ......................................................................................37 II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao ............................................................................37 II.1.3. Thiết bị...........................................................................................................37 II.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................38 II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 ...................................................38 II.2.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng. ..42 II.2.3. Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1.......45 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................47 III.1. Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà ................................................47 III.1.1. Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein) làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA. ....................................................................47 III.1.2. Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 ..................49 III.2. Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng. .....................................................................................53 III.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng. ........................... 53 III.2.2. Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 .....................55 II.3. Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1. ..................................................................................................................57 III.3.1. Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm. .............................. 57 III.3.2. Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY. .......................................................................................... 58 III.3.3. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng. ......................60 III.3.4. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm. ...............61 III. 4. Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử. .......................64 III.4.1. Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. .....64
6 III.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. ...............65 III.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. .....................................................................................................................65 III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20. ...................66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................68
7 DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001 Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002 Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001 Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch Hình 1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson Hình 1.7: Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II) Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng Hình 2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1 Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1 Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1 Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời điểm 30, 35 ngày sau gây miễn dịch lần 1 Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn dịch ở các độ pha loãng khác nhau Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái lực F1 Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm Hình 3.10: Ảnh hưởng của màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng
8 Hình 3.12:Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng Hình 3.13:Ảnh hưởng của nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm Hình 3.15: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng chế phẩm IgY Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm Hình 3.19: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng kháng thể G20 làm kháng thể bắt cặp Bảng 3.1: Nồng độ protein trong các phân đoạn rửa giải khi tinh sạch trên cột sắc ký ái lực NI-NTA Bảng 3.2: Giá trị OD 450 nm của mẫu huyết thanh chuột trước và sau khi gây miễn dịch. Bảng 3.3: Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho
9 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IgY Yolk Immunoglobulin ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay BSA Bovine Serum Albumin SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis HTSKMD Hệ thống sắc ký miễn dịch kDa Kilo Dalton KLPT Khối lượng phân tử MBP Maltose binding protein LB Luria – Bertani ICA Immunochromatographic assay NC Nitrocellulose TL Test line CL Control line ICT immunochromatographic test
10 LỜI MỞ ĐẦU Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra. Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét. Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong. Tuy đã được phát hiện từ lâu nhưng hiện nay các ổ dịch vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực trên trái đất. Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ học vẫn phải được tiến hành thường xuyên. Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc sống của con người. Đặc biệt vi khuẩn Yesinia pestis vẫn được coi là một trong những tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học. Trong bối cảnh phức tạp như hiện nay, trên thế giới, khủng bố bằng vũ khí sinh học đang được các thế lực thù địch tìm cách lợi dụng và phát triển. Trong đó, vi khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) và vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Y. pestis) là những đối tượng nguy hiểm nhất. So với các loại vũ khí thông thường, thì vũ khí sinh học rất khó phát hiện, nhưng lại gây chết người hàng loạt trên diện rộng; gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng. Các phương pháp phân tích kháng nguyên F1 đặc hiệu cho Y. Pestis đều là các phương pháp miễn dịch trong đó phổ biến nhất là ELISA và sắc ký miễn dịch kẹp đôi (Splettstoesser và đồng tác giả, 2004). Que thử phát hiện nhanh kháng nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi có quy trình phân tích rất đơn giản, không cần trang thiết bị do vậy rất thích hợp với các phép phân tích tại hiện trường; đáp ứng nhu cầu củacác phân đội lính trinh sát làm nhiệm vụ tại các vùng rừng núi hẻo lánh. Nhiệm vụ của Phòng Sinh học/Viện Hóa học – Môi trường quân sự là nghiên cứu, chế tạo các trạng thiết bị để thực hiện nhiệm vụ trinh sát, phát hiện nhanh các tác nhân sinh học. Do vậy việc nghiên cứu sản xuất các test phát hiện nhanh kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis trong môi trường bằng phương
11 pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi sử dụng kháng thể đa dòng IgY từ trứng gà là nhiệm vụ trọng tâm và rất cần thiết. Vì những lý do và nhu cầu từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis và ứng dụng sản xuất que thử phát hiện nhanh.”. Nội dung nghiên cứu chính của luận văn: - Tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên nang F1 ở gà. - Tinh sạch kháng thể đa dòng IgY. - Nghiên cứu thăm dò khả năng sản sản xuất kháng thể đơn dòng IgG có ái lực cao với kháng nguyên F1. - Ứng dụng các chế phẩm kháng thể trong sản xuất que thử miễn dịch phát hiện nhanh kháng nguyên F1.
