Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu tối ưu các điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21, thu nhận enzyme endolysin LysSa và đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus của endolysin LysSa tái tổ hợp trong bảo quản sữa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ XUÂN CÔNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG HÀ NỘI – NĂM 2018
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA Người hướng dẫn : PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG Học viên thực hiện : LÊ XUÂN CÔNG Lớp : K20 Hà Nội - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Khuất Hữu Trung. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó. Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Hà Nội, 06 tháng 8 năm 2018 Học viên Lê Xuân Công
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung, ThS. Nguyễn Thị Hồng Hải cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ sinh học, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật đã tận tình truyền đạt kiến thức trong hai năm tôi học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu luận văn mà còn là hành trang quí báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở cạnh tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Bộ môn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc. Hà Nội, ngày 6 tháng 8 năm 2018 Học viên Lê Xuân Công
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 Chương 13: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus .......................................3 1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus trên thế giới...............3 1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus ở Việt Nam ................5 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ...........................................................................6 1.2.1. Giới thiệu vê Staphylococcus ...............................................................................6 1.2.2. Hình thái và đặc điểm sinh hóa .........................................................................10 1.2.3. Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố ................................................................ 14 1.2.4. Tính kháng thuốc kháng sinh .............................................................................15 1.3. Enzym tái tổ hợp .................................................................................................. 15 1.3.1. Hệ thống biểu hiện:........................................................................................... 15 1.3.2.18Các vector biểu hiện .......................................................................................18 1.4. Tổng quan về enzym endolysin ........................................................................... 21 1.4.1. Giới thiệu về enzym endolysin ...........................................................................21 1.4.2. Vai trò và ứng dụng ........................................................................................... 23 1.4.3. Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn .......................................................24 1.4.4. Ứng dụng của endolysin trong công nghệ sinh học thực phẩm ........................26 1.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzym endolysin ......27 1.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy .................................................................27 1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ......................................................................27 1.5.3. Ảnh hưởng của pH ............................................................................................. 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP28 NGHIÊN CỨU .............................. 28 2.1. Vật liệu ..................................................................................................................29 2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 29 2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................30 2.3.1. Phương pháp biểu hiện gen LysSA trong vi khuẩn E.coli .................................30 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.coli BL21 tái tổ hợp đến sinh trưởng và biểu hiện endolysin .............................................31 2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của enzyme endolysin LysSa tái tổ hợp ........................................................................................... 31 2.3.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE .....................................................................32 2.3.5. Phương pháp tinh sạch enzyme endolysin bằng cột sắc ký ái lực ....................34 2.3.6. Xác định hoạt độ của enzym endolysin tái tổ hợp ............................................34
2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng của endolysin LysSa với vi khuẩn gây bệnh có trong sữa với các nồng độ endolysin và các thời gian bổ sung endolysin LysSa khác nhau .....................................................................................................................35 2.3.8. Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa............................................................................................................35 2.3.9. Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa ............................................................................................... 35 Chương 3: KẾT QUẢ ................................................................................................. 36 3.1. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.Coli BL21 tái tổ hợp và biểu hiện ................................................................................................................. 36 3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ..................................................................36 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy ........................... 37 3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng ...........................................39 3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và thu hồi sinh khối .................40 3.2. Nghiên cứu thu hồi enzym endolysin tái tổ hợp bằng phương pháp phá tế bào...41 3.3. Kết quả nghiên cứu tinh sạch enzyme endolysin tái tổ hợp. ................................ 42 3.4. Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus của enzym endolysin LysSa tái tổ hợp........................................................................................... 44 3.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .......................... 46 3.4.2. Phổ kháng khuẩn của enzym endolysin ............................................................. 47 3.5. HoNK \l "_Toc3793088"vi khuẩn gây bệnh của endolysin LysSapháp phá tế bàodolysin LysSan LysSa với ..................................................................................... 49 3.6. Chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa .......51 3.7. Hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh có trong sữa tươi thanh trùng của endolysin LysSa ........................................................................................................................... 52 3.8. Chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa ........53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 55 1. KẾT LUẬN..............................................................................................................55 2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 56
M5AGER Hiện nay ngộ độc thực phẩm đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Nguyên nhân là do con người sử dụng các loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố của chúng. Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sản xuất tốt (GMP), kiểm soát chất lượng và vệ sinh cũng như an toàn sản xuất và đánh giá rủi ro (HACCP), nhưng số lượng các trường hợp bị ngộ độc và bị bệnh do thực phẩm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua. Ở châu Âu, mỗi năm ước tính có hơn 380.000 người dân bị bệnh do sử dụng các sản phẩm thực phẩm nhiễm vi khuẩn, các loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella, Listeria. Staphylococcus aureus là tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn thế giới. S. aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang mầm bệnh sẽ có thể dẫn đến và viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố ruột của S. aureus, gây mất nước và điện giải có thể dẫn tới sốc. S. aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Những chủng S. aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh. S.aureus còn gây hội chứng sốc nhiễm độc do tiết ra độc tố gây sốc. Theo một số cơ quan quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S. aureus và Listeria cùng với một số loài khác. Sử dụng các chất hóa học để bảo quản thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản hóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng. Trong số các chất bảo quản sinh học được biết hiện nay, endolysin hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học do nó có khả năng diệt và ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của 1
thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thể. Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dung giải tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo. Do đó khi có mặt endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của mọi vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết. Do vậy chúng được coi như là một chất thay thế kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn cho con người. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa.” 1. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21, thu nhận enzyme endolysin LysSa và đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus của endolysin LysSa tái tổ hợp trong bảo quản sữa. 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng, xác định các điều kiện tối ưu cho chủng E.coli BL21 sinh trưởng và biểu hiện enzym endolysin LysSa: - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy - Ảnh hưởng của nhiệt độ - Ảnh hưởng của pH - Ảnh hưởng của chất cảm ứng IPTG 2.2. Nghiên cứu thu hồi và enzyme endolysin LysSa - Nghiên cứu phương pháp thu hồi enzyme endolysin LysSa - Nghiên cứu tinh sạch enzyme endolsin LysSa. 2.3. Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa 2
Chương 1 Thương 1N TÀI LIsữ 1.1.Tình hình ngu LIsữaus tính khánStaphylococcus aureus 1.1.1. Tình hình ngus aureusc ph hình ngus aureuscus aureus trên theusius Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, ở các nước công nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm. Trên thế giới, vụ ngộ độc lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan (Mỹ) do phomai. Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt từ bò bị bệnh. Khô bò bị nhiễm tụ cầu cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm 1907. Năm 1914, ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã gây ra ngộ độc ở người. Năm 1930, Dark lại xác định được vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh giáng sinh (Reginald Bennett, 2001). Ở Pháp, số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1999-2000 cho thấy: 32% số vụ là do sản phẩm sữa và đặc biệt là phô mai, 22% do thịt, 15% do xúc xích, bánh pate; 11% do các và hải sản; 11% do trứng và sản phẩm trứng; 9,5% do gia cầm (Haeghebaert và cs., 2002). Ngộ độc do S. aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonella (bảng 1.1). Những thực phẩm bị nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá, gà và sản phẩm của chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên men…(Normanno G. và cs, 2004). Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng (Wei H.L. và Chiou C.S., 2001). Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu (Simeão L.C và cs, 2001). Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S. aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm ( Rosec J.P. và Gigaud O., 2002). Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998, số trường hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số các vụ 3
ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau khi ăn trưa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong đó có 8 trường hợp phải nhập viện (Norinaga M. và cs, 2000). Bảng 1.1. Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp năm 1999-2000 (%) Tác nhân số vụ số trường Số nhập Số chết n=530 hợp n=6451 viện n=872 n=7 Salmonella sp. (Enteritidis, 63,8 47,7 16,8 100 Typhimurium, Heidelberg và một số serotype khác) Staphylococcus aureus 16 25,6 17,1 0 Clostridium perfringens 5,1 12,3 0,5 0 Bacillus cereus 2,8 3,7 10,0 0 Histamin 3,8 1,4 30,4 0 Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phẩm do S.aureus cũng rất khác nhau ở mỗi quốc gia. Chẳng hạn ở Mỹ, 50% số vụ ngộ độc được báo cáo từ năm 1969-1990 là từ các sản phẩm thịt, các món ăn từ thịt và đặc biệt là thịt muối; 22% trường hợp là do gia cầm, các món ăn từ gia cầm, 8% từ sữa và sản phẩm sữa; 7% do cá và tôm cua, ghẹ; 3,5% do trứng. Số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1975-1982 cho thấy: 36% do thịt; 12,3% do salad; 11,3% do gia cầm; 5,1% do bánh nướng, bánh bao và chỉ có 1,4% do sữa và sản phẩm hải sản. 17,1% thực phẩm liên quan vụ ngộ độc không được biết (Genigeorgis, 1989). Sự khác biệt này là do thói quen ăn uống cũng rất khác nhau theo từng nước. Tụ cầu gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm; và hàng năm, Mỹ mất khoảng 1,5 tỉ đô la cho những vụ ngộ độc do tụ cầu. Trong các loại độc tố gây ra các vụ ngộ độc thì SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và SEB (10%) (Normanno G.và ctv, 2004). 4
Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt. Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ rất lớn, từ 7-48oC. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít được chú ý (Mary K. S. và cs, 2002). 1.1.2. Tình hình ng vn bị trầy xước hay do ho, hắt hơi. Việc bảo quản Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu và cs, 2003). Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus (Nguyễn Đỗ Phúc và cs, 2003). Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn, chiếm 66% (Nguyễn Lý Hương và cs, 2005). Từ dữ liệu của Hội nghị tổng kết dự án bảo đảm chất lượng vệ sinh an tòan thực phẩm của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% so với năm 2005), làm 7.135 người bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có 64 vụ (38,8%) là do vi sinh vật gây ra (Hội nghị tổng kết dự án đảm bảo an tòan vệ sinh thực phẩm, tháng 3/2007, Cục vệ sinh an tòan thực phẩm, Bộ Y tế) Qua các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao, phù hợp với các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong 5
những năm qua. Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) (Nguyễn Đỗ Phúc và cs, 2003; Nguyễn Lý Hương và cs, 2005. Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta liên quan đến S.aureus và độc tố ruột của chúng đó là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/7/2006 trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa). Chiều cùng ngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người phải vào bệnh viện để cấp cứu. Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tố enterotoxin. Sau đó những vụ ngộ độ thức ăn do tụ cầu được phát hiện và nói đến nhiều hơn (Đỗ Thị Hòa, 2006). Ở Thành phố Hồ Chí Minh vụ ngộ độc xảy ra tại Trường Tiểu học Thanh Đa - Khu phố II Cư xá Thanh Đa, P.27, Q. Bình Thạnh ngày 03/5/2006, có khoảng 20 cháu bị ngộ độc. Sau khi ăn khoảng 30 phút các cháu có triệu chứng đau bụng, nôn ói, nhức đầu. Qua xét nghiệm cho thấy trong mẫu chất nôn đã có độc tố tụ cầu khuẩn nhóm A. Vụ ngộ độc ở nhà trẻ Hồng Nhung, thị trấn Đông Dương - H. Phú Quốc, Kiên Giang ngày 2/9/2006. Thức ăn gồm có yaourt, cơm, thịt xào. Các triệu chứng cũng tương tự như nôn ói, đau bụng. Kết quả kiểm tra cho thấy phần lớn các mẫu thực phẩm đầu nhiễm S.aureus từ 101 vi khuẩn/gam đến 107 vi khuẩn /gam. Trong đó độc tố được phát hiện có trong mẫu yaourt, độc tố nhóm C (Nguyễn Thị Kê, 2006). 1.2. Vi khuhu1Staphylococcus aureus 1.2.1. Gi. hylococcê Staphylococcus Staphylococcus là lọai cầu khuẩn, bao gồm cả loài hiếu khí (Micrococcus, Planococcus và Deinococcus), loài kị khí tuỳ nghi (Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pedio coccus, Aerococcus và Gemella) và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, 6
Coprococcus và Sarcina). Họ Micrococcaceae gồm bốn giống: Micrococcus, Stomacoccus, Planococcus và Staphylococcus. Những đặc tính khác nhau của cầu khuẩn Gram (+) gồm: sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, kị khí tuỳ nghi hay vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện cytochromes, sản phẩm lên men từ quá trình kị khí, peptidoglycan, axít teichoic trong thành tế bào vi khuẩn (Scott E.M và cs, 2000). Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:  Giới: Prokaryote  Phân loại: Firmicute  Lớp: Firmibacteria  Họ: Micrococceae  Giống: Staphylococcus Hiện nay có 32 loài Staphylococcus (bảng 1.2). Hàm lượng G+C trong giống từ 30-39 mol%. Một vài loài khác hiện nay đang được nghiên cứu. Có thể chia Staphylococcus thành 3 nhóm: - Nhóm cho phản ứng coagulase dương tính. - Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và nhạy với Nobovicine. - Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và kháng với Nobovicine. 7
Bảng 1.2. Các loài Staphylococcus TT Loài TT Loài TT Loài 1 S. aureus 12 S.pasteuri 23 S.simulans 2 S.capitis 13 S.equorum 24 S.intermedius 3 S.haemoliticus 14 S.felis 25 S.chromogens 4 S.sachatoliticus 15 S.schleiferi 26 S.lentus 5 S.saprophyticus 16 S.muscae 27 S.lugdenensis 6 S.cohnii 17 S.epidermis 28 S.caprae 7 S.xylosus 18 S.warneri 29 S.arlettae 8 S.carmosus 19 S.hominis 30 S.piscifermentans 9 S.hyicus 20 S.auriculari 31 S.delphini 10 S.sciuri 21 S.caseolyticus 32 S.vitulus 11 S.gallinarum 22 S.kloosii Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài thường gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính. Tên Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus (hạt). Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-1,5µm, có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùm không theo một trật tự nào cả. Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá nhiều. Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định. Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar (TSA) có thể màu kem đến màu hồng sáng. Các loài Staphylococcal là hiếu khí hoặc kị khí tuỳ nghi và có cả quá trình hô hấp và lên men. Staphylococci thu nhận năng lượng thông qua sự chuyển hoá glycosis, hexose monophosphate và chu trình 8
axít tricarboxylic. Staphylococci có catalase dương và sử dụng nhiều loại carbonhydrat khác nhau. Năm 1871, Von Recklinghausen, nhà khoa học người Đức lần đầu tiên theo dõi cầu khuẩn trong thận từ một bệnh nhân chết do nhiễm trùng máu. Năm 1880, Alexxander Ogston (bác sĩ phẫu thuật người Scốt-len) và Louis Pasteur đã chứng minh áp xe viêm mủ là do cầu khuẩn gây ra. Ogston đã theo dõi hai loại cầu khuẩn: một loại tạo thành chuỗi gọi là Streptococcus và một loại đứng thành chùm gọi là Staphylococcus. Ogston tin tưởng vào sự khám phá của mình và đặt tên cho cầu khuẩn đứng chùm là Staphylococcus. Ogston được công nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu – Staphylococcus vào năm 1882. Năm 1884, Rosenbach là người phân lớp Staphylococci dựa trên cơ sở tên của nhà khoa học Ogston và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E.M và cs, 2000). Phần lớn các loài Staphylococcus cư trú phổ biến ở da và màng nhầy. Một vài loài tìm thấy một số vị trí cố định như loài S. apcapitis chỉ tìm thấy vùng đầu và vùng trán. Các loài Staphylococcus tìm thấy ở người bao gồm: S.aureus, S.epidermidis, S.hominis, S.haemoliticus, S.warneri, S.captis, S.saccharolyticus, S.auricularis, S.simulans, S.saprophyticus, S.cohnii và S. xylosus. Staphylococci cư trú trên da người chiếm tỷ lệ 65-90% các chủng phân lập được. S.aureus là loài phổ biến nhất trong giống Staphylococcus. Trong điều kiện kị khí sự phát triển của vi khuẩn cần có amino acid và vitamin, nhưng trong điều kiện hiếu khí cần có thêm uracil và các nguồn carbon. S.aureus phát triển tốt nhất ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35 oC, nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45 oC, khoảng pH có thể phát triển từ 4,5 đến 9,3, nhưng pH tối thích khoảng 7,0 đến 7,5.  Phân lập và phát hiện Staphylococcus: Kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi với những dịch lỏng vô trùng (máu, dịch não tuỷ). Kết quả được xác nhận là cầu khuẩn Gram (+) có nghĩa tương đồng là Staphylococci. 9
Nhiều môi trường đặc dùng để phát hiện Staphylococci, đặc biệt là S.aureus. Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng một số hoá chất độc hại để tăng khả năng chọn lọc. Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithium chloride và nhiều kháng sinh khác nhau. Một số môi trường dùng để phân lập và xác định mức nhiễm S.aureus >100 vi khuẩn/g thực phẩm là môi trường staphylococcal 110, thạch VogelJohnson, thạch Egg yolk-sodium azide, thạch tellurite- polymixin-egg yolk và BairdParker. Phần lớn những môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường không bị tác động. Tuy nhiên do sự tác động của quá trình chế biến, bảo quản, điều kiện bất lợi, bị tác động đến ngưỡng gần chết thì việc tăng sinh S.aureus cần có những tác nhân chọn lọc. S. aureus có thể không phát triển trên những môi trường tăng sinh chọn lọc truyền thống. Môi trường Baird-Parker là môi trường thích hợp nhất cho việc tăng sinh những tế bào bị tổn thương. Các loài Staphylococcal có thể xác định qua một vài đặc điểm như hình thái khuẩn lạc, sự tạo thành coagulase, tan huyết, đề kháng novobiocin, sự tạo thành acetoin, sử dụng nguồn carbonhydrat điều kiện hiếu khí. Trên môi trường không chọn lọc như TSA (tryptic soy agar), thạch dinh dưỡng, phần lớn các loài staphylococcal phát triển mạnh sau 18-24 giờ/35oC với đường kính khuẩn lạc 1- 3 mm. Dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc có thể trợ giúp xác định các loài Staphylococcal (Scott E.M và cs, 2000). 1.2.2. Hình thái và đ cs, 2000)c 1-3 Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động. Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu. 10
Hình 1.1. Hình thái Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus Staphylococcus aureus aureus gram dương dưới kính hiển vi S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước: Cata lase H2O2 H2O + O2 S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S.aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S.aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase ―cố định‖ (―bound‖ coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase ―tự do‖ (―free‖ coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase ―cố định‖ bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase ―tự do‖ bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay thành cục (Collin C.H và cs, 1995) [9]. 11
Huyết tương Khối Fibrin Cơ chế thông thường biểu diễn quá trình đông tụ huyết tương như sau: Prothrombin Ca2+ Thrombokinase enzym Thrombin Coa Fibrinogen gulase Fibrin Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002). Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc. Hầu hết các dòng S.aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995). Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) (Mary K. S. và cs, 2002). 12
Môi trường Baird parker Môi trường Chapman Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên 2 môi trường nuôi cấy Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35-37oC (Trần Linh Thước, 2002). Bảng 1.3. Những đặc tính của S. aureus, S. epidermidis và Micrococci (Reginald W. B. và cs, 2001) Đặc tính S. aureus S. epidermidis Micrococci Catalase + + + Coagulase + - - Thermonuclease + - - Nhạy với Lysostaphin + + - Sử dụng glucose + + - 13
Sử dụng manitol + - - 1.2.3. Điginald W. B. và cs, 2001) [28]ng Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7- 48oC, với nhiệt độ cực thuận là 30-45oC; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33-55%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế. Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60oC từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế. Có 10-50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus. Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S. aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc. 14