Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào" trình bày các nội dung chính sau: Xác định đặc tính ỹ thuật của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01 dự tuyển MCQG; Xác định đơn vị miễn dịch (ĐVMD) của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01 theo MCQT; Nghiên cứu tính ổn định và dự đoán tuổi thọ của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --------------------------- Trần Ngọc Nhơn NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN SỬ DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --------------------------- Trần Ngọc Nhơn NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN SỬ DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Nguyễn Thị Lan Phƣơng Hà Nội - 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận v n Th c s “Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào” là công trình nghiên cứu của riêng cá nh n tôi và nh m nghiên cứu hông sao chép của ai Do tôi và nh m nghiên cứu tự nghiên cứu đọc, dịch tài liệu, tổng hợp và thực hiện. Nội dung lý thuyết trong luận v n tôi c sử dụng một số tài liệu tham khảo nhƣ đã trình bày trong phần tài liệu tham khảo Các số liệu, chƣơng trình phần mềm và những kết quả trong luận v n là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào hác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc Học viện Khoa học và Công nghệ nếu phát hiện bất cứ sự sai ph m hay sao chép trong đề tài này! Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2021 Học viên Trần Ngọc Nhơn
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho phép tôi ch n thành cảm ơn đến PGS.TS. Nguyễn Thị Lan Phƣơng, ngƣời thầy đã tận t m hƣớng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận v n Tôi xin ch n thành cảm ơn Viện trƣởng TS Dƣơng Hữu Thái đã quan t m và t o điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận v n t i viện IV C Cảm ơn các b n đồng nghiệp Khoa Mẫu chuẩn Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB), phòng Kiểm Định (IVAC) đã hợp tác và giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin ch n thành cảm ơn Ban lãnh đ o Học viện Khoa học và Công nghệ Phòng Đào t o Khoa Công nghệ Sinh