12 CHƯƠNGI: TỔNG QUAN I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch I.1. Bệnh dịch hạch Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm dịch và khai báo quốc tế do Yersinia pestis (Y.pestis) gây nên. Bệnh lưu hành trong quần thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người. Lịch sử loài người đã ghi nhận 3 vụ đại dịch vào các thế kỷ thứ VI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong và bệnh dịch hạch đã trở thành nỗi kinh hoàng của nhân loại. Bệnh dịch hạch được biết đến từ thời xa xưa, thời kì đầu khó có thể xác định được những thông tin chính xác cần thiết để phân biệt hoặc chứng minh dịch hạch do vi khuẩn hay vi rút. Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp đến các quốc gia trên thế giới. Đại dịch đầu tiên được ghi nhận vào thế kỷ thứ VI, vào khoảng từ năm 542 đến 546 xảy ra vụ dịch lớn bắt đầu ở Đế quốc La Mã phương Đông vào triều đại Vua Justinian 1 ở Ai Cập, lây lan sang Châu Âu, ước tính làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu. Đại dịch lần thứ hai nổi tiếng với tên “Bệnh chết đen - Black Death” vào thế kỷ XIV, khoảng từ năm 1347 đến 1350. Đại dịch lần thứ 2 ước tính làm chết khoảng 50 triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, chiếm một phần ba dân số Châu Âu thời bấy giờ. Tỷ lệ tử vong trong đại dịch này từ 70 - 80%. Cuối thế kỷ XIX, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm 1894, nhanh chóng lan truyền đi khắp thế giới. Trong vòng 10 năm (1894-1903), dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu: Châu Á: 31, Châu Âu: 12, Châu Phi: 8, Bắc Mỹ: 4, Nam Mỹ: 15 và Châu Úc: 7. Trong đại dịch này, dịch hạch lây lan mạnh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng 13.000.000 người [1].
13 I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ thuộc vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như: khí hậu, động đất, sự di chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân,... Hiện nay, các ổ dịch hạch tự nhiên tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ Bắc đến 40 vĩ độ Nam. Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ dịch hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm. Từ 1954 - 2001, Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong. Nhiều nhất là năm 1967 có 6014 trường hợp và thấp nhất năm 1981 có 200 trường hợp. Trong gần nửa thế kỷ qua, có 7 quốc gia trên thế giới có dịch bệnh xảy ra hàng năm là Brazil, Cộng hoà dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanmar, Pê Ru, Hoa Kỳ và Việt Nam. Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001[1] Thực tế tình hình dịch hạch trên thế giới cho đến nay vẫn diễn biến phức tạp, không thể nói rằng sẽ loại trừ dịch hạch trong tương lai gần. Cũng không thể buông
14 lỏng sự giám sát dịch hạch. Năm 1995 ở Madagascar bắt đầu nghiên cứu phòng chống dịch hạch toàn diện và tổ chức mạng lưới nghiên cứu vấn đề này trong các Viện Pasteur (Acip Peste). Tại Trung Quốc mặc dù tình hình dịch hạch đã được khống chế mạnh mẽ nhưng hệ thống giám sát phòng chống chủ động bệnh dịch này vẫn được đẩy mạnh và giải quyết chặt chẽ. Những năm gần đây Hội nghị quốc tế về nghiên cứu và phòng chống dịch hạch vẫn được tổ chức Y tế Thế giới tổ chức, thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này tham dự. Tại hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch tổ chức ở Bangalore, Ấn Độ từ 15 - 17 tháng 07 năm 2002, theo Tikhomirov E, chuyên gia của Tổ chức Y tế Thế giới thì có 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và phòng chống của một bệnh là: Tác động của bệnh đó (nguyên nhân gây mắc và chết), nguy cơ tác nhân gây nên dịch, hiệu lực trong dự phòng và điều trị bệnh, tầm quan trọng đối với quốc tế, ảnh hưởng đến kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích. Dịch hạch có đầy đủ 6 yếu tố trên và như vậy nên được xem là bệnh cần ưu tiên nghiên cứu và phòng chống [1]. I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam Hơn 1 thế kỷ trước, bệnh dịch hạch đã có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ Hồng Kông xâm nhập vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba. Mầm bệnh vẫn được duy trì, lưu hành có thời kỳ bùng phát xen kẽ với những thời kỳ lắng dịu nhưng thực sự chưa bao giờ được loại trừ. Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3. Dịch xâm nhập chủ yếu theo hàng hóa của người Trung Hoa. Sau khi xâm nhập dịch lây lan đến những nơi khác như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, Sóc Trăng.... Dịch tại những nơi xâm nhập đều có tính chất tạm thời trừ Sài Gòn và Phan Thiết có chiều hướng trở thành vùng dịch lưu hành dai dẳng. Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên, Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có 886 người tử vong.
15 Hình1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002 Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở Miền Nam. Sau đó tiếp tục lây lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam Bộ. Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch vẫn tồn tại với quy mô lớn. Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải dịch trên thế giới đều là Việt Nam. Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001
16 Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số ca mắc - chết tăng vọt tại các vùng dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam Bộ. Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một số vụ dịch nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng hóa và các phương tiện giao thông. Đặc biệt chuột và tác nhân gây bệnh Y. pestis theo gạo và lương thực từ Miền Nam xâm nhập vào Miền Bắc qua cảng biển Hải Phòng. Trong giai đoạn từ năm 1991 đến 2002 số mắc - chết có chiều hướng giảm và phạm vi dịch thu hẹp dần, tập trung chủ yếu ở Miền Trung và Tây Nguyên. Trong 4 năm (1999-2002), dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương 2 tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai với diện dịch tập trung dai dẳng vào một số xã thuộc 2 huyện: Đắc Đoa, tỉnh Gia Lai và EaH’leo, tỉnh Đắk Lắk. Từ tháng 3/2003 đến nay không ghi nhận bệnh dịch hạch trên người, ca mắc gần nhất ghi nhận vào tháng 08 năm 2002 tại tỉnh Đắk Lắk. Giám sát dịch động vật tại các trọng điểm, từ tháng 4/2004 không còn phân lập được Y. pestis từ vật chủ và trung gian truyền bệnh. Từ năm 2005 xét nghiệm huyết thanh động vật tìm kháng thể kháng F1 của vi khuẩn Y. pestis đều cho kết quả âm tính. I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch Tùy theo vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có thể gặp nhiều thể lâm sàng với tỷ lệ khác nhau nhưng phổ biến nhất là thể hạch. Thể nhiễm khuẩn huyết và thể phổi tiên phát hiếm gặp hơn. Các trường hợp nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thứ phát có thể xem là biến chứng của thể hạch không được điều trị sớm và tích cực. Ngoài ra còn gặp các biểu hiện khác như viêm màng não mủ, việm họng, thể xuất huyết, thể da … Tuy nhiên các biểu hiện này thường gặp trong bệnh cảnh hoặc xảy ra thứ phát sau thể hạch. I.3.1. Dịch hạch thể hạch Thể lâm sàng của bệnh dịch hạch không hằng định và nhiều thể. Tuỳ vào từng vùng và vụ dịch mà tỷ lệ gặp có khác nhau, nhưng nhìn chung thể hạch vẫn phổ biến nhất.
17 Thống kê của một số bệnh viện ở Việt Nam như sau: Bệnh viện Chợ Quán từ năm 1977 đến 1986 gặp 94 - 98%; Bệnh viện Đắc Lắc từ năm 1976 đến 1986 gặp 97% và Bệnh viện Phú Khánh từ 1982 đến 1986 gặp 98% . Ở New Mexico từ năm 1980 - 1984 gặp 74,7% là thể hạch. Theo qui định của Tổ chức Y tế Thế giới, thời gian ủ bệnh trong vòng 6 ngày, thời kỳ này kéo dài hơn ở những người đã được chủng ngừa vắc xin. Thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch. * Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc. Sốt cao đột ngột là triệu chứng tương đối phổ biến và thường xuất hiện trước khi viêm hạch. Nếu được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu thì nhiệt độ hạ, trong vòng 18 - 24 giờ có thể giảm đến 1,5 đến 2oC, ngày sau có thể hết sốt hoặc sốt nhẹ thêm 2 - 3 ngày rồi hết hẳn. Các dấu hiệu nhiễm trùng, nhiễm độc thần kinh biểu hiện mức độ nặng nhẹ của bệnh và là yếu tố quyết định tiên lượng