Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của Peptide Mastoparan từ nọc ong Vespa Velutina thu ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được tiến hành với mong muốn phát hiện một loại mastoparan mới từ loài ong này và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của peptide này trên một số chủng vi khuẩn nhằm tìm kiếm khả năng ứng dụng của trong y dược của chúng, phục vụ đời sống con người như một chất kháng sinh mới.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của Peptide Mastoparan từ nọc ong Vespa Velutina thu ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Huế NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE MASTOPARAN TỪ NỌC ONG Vespa velutina THU Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội- 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Huế NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE MASTOPARAN TỪ NỌC ONG Vespa velutina THU Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn TS. Lê Thị Bích Thảo Hà Nội-2021
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn Phạm Thị Huế
Lời cảm ơn Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thảo, người cô đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tới GS.TS. Phan Văn Chi, TS. Bùi Thị Huyền, TS. Phạm Đình Minh cùng toàn thể các anh chị làm việc tại phòng Hóa sinh Protein, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học; Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Liên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; TS. Phạm Thị Hằng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương; Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Bạch Mai; và ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, các phòng chức năng của Học viện Khoa học và Công nghệ đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người thân đã luôn khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn!
Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitrile AMP Ampicillin Ampicillin CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CHCA α-Cyano-4- α-Cyano-4-hydroxycinnamic hydroxycinnamic acid acid CIP Ciprofloxacin Ciprofloxacin Da Dalton Dalton F7 Fraction 7 Phân đoạn 7 F9 Fraction 9 Phân đoạn 9 FA Formic acid Acid formic IMP Imipenem Imipenem KAN Kanamycin Kanamycin LEV Levofloxacin Levofloxacin LPS Lipopolysaccharid Lipopolysaccharid MALDI Matrix-assisted laser Kỹ thuật ion hóa theo cơ chế desorption/ionization giải hấp phụ sử dụng nguồn
laser với sự trợ giúp của chất nền MDRAB Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii kháng Acinetobacter baumannii đa thuốc mAu Milli Absorbance unit Mili đơn vị hấp thụ MCD Mast cell degranulating Phân hủy tế bào Mast MP Mastoparan Mastoparan tổng hợp MRSE Methicillin-resistant Methicillin-resistant Staphylococcus Staphylococcus epidermidis epidermidis MS Mass Spectrometry Khối phổ OXA Oxacilin Oxacilin PLA2 Phospholipase A-2 Phospholipase A-2 RP-HPLC Reverse Phase High- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha Performance Liquid đảo Chromatography SAM Ampicillin/sulbactam Ampicillin/sulbactam SXT Trimethoprim/Sulfameth Trimethoprim/Sulfamethoxazol oxazole e TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic
TFE Tetrafluoroethylene Tetrafluoroethylene TOF Time of Flight Thời gian bay
Danh mục bảng Bảng 1.1 Một số protein và peptide chính được tìm thấy trong nọc ong . ..... 13 Bảng 1.2 Trình tự amino acid của một số peptide mastoparan từ nọc của một số loài ong ....................................................................................................... 18 Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ....................... 29 Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng chính trong nghiên cứu ......................... 30 Bảng 3.1 Kết quả nhận diện phân đoạn 7 bằng phần mềm PEAK. ............... 40 Bảng 3.2 Kết quả nhận diện phân đoạn 9 bằng phần mềm PEAK. ................ 41 Bảng 3.3 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của F9 trên các chủng vi khuẩn ........ 46 Bảng 3.4 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của các phân đoạn F7 trên các chủng vi khuẩn. .............................................................................................................. 49 Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của MP trên các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh ............................................................ 52 Bảng 3.6 Mức độ nhạy cảm của các vi khuẩn đối với các MP và các loại thuốc kháng sinh ....................................................................................................... 56
Danh mục hình Hình 1.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) ....................................................... 5 Hình 1.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng (phía dưới) .................................................................................................................. 7 Hình 1.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) ..... 8 Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh học và các ứng dụng của chúng. ....................................................................... 9 Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong ........................... 10 Hình 1.6 Cấu trúc 3D của Mastoparan X được xác định bằng NMR. ........... 16 Hình 1.7 Sự so sánh trình tự của các gốc amino acid của các polypeptide tiền thân của mastoparan. ....................................................................................... 17 Hình 1.8 Các mô hình để giải thích các cơ chế của sự thấm qua màng ......... 24 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình các bước tiến hành ................................................. 31 Hình 3.1 Ong Vespa velutina cái .................................................................... 35 Hình 3.2 Cơ quan nọc độc của ong Vespa velutina sau khi được giải phẫu. 36 Hình 3.3 Sắc ký đồ của các phân đoạn của dịch chiết nọc ong Vespa velutina ......................................................................................................................... 37 Hình 3.4 Phổ MALDI-TOF của phân đoạn 7 (A) và phân đoạn 9 (B) ......... 39 Hình 3.5 Giải trình tự peptide các phân đoạn F7 (A) và F9 (B) có chứa mastoparan sử dụng De novo .......................................................................... 42 Hình 3.6 Sự so sánh trình tự của F7 và F9 với mastoparan từ các loài ong trong chi Vespa ......................................................................................................... 43 Hình 3.7 Phổ MALDI -TOF của MP trong hỗn hợp peptide sau khi tổng hợp ......................................................................................................................... 44 Hình 3.8 Hiệu quả ức chế sự sinh trưởng của mastoparan phân đoạn số 9 trên các chủng vi khuẩn .......................................................................................... 45
Hình 3.9 Hiệu quả ức chế sự sinh trưởng của mastoparan phân đoạn số 7 trên các chủng vi khuẩn .......................................................................................... 48 Hình 3.10 Kết quả Thử hoạt tính kháng khuẩn của MP trên các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh theo các nồng độ ................................................................ 53 Hình 3.11 Kết quả xác định mức độ nhạy cảm của MP và các kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh ...................................................... 55
1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------- 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ----------------------------------------- 5 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina -------------------------------------- 5 1.1.1 Phân loại khoa học-------------------------------------------------------- 6 1.1.2 Phân bố của ong Vespa velutina ---------------------------------------- 6 1.1.3 Hình thái của ong Vespa velutina -------------------------------------- 6 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG ------------------------------------------------- 8 1.2.1 Các thành phần của nọc ong-------------------------------------------- 9 1.2.1.1 Các enzyme ----------------------------------------------------------- 11 1.2.1.2 Các peptide ----------------------------------------------------------- 11 1.2.1.3 Các phân tử nhỏ khác ----------------------------------------------- 12 1.2.2 Ứng dụng của nọc ong ------------------------------------------------- 14 1.3 MASTOPARAN -------------------------------------------------------------- 15 1.3.1 Cấu tạo -------------------------------------------------------------------- 15 1.3.2. Hoạt tính của mastoparan -------------------------------------------- 20 1.3.2.1 Hoạt tính chung của mastoparan ---------------------------------- 20 1.3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan -------------------------- 21 1.3.2.3 Cơ chế hoạt động của các mastoparan chung trên màng của vi sinh vật ------------------------------------------------------------------------- 23 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM --------------------------- 25 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -- 28 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU ------------------------------------------------------- 28 2.1.1 Vật liệu sinh học--------------------------------------------------------- 28 2.1.2 Các hóa chất ------------------------------------------------------------- 29 2.1.3 Trang thiết bị ------------------------------------------------------------ 30 2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG ------------------------------------------- 31
2 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------------------------------------ 31 2.3.1. Thu thập và tách chiết nọc ong -------------------------------------- 31 2.3.2. Phân đoạn nọc ong và tinh sạch mastoparan --------------------- 32 2.3.3. Phân tích MALDI-TOF ----------------------------------------------- 32 2.3.4 Tổng hợp hóa học mastoparan bằng phương pháp tổng hợp peptide pha rắn ---------------------------------------------------------------- 33 2.3.5 Phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên đĩa thạch ---------- 34 2.3.6 Xử lý số liệu -------------------------------------------------------------- 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ---------------------------------- 35 3.1 THU THẬP VÀ TÁCH CHIẾT NỌC ONG Vespa velutina ----------- 35 3.1.1 Thu thập ong Vespa velutina ------------------------------------------ 35 3.1.2 Tách chiết nọc ong Vespa velutina ----------------------------------- 36 3.2 PHÂN ĐOẠN NỌC ONG VÀ TINH SẠCH MASTOPARAN-------- 36 3.3 NHẬN DIỆN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA MASTOPARAN ------------------------------------------------------------------ 38 3.4 TỔNG HỢP NHÂN TẠO MASTOPARAN ------------------------------ 44 3.5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MASTOPARAN --------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tự nhiên --------------- 45 3.5.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan được tổng hợp nhân tạo (MP).------------------------------------------------------------ 51 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ---------------------------------- 58 4.1 KẾT LUẬN -------------------------------------------------------------------- 58 4.2 KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------- 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO -------------------------------------------------------- 59
3 MỞ ĐẦU Thuốc kháng sinh là một trong những phát minh quan trọng nhất trong nghiên cứu y sinh. Với sự phát hiện ra penicillin của Alexander Fleming vào năm 1928, “kỷ nguyên kháng sinh” và nghiên cứu về thuốc kháng sinh đã được bắt đầu. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc chống nhiễm trùng trong bệnh viện và công nghiệp đã làm phát sinh và gia tăng số lượng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc. Các thuốc kháng sinh đang mất dần hiệu lực, vì vậy hướng nghiên cứu tìm kiếm các chất có tính kháng khuẩn, đặc biệt là kháng lại một số dòng vi khuẩn kháng kháng sinh là một nhu cầu cấp thiết của xã hội. Các peptide kháng khuẩn đã được nghiên cứu và cho thấy tiềm năng trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, nấm. Hiện nay, các peptide trong nọc độc của các loài động vật/côn trùng đang được quan tâm nghiên cứu ngày càng nhiều cho những ứng dụng phát triển chất kháng sinh mới. Trong số đó, mastoparan là ứng cử viên được quan tâm nhiều nhất. Vespa velutina là một trong những loài ong vò vẽ nguy hiểm có xuất xứ từ các nước Đông Nam Á. Đây là loài côn trùng có nọc độc cực mạnh, có thể tái tạo nọc độc nhiều lần. Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp trong thành phần có chứa các enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và B, phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ (apamin là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide - Mast cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5, mastoparan); và cuối cùng là các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm (histamin, noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine). Chúng đã được phát hiện có tiềm năng trong việc điều trị nhiều loại bệnh như một số bệnh rối loạn thần kinh, bảo vệ phóng xạ, chống đột biến, chống viêm, chống kích hoạt đau, và còn có khả năng sử dụng cho mục đích khác như kháng ung thư, kháng khuẩn,..vv. Từ những cơ sở dữ liệu đầu tiên về thành phần các protein/peptide có trong nọc ong Vespa velutina thu thập ở Việt Nam, mastoparan đã được nhận diện trong tổng số hơn 80 protein và peptide từ cơ sở dữ liệu này. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính
4 kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu ở Việt Nam” với mong muốn phát hiện một loại mastoparan mới từ loài ong này và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của peptide này trên một số chủng vi khuẩn nhằm tìm kiếm khả năng ứng dụng của trong y dược của chúng, phục vụ đời sống con người như một chất kháng sinh mới.
5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina Ong bắt mồi chân vàng, Vespa velutina (Hình 1.1) là một loài ong có nguồn gốc từ các nước khu vực Châu Á [1] và đã xâm nhập vào một số khu vực của Châu Âu, lần đầu tiên xuất hiện ở Pháp vào năm 2004 [1]. Như một kẻ săn mồi nói chung, chúng là một loài gây hại cho ong mật và là mối quan tâm chính của nhiều người nuôi ong. Hình 1.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) [1]
6 1.1.1 Phân loại khoa học Giới (regnum) : Animalia Ngành (phylum) : Arthropoda Lớp (class) : Insecta Bộ (ordo) : Hymenoptera Họ (familia) : Vespidae Phân họ (subfamilia) : Vespinae Chi (genus) : Vespa Loài (species) : V. velutina 1.1.2 Phân bố của ong Vespa velutina Vespa velutina có nguồn gốc từ Châu Á, là loài bản địa ở Đông Nam Á, xuất hiện ở Hàn Quốc [1], Trung Quốc [2] và Nhật Bản [3] và mốt số quốc gia Châu Á khác. Nó được du nhập vào Pháp vào năm 2004, rất có thể thông qua việc nhập khẩu các chậu cây cảnh [2]. Loài này có khả năng xâm lấn rất cao và dễ dàng lây lan sang các khu vực châu Âu khác như Ý [4], Anh [5], Quần đảo Balearic [6] và miền bắc nước Đức [7] Phân bố của loài ong Vespa velutina ở Việt Nam Loài ong Vespa velutina có thể được tìm thấy ở các tỉnh của Việt Nam như: Hà Giang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, v.v. [8] 1.1.3 Hình thái của ong Vespa velutina V. velutina rất đa dạng về màu sắc và 10 phân loài đã được xác định [8], [9], [10]. C. Villemant (Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Quốc gia, Paris, thông tin cá nhân của Pháp, 2013) mô tả Vespa velutina nigrithorax (Hình 1.2 và Hình 1.3) như sau:
7 Ong cái: Đầu và ngực nhọn, có lông tơ mịn mọc rải rác, bụng có rãnh. Cơ thể màu nâu sẫm, mặt và miệng có màu cam (trừ răng sẫm màu); râu màu nâu ở mặt lưng, màu cam ở bụng. Mặt lưng của các đoạn bụng màu nâu với các rìa đỉnh rõ ràng hơn: một dải mỏng màu vàng ở đoạn thứ nhất và dải mỏng màu cam ở đoạn thứ hai và thứ ba; đoạn bụng thứ tư gần như hoàn toàn màu cam với một vạch đen hình tam giác ở giữa, thường không nhìn thấy khi ong bắp cày còn sống; đoạn bụng thứ năm và thứ sáu có màu nâu cam nhiều hơn hoặc ít hơn. Phần bụng màu nâu, đỉnh hình tam giác thường nhạt hơn; phân đoạn thứ hai và thứ ba màu vàng toàn thân với một vạch đen ở giữa. Chân màu nâu trừ tarsi vàng; cánh màu nâu xám. Không có sự khác biệt rõ rệt về hình thái giữa con cái (ong thợ) hữu tính và bất dục. Một số ong thợ nhỏ hơn (đặc biệt là vào mùa xuân) nhưng vào mùa thu, nhiều ong thợ lớn như những ong chúa tương lai. Bên trong đàn, có thể nhận ra ong chúa đẻ trứng bằng phần bụng căng phồng và vào cuối mùa, đôi cánh bị hư hại. Hình 1.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng (phía dưới) [11]
8 Con đực: rất giống con cái về kích thước và màu sắc, râu dài hơn. Mặt bụng của bụng màu nâu, đỉnh cụt có một đôi đốm vàng. Ong đực và ong cái có thể phân biệt với nhau bằng các râu của chúng, với các râu ong cái có vẻ mỏng hơn và chiều dài ngắn hơn so với râu của ong đực. Như với tất cả các Bộ cánh màng, con cái có ngòi độc còn con đực thì không. Hình 1.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) [12] 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG Các sinh vật sử dụng nọc độc như một thứ vũ khí hoá học hiệu quả để tự vệ và săn bắt con mồi, vì vậy nọc của chúng được tiến hoá theo hướng đặc trưng cho loài và độc tính cao. Bên cạnh đó, nọc độc cũng là nguồn dự trữ các hợp chất có hoạt tính sinh học quý, mang lại nhiều hứa hẹn trong việc tìm tòi và phát triển các loại thuốc chữa bệnh (Hình 1.4).
9 Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh học và các ứng dụng của chúng [13]. 1.2.1 Các thành phần của nọc ong Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp chứa 3 nhóm chất chính: gồm các enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và B, phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ (apamin là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide - Mast cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5, mastoparan); và cuối cùng gồm các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm (histamin, noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine) (Bảng 1.1) [14].
10 Hyaluronidase Phospholipase A2 Melittin Mastoparan Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong