Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:96

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu sàng lọc một số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính sinh protease từ một số phòng thí nghiệm trong nước; đánh giá hiệu quả của xử lí chiếu xạ tới chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và khả năng sinh tổng hợp protease của chúng

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ............... ***............... Hoàng Đăng Sáng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỘT BIẾN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA KẾT HỢP VỚI XỬ LÝ KHÁNG SINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐỖ THỊ HUYỀN ThS. TRẦN BĂNG DIỆP LỜI CẢM ƠN Hà Nội - 2018
Để hoàn thành nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, ngƣời thầy đã chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu - ThS. Trần Băng Diệp và ngƣời thầy cho tôi những ý kiến quí báu - TS. Đỗ Thị Huyền, các cô đã giúp tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn. Ngoài ra tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giảng dạy đã cho tôi nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu. Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam và anh chị em đồng nghiệp tại phòng Nghiên cứu Công nghệ bức xạ đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm việc, học tập và hoàn thiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu. Đề tài “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” đã nhận đƣợc sự hỗ trợ rất lớn từ đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ cấp Bộ, mã số ĐTCB/01/15/TTCX, do Ths. Trần Băng Diệp làm chủ nhiệm./. Hà Nội, tháng 11 năm 2018 Hoàng Đăng Sáng
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi. Các số liệu và tài liệu đƣợc trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã đƣợc công bố trƣớc đó. Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Hà Nội,tháng 11 năm 2018 Học viên Hoàng Đăng Sáng
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP : Adenosine triphosphate Khuẩn lạc KKS- 0,2 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml Khuẩn lạc KKS- 2 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung rifampicin nồng độ 2 µg/ml Khuẩn lạc KKS- 20 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung streptomycin nồng độ 20 µg/ml Khuẩn lạc KKS- 200 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung streptomycin nồng độ 200 µg/ml DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylendiamin tetraacetic acid GLP – 1 : Glucagon – like peptide – 1 KS : Kháng sinh MMP : Matrix metallo protease MT : Môi trƣờng PCR : Polymerase chain reaction ppGpp : Guanosine – 5‟diphosphate – 3‟diphosphat RNA : Ribonucleic acid RNAP : RNA polymerase sp. : Species TB : Tế bào tRNA : RNA vận chuyển VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật
MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................................................4 1.1. PROTEASE............................................................................................................................................4 1.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................................ 4 1.1.2. Phân loại protease..................................................................................................... 4 1.1.3. Nguồn thu protease................................................................................................. 6 1.1.4. Ứng dụng của protease .............................................................................................. 8 1.1.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp ............................................................................. 8 1.1.4.2. Trong nghiên cứu và trị liệu............................................................................ 10 1.1.4.3. Trong nông nghiệp ............................................................................................ 11 1.2. BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS ................................................... 12 1.2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis.................................................................................12 1.2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ....................................................................... 12 1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên .................................... 12 1.2.1.3. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 12 1.2.1.4. Đặc điểm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy ................................................. 13 1.2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử ....................................................................... 14 1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease ở Bacillus subtilis ................15 1.2.2.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng....................................... 15 1.2.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease ...... 17 1.2.2.3. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy ............................................................ 18 1.3. PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP (PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME ............................................................................... 18 1.3.1. Công nghệ đáp ứng lại của VSV ............................................................................18 1.3.2. Công nghệ gen .........................................................................................................19
1.3.2.1. Phƣơng pháp gây đột biến ................................................................................ 19 1.3.2.2. Tái tổ hợp di truyền ........................................................................................... 20 1.3.3. Công nghệ trao đổi chất ..........................................................................................20 1.3.4. Công nghệ ribosome ................................................................................................21 1.4. TƢƠNG TÁC CỦA BỨC XẠ ION HÓA VỚI TẾ BÀO – ỨNG DỤNG BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VI SINH VẬT ................................................... 24 1.4.1. Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa ..............................................24 1.4.1.1. Các quá trình xảy ra sau khi bức xạ đi vào tổ chức sinh học ....................... 24 1.4.1.2. Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa ..................................................... 26 1.4.2 Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở vi sinh vật............................27 PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 30 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ................................................................................................. 30 2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................................30 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................................30 2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................................31 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................................. 31 2.2.1. Bảo quản và giữ giống.............................................................................................31 2.2.2. Xử lý chiếu xạ..........................................................................................................32 2.2.2.1. Nuôi cấy huyền dịch tế bào .......................................................................... 32 2.2.2.2. Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy: ....................................................................... 32 2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật......................................................................32 2.2.4. Định tính và định lƣợng protease ...........................................................................33 2.2.4.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch ........................................................... 33 2.2.4.2. Phƣơng pháp Anson cải tiến ............................................................................. 34 2.2.5. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ .. .......................................................................................................................36
2.2.6. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh .......................................................................................................36 2.2.7. Xác định đột biến ....................................................................................................37 2.2.7.1. Thiết kế mồi và xử lý số liệu ...............................................................................37 2.2.7.2. Khuếch đại trình tự gen rpoB và rpsL12 ......................................................... 38 2.2.7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................................. 38 2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA ............................................................................... 38 2.2.7.5. Giải trình tự ........................................................................................................ 39 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................... 40 3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN................................................................................ 40 3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định .......40 3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh protease của các chủng Bacillus subtilis ........................................................................................................................ 42 3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG .................................................... 44 3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis ...............44 3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng Bacillus subtilis ..................................................................................................................45 3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng Bacillus subtilis ..................................................................................................................47 3.3. XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƢỚNG TỚI CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS......................................................................... 49 3.3.1.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng streptomycin ở các chủng Bacillus subtilis ............................................................................................................... 50 3.3.1.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các chủng kháng xạ và kháng streptomycin ........................................................................ 51 3.3.2. Xử lý chiếu xạ kết hợp với rifampicin ..................................................................55
3.3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng rifampicin ở các chủng Bacillus subtilis ............................................................................................................... 55 3.3.2.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các khuẩn lạc kháng xạ và kháng rifampicin ....................................................................... 56 3.4. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC GEN rpoB, rpsL Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO HƠN CHỦNG GỐC ........................................................... 59 3.4.1. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL ở các chủng gốc, các khuẩn lạc sinh protease cao hơn chủng gốc ..............................................................................................59 3.4.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng gốc và khuẩn lạc sinh protease cao ............................................................................................................................................. 59 3.4.2.2. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR ................................................................................................................................................... 61 3.4.2.3.Tinh sạch sản phẩm PCR khuếch đại các gen rpoB và rpsL để giải trình tự xác định đột biến ..................................................................................................... 61 3.4.2.4. Giải trình tự gen rpoB của 2 chủng thuần và các khuẩn lạc sinh protease vƣợt trội..................................................................................................................................... 62 3.4.2.5. Giải trình tự gen rpsL của 2 chủng thuần và các chủng đột biến ................ 66 3.4.2.6. Phân tích so sánh kết quả giữa kiểu đột biến, vị trí đột biến với khả năng sinh protease ............................................................................................................................. 68 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 70 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN..............73 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................................... ..73 PHỤ LỤC .................................................................................................................................................. ..81
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại protease ........................................................4 Hình 1. 2. Vai trò protease trong nghiên cứu ung thƣ ...................................................10 Hình 1.3. Thị phần sử dụng proteinase trong nghiên cứu - trị liệu ...........................11 Hình 1.4. Tế bào VK Bacillus subtilis quan sát dƣới kính hiển vi ..........................13 Hình 1.5. Quá trình Bacillus subtilis sinh nội bào tử quan sát dƣới kính hiển vi ............14 Hình 1.6. Cơ chế tác động ppGpp làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp của ribosome ..........21 Hình 1.7. Công nghệ ribosome. ................................................................................22 Hình 1.8. Cấu trúc tiểu phần β của RNAP ở Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis, Mycobacterium leprae. ...............................................23 Hình 1.9. Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới DNA ...................24 Hình 1.10. Các loại tổn thƣơng do tác động của bức xạ ion hóa trên DNA....................26 Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease ......................................................34 Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease......................................................................................................................40 Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao............41 Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng Bacillus subtilis tuyển chọn ..................41 Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau .................................................42 Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng Bacillus subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau khi thu và sau bảo quản 48 giờ ..................................................................................43 Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng ........44 Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng VK Bacillus subtilis sống sót trong dịch nuôi cấy và liều chiếu xạ ...........................................................................................46
Hình 3.8. Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của 03 chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau ..............................................50 Hình 3.9. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 300 Gy ..............................................................................................................................53 Hình 3.10. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 500 Gy ..............................................................................................................................54 Hinh 3.11. Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml của 03 chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau ..............................................55 Hình 3.12. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và của các khuẩn lạc kháng rifampicin .....................................................................57 Hình 3.13. Vòng phân giải casein của một số khuẩn lạc Bacillus subtilis H12 kháng xạ và kháng rifampicin ..............................................................................................58 Hình 3.14. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ các chủng B.subtilis trên gel agarose 0,8 %. ............................................................................................................60 Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rpoB (A) và gen rpsL (B) từ các chủng B.subtilis trên gel agarose 1,5 %.................................................................61 Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR tinh sạch tƣơng ứng với đoạn gen rpoB và rpsL trên gel agarose 1,5 %. .................................................................................62 Hình 3.17. So sánh trnh tự amino acid của tiểu phần β – RNA polymerase đƣợc mã hóa từ gen rpoB ở 2 chủng thuần Bacillus subtilis B5 và Bacillus subtilis H12. .....63 Hình 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen rpoB ở 2 chủng thuần Bacillus subtilis B5 và Bacillus subtilis H12. .........................................................................63 Hình 3.19. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (B5_rpoB) với chủng đột biến 609 (rpoB-M)....................................................................................................................64 Hình 3.20. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (H12) với chủng đột biến 2, chủng 6 và chủng 1379 ...........................................................................................................65
Hình 3.21. So sánh trình tự nucleotide của gen rpsL ở 2 chủng thuần Bacillus subtilis B5 và Bacillus subtilis H12 ..........................................................................66 Hình 3.22. Trình tự gen rspL của chủng thuần (B5_rpsL) với chủng đột biến 301_rpsL, chủng 321_rspL và chủng 609_rpsL. ......................................................67 Hình 3.23. Trình tự gen rpsL của chủng thuần (H12_rpsL) với chủng đột biến 2_rpsL, chủng 19_rpsL và chủng 1904_rpsL. ..........................................................67 Hình 3.24. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng thuần B5 và chủng đột biến 609-B5............................................................................68 Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng thuần B5 và chủng đột biến 533-B5.................................................................................68 Hình 3.26. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng thuần H12 và chủng đột biến 19-H12 .........................................................................69
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng VSV có khả năng tổng hợp protease cao ..............................7 Bảng 1.2. Phản ứng sinh hóa của VK Bacillus subtilis................................................13 Bảng 2.1. Các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào ...................................................................................................................................30 Bảng 2.2. Tỷ lệ các hóa chất cần pha cho xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin ...............35 Bảng 2.3. Các bƣớc chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính ........................................35 Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi dùng trong nghiên cứu ..........................37 Bảng 2.5. Thành phần và chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự hai gen rpoB và rpsL từ DNA tổng số .................................................................................................38 Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease .....................................................................................................40 Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease ...................................................................................................................................41 Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng Bacillus subtilis tại các liều chiếu xạ khác nhau ....................................................................................................48 Bảng 3.4. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml có khả năng sinh protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 chiếu xạ...........................................52 Bảng 3.5. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 200 µg/ml có khả năng sinh protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 kháng xạ và kháng streptomycin 20 µg/ml .........................................................................................................................53 Bảng 3.6. Số lƣợng khuẩn lạc tiềm năng kháng rifampicin 0,2 µg/ml sinh protease cao đƣợc sàng lọc từ các chủng Bacillus subtilis chiếu xạ .......................................56 Bảng 3.7. Các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội .......59 Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ (OD) ở bƣớc sóng 260 nm trên máy Nano Drop .........................................................60
Bảng 3.9. Danh sách các khuẩn lạc có đột biến ở gen rpoB. Vị trí đột biến đƣợc chỉ ra trên kết quả trình tự ...............................................................................................65 Bảng 3.10. Tổng hợp các đột biến xuất hiện trên gen rpoB các chủng gây đột biến chọn lọc và hoạt tính protease của các chủng này....................................................69
MỞ ĐẦU Protease là nhóm enzyme có chức năng phân giải các liên kết peptide của protein để tạo thành các amino acid đơn lẻ. Với tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực đời sống nên protease đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng nhƣ các công ty hóa dƣợc lớn trên thế giới. Theo thống kê, hiện nay protease chiếm đến 65% sản phẩm enzyme thƣơng mại toàn cầu và doanh thu ƣớc tính có thể đạt 2.767 triệu bảng Anh vào năm 2019. ………….. (http://www.prnewswire.co.uk/news-releases/protease-enzymes-market). Vi sinh vật, đặc biệt là chủng vi khuẩn Bacillus là nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất protease ở quy mô công nghiệp nhờ việc thu nhận sản phẩm dễ dàng, nuôi cấy đơn giản và đặc biệt protease của chủng vi khuẩn này có hoạt tính ổn định ở các điều kiện pH, nhiệt độ cao (Olajuyigbe và Ajele, 2005). Tuy nhiên, các chủng Bacillus tự nhiên thƣờng cho năng suất sinh protease không cao và vì thế việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vƣợt trội là một lựa chọn lý tƣởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease. Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , notron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vật (Awan, 2011). Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh vật có thể tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp nhƣ enzyme, sắc tố, kháng sinh (Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013) cũng nhƣ tăng khả năng chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và cs, 2002). Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa và cs, 2006). Cơ chế phân tử liên quan đƣợc phân tích, đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đƣờng chính là gây đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013; 1
Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome (Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới sử dụng khả năng kháng kháng sinh làm gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã tăng sinh tổng hợp protein. Nhƣ vậy gen đích không hề bị cải biến nhƣng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của gen đƣợc tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh đƣợc tính hiệu quả, có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần. Trong khi, theo báo cáo của một số công ty công nghệ sinh học trên thế giới, đa số các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có năng suất cao hơn chủng tự nhiên không quá vài lần, một số ít trƣờng hợp đạt đƣợc vài chục lần (Ochi và cs, 2013). Ngoài ra, một số sản phẩm dùng để sản xuất thực phẩm hoặc dùng vào mục đích bảo quản thực phẩm chƣa cho phép sử dụng các protein tái tổ hợp. Việc áp dụng công nghệ ribosome sẽ giúp khắc phục những hạn chế này. Rõ ràng, kỹ thuật sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng là tƣơng đối đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen. Tuy nhiên, thời gian sàng lọc đột biến ribosome khá dài, tốn nhiều công sức vì vậy việc sử dụng kết hợp kháng sinh với xử lý chiếu xạ đƣợc xem là một giải pháp nhằm làm tăng áp lực chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn, đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs, 2005; Al-Sudany và cs, 2010). Nhƣ vậy, việc kết hợp giữa gây đột biến gen bằng phóng xạ và sử dụng kháng sinh có thể giúp tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao hơn chủng tự nhiên nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Sàng lọc một số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính sinh protease từ một số phòng thí nghiệm trong nƣớc. Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của xử lí chiếu xạ tới chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và khả năng sinh tổng hợp protease của chúng. + 2.1: Xử lý chiếu xạ các chủng Bacillus subtilis từ nội dung 1. + 2.2: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ với tốc độ sinh trƣởng. 2
+ 2.3: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ và khả năng sinh protease. + 2.4: Xác định liều chiếu xạ thích hợp để có đƣợc tỷ lệ đột biến sinh protease cao. Nội dung 3: Xử lí chiếu xạ kết hợp sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng tới các gen mã cho sản phẩm liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis + 3.1: Sàng lọc các chủng sau chiếu xạ có khả năng chống chịu kháng sinh do bị đột biến trên các gen tham gia tổng hợp ribosome. + 3.2: Sàng lọc các chủng Bacillus subtilis chịu bức xạ và kháng kháng sinh có khả năng sinh protease. + 3.3: Xác định liều chiếu xạ và nồng độ kháng sinh thích hợp để thu đƣợc dòng đột biến có khả năng tăng sinh tổng hợp protease cao. Nội dung 4: Xác định đột biến trên các gen rpoB và rpsL ở các chủng vi sinh có khả năng sinh protease cao hơn chủng gốc. 3
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. PROTEASE 1.1.1. Giới thiệu chung Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân tử protein tạo thành các amio acid đơn lẻ (Hình 1.1) (http://protease.burnham.org). Protease đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó protease tiêu hoá đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách đƣợc trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại exopeptidase (http://protease.burnham.org). 1.1.2. Phân loại protease Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase (López-Otín, 2007). * Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại: - Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các amino acid đơn lẻ, các dipeptide hoặc tripeptide. - Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu carboxyl của chuỗi polypeptide và giải phóng ra amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide. 4
* Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, exopeptidase đƣợc chia thành 5 nhóm (http://protease.burnham.org): - Serine protease là những protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là –OH của serine. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase (López-Otín, 2007). Nhóm subtilisin gồm hai loại enzyme là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN (Carter, 1989). Các serine protease thƣờng hoạt động mạnh ở pH 9 – 11 và có tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng. - Cysteine protease là các protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là cysteine. Nhóm này bao gồm các protease thực vật nhƣ papayin, bromelin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng (López-Otín, 2007). Các cysteine protease thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. - Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin (López-Otín, 2007). Các aspartic protease thƣờng có hai gốc aspactic acid bảo thủ tham gia xúc tác nằm trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH axit. - Threonine protease: Các threonine protease tƣơng tự nhƣ serine protease nhƣng chúng chứa gốc xúc tác là amino acid threonine trong trung tâm hoạt động. Threonine protease chỉ đƣợc biết đến từ sau năm 1995, cơ chế phân cắt các liên kết peptide của chúng dựa trên việc tạo ái lực với protein thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động tạo ra các amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide (López-Otín, 2007). - Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Phân biệt với các enzyme khác, các metallo protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên là zinc metallo protease. Số ít protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay vì kẽm khi tham gia phản ứng xúc tác. Các metallo protease hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA (Fox, 1991). Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2–4; chúng có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi khuẩn (Fox, 1991). 5
Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7–8 nhƣ papain từ đu đủ, bromelain từ dứa, và hầu hết protease có nguồn gốc động vật. Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9–11 nhƣ alkaline protease, serine protease, protease đƣợc sản xuất bởi Bacillus sp. (López-Otín, 2007). 1.1.3. Nguồn thu protease Protease là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng, từ động vật, thực vật, tới vi sinh vật. Ở động vật, protease thƣờng có ở hệ tiêu hóa nhƣ tuyến tụy, niêm mạc dạ dày, niêm mạc ruột non (Shafee và cs, 2005). Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá… đƣợc sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa. Rennin ở ngăn thứ tƣ của dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi có khả năng làm đông tụ sữa, đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat. Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong quả. Papain thu đƣợc từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ; bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa; ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả (Veloorvalappil và cs., 2003). Tuy nhiên, do nồng độ enzyme trong mô thực vật nói chung thấp nên cần sử dụng lƣợng lớn nguyên liệu thực vật để thu đƣợc protease. Nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi có khả năng tổng hợp mạnh protease. Protease vi sinh vật có thể ở trong tế bào hoặc đƣợc tiết vào môi trƣờng nuôi cấy (Phạm Thành Hổ, 2003). Các vi khuẩn thƣờng dùng trong tổng hợp protease là B. subtilis, B. cereus, B. brevis, B. licheniformis… sinh các protease trung tính. B. thermophilus tổng hợp protease chịu nhiệt, các loài xạ khuẩn tổng hợp protease gồm có S. griseus, S. rimosus…Nấm sợi tổng hợp protease gồm có A. oryzae, A. awamori, A. niger,… một số loài Penicilium và Rhizopus (Veloorvalappil và cs, 2003; Lƣơng Đức Phẩm, 2007). Do khả năng tăng sinh khối nhanh, các vi sinh vật sinh protease đƣợc xem là đối tƣợng thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống nhờ những ƣu điểm chính sau: - Chủ động quá trình sản xuất enzyme do quá trình sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào điều kiện ngoài. 6
- Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau và enzyme thu đƣợc từ chúng có hoạt tính cao. Chu kì sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể tăng năng suất thu hồi sản phẩm. - Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hƣớng có lợi (định hƣớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi). - Giá thành enzym vi sinh vật không cao nhờ môi trƣờng nuôi cấy tƣơng đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Cho đến nay, số lƣợng enzyme đƣợc sản xuất hàng năm ở các nƣớc phát triển (chủ yếu là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản) vào khoảng 300.000 tấn, trong đó có 600 tấn protease tinh khiết đƣợc sản xuất từ vi sinh vật, bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc (Veloorvalappil và cs, 2003). Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại cho phép sản xuất protease cố định trên các chất mang không tan, và điều đó giúp enzyme có thể đƣợc tái sử dụng dễ dàng. Bảng 1.1. Một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease cao (Veloorvalappil và cs, 2003) Nấm VK Bacillus spp. Aspergillus candidus Alteromonas sp. B. alcalophilus A. flavus Arthrobacterprotophormiae B. alcalophilus subsp. A. fumigatus Brevibacterium linens halodurans A. melleus Hyphomonasjannaschiana B. amyloliquefaciens A. niger Lactobacillus helveticus B. cereus strain A. oryzae Malbrancheapulchella var. B. circulans A. sojae sulfurea B. coagulans A. sydowi Microbacterium sp. B. firmus Cephalosporium sp. Nocardiopsisdassonvillei B. intermedius Chrysosporiumkeratinop Oerskoviaxanthineolytica B. lentus hilum Pimelobacter sp. B. licheniformis Conidioboluscoronatus Pseudomonas aeruginosa B. megaterium Entomophthoracoronata Pseudomonas maltophilia B. proteolyticus Fusariumeumartii Pseudomonas sp. B. pumilus Paecilomyces lilacinus Salinivibrio sp. B. sphaericus Scedosporium Staphylothermusmarinus B. subtilis 7