bệnh. Cần đặc biệt quan tâm khi thấy xuất hiện sớm trong vòng 24 giờ đầu. Ở thể nhẹ, bệnh nhân mệt mỏi, biếng ăn nhưng vẫn tươi tỉnh. Bệnh càng nặng, biểu hiện nhiễm độc càng rõ. Mặt đỏ, kết mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, đau nhức nhiều nơi. Người bứt rứt khó chịu, vẻ mặt lo âu sợ hãi, hoặc hốt hoảng, vật vã, kích động, nói nhảm hoặc lừ đừ, mắt đờ đẫn, nằm yên không cử động, không ngủ. Đôi khi gặp ảo giác, trả lời chậm chạp, khi đúng khi sai, tiếng nói không rõ ràng. Hiếm gặp hơn là động tác bất thường, thỉnh thoảng gồng người co giật, vã nhiều mồ hôi. Có trường hợp ói mửa, ỉa chảy. Khó thở nhanh mà không có tổn thương bệnh lý ở phổi. * Viêm hạch. Viêm hạch thường xuất hiện đồng thời hoặc sau sốt vài giờ đến 24 giờ, một số ít trường hợp nổi hạch trước sốt. Viêm hạch dịch hạch là một loại viêm cấp tính với triệu chứng đau là tính chất nổi bật lên hàng đầu. Đau là triệu chứng sớm nhất và thường xuất hiện trước khi nổi hạch (87%). Đau tăng lên khi bệnh nhân cử động hay sờ nắn và bệnh nhân thường ở tư thế nhằm làm giảm sức căng lên vùng đó. Thuốc giảm đau không hoặc có tác dụng rất ít. Đau tự nhiên, càng nhiều và càng
18 sớm, đi đôi với sốt cao thường tiên lượng nặng hơn. Đau giảm rõ rệt và nhanh chóng trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu. Thường có một vài hạch và vị trí có hạch liên quan đến vị trí đốt của bọ chét, phổ biến nhất là vùng đùi bẹn: 62 - 80%. Kế đó là: hạch nách 14 - 20%, hạch cổ, hạch dưới hàm: 15-18%. Có thể gặp hai hoặc nhiều hạch xuất hiện lần lượt hoặc cùng một lúc. Biểu hiện này cũng như vị trí hạch vùng cao (cổ, nách, thượng đòn … ) thường là một biểu hiện nặng cần được chú ý. Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch Hạch viêm tiến triển nhanh với sưng tấy, nóng, đỏ và rất đau. Kích thước hạch tuỳ vào thời điểm phát hiện. Ban đầu nhỏ, di động, màu da ngoài bình thường, trong vòng 1 hoặc 2 ngày đã sưng to có khi đến 10 cm nhưng thường dưới 3 cm. Tổ chức xung quanh hạch bị viêm, phù nề và dính vào nhau thành 1 khối không di động, màu da bên ngoài hạch đỏ tía. Trong trường hợp được điều trị sớm, đúng thì hạch giảm đau nhanh, teo nhỏ lại và “mất đi” trong vòng 2 - 3 tuần hoặc trở nên xơ hoá để lại một khối rắn trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh [1,2]. I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết Quan niệm về thể nhiễm khuẩn huyết có nhiều ý kiến khác nhau. Theo Pollitzer, dịch hạch thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát là do sự xâm nhập vào máu của một số lượng lớn vi khuẩn dịch hạch không qua giai đọan khu trú ở hạch. Một số tác giả khác (Girard, Dujardin, Beaumetz, Joltrain) cho rằng thể nhiễm khuẩn
19 huyết chỉ thứ phát sau thể hạch nằm trong sâu, thăm khám bên ngoài không sờ thấy được. Các tổ chức hạch này vẫn chứa nhiều vi khuẩn[1]. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết tiên phát là những trường hợp nhiễm khuẩn huyết được xét nghiệm kết luận là do Y. pestis mà lâm sàng không phát hiện được triệu chứng viêm hạch. Thể bệnh này không có triệu chứng viêm hạch đặc hiệu nên rất dễ bị bỏ sót và tử vong cao. Bệnh nhân đột ngột sốt cao 40 - 410C, rét run, đau đầu dữ dội, tiêu chảy và ói mửa nhiều lần. Hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, tím tái, thở nhanh nông …sau đó đi vào sốc nhiễm trùng nhiễm độc. Soi tươi các bệnh phẩm sẽ thấy vi khuẩn dạng dịch hạch. Thường bệnh nhân tử vong nhanh chóng trong vòng 1 vài ngày nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực ngay từ những giờ đầu của bệnh [2]. I.3.3. Dịch hạch thể phổi Bệnh dịch hạch đáng sợ nhất là thể phổi vì tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong rất cao. Thể tiền phát là do tác động trực tiếp của vi khuẩn trên tổ chức phổi theo đường hô hấp trên, bệnh xuất hiện dưới dạng viêm đặc thùy phổi và diễn biến rất cấp tính. Thời gian nung bệnh của thể phổi thường ngắn hơn, chỉ trong một vài ngày, thậm chí chỉ trong vòng vài giờ sau khi nhiễm bệnh. Sau đó bệnh khởi phát rất đột ngột với sốt cao, rét run, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mạch nhanh, huyết áp thấp, bệnh nhân bứt rứt. Trong vòng 24 giờ sau, các dấu hiệu của tổn thương hô hấp xuất hiện nhanh chóng, có rối loạn chức năng hô hấp như đau tức ngực, thở nhanh nông, khó thở. Lúc đầu ho có đờm nhầy, loãng. Sau đó đờm đặc dần, có vết máu, có khi có bọt. Triệu chứng thực thể ở phổi rất nghèo nàn: Gõ bình thường hoặc đục một vài nơi, âm phế bào và rung thanh không thay đổi. Đôi khi tìm thấy dấu hiệu 3 giảm hoặc tiếng cọ màng phổi. X quang phổi biểu hiện rất sớm, có thể thấy hình ảnh đông đặc phổi thông thường hoặc nhiều bóng mờ rải rác hoặc hình ảnh bong bóng giống viêm phổi tụ cầu[1,2]. Ngoài ba thể hay gặp trên còn có các thể khác ít phổ biến hơn như: thể màng não, thể xuất huyết, thể hầu học…
20 I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm, lây truyền trong quần thể gặm nhấm. Bệnh duy trì trong các ổ dịch thiên nhiên của các loài gặm nhấm và lây truyền qua trung gian bọ chét sống ngoại ký sinh trên chúng. Phần lớn các loài động vật hoang dại đều bị nhiễm vi khuẩn dịch hạch nhưng chúng có tính đề kháng tương đối với bệnh nên không đóng vai trò quan trọng trong vật chủ bệnh dịch hạch. Trên thế giới bộ gặm nhấm (Rodentia) có khoảng 6.000 loài, trong đó họ chuột (Muridae) có 150 loài chuột. Ở Việt Nam có 56 loài gặm nhấm và họ chuột có 43 loài phân bố trên toàn lãnh thổ. Dịch hạch là bệnh của động vật, chủ yếu là các loài gặm nhấm hoang dại và chuột, người chỉ là vật chủ ngẫu nhiên, thứ yếu. Có nhiều yếu tố trong cơ chế lan truyền bệnh dịch hạch, trong đó bọ chét đóng vai trò quan trọng. Bọ chét phải nhiễm vi khuẩn dịch hạch khi hút máu. Tiếp theo là thời gian sống phải đủ dài để quá trình nhân lên vi khuẩn đủ số lượng nhiều và sau đó lây truyền vi khuẩn dịch hạch sang vật chủ khác. Bên cạnh đó, số lượng và thành phần bọ chét cũng như quần thể vật chủ cũng là yếu tố cần thiết để gây nên nhiễm trùng và lan truyền dịch bệnh. Trong tự nhiên, bệnh dịch hạch lan truyền theo các con đường sau: * Phổ biến nhất là lây truyền qua trung gian bọ chét: Theo cơ chế lây truyền này thì bệnh dịch hạch ở người thường xuất hiện sau dịch hạch ở vật chủ vài ngày đến một vài tuần. Bọ chét hút máu vật chủ mắc bệnh trong đó có vi khuẩn dịch hạch, vi khuẩn nhân lên sẽ tạo thành nút nghẽn ở tiền dạ dày (proventriculus). Khi vật chủ bị bệnh chết, bọ chét bị tắc nghẽn này mất nguồn thức ăn sẽ rời bỏ vật chủ chết đi tìm ký chủ mới để hút máu nhưng vì ống tiêu hoá bị tắc nghẽn ở tiền dạ dày, máu không vào được và mỗi lần hút máu lại bị đẩy ra, vi khuẩn dịch hạch theo vết đốt vào cơ thể vật chủ này và như vậy xảy ra sự lây truyền bệnh. * Lan truyền trực tiếp từ vật chủ bệnh sang vật chủ lành không qua trung gian của bọ chét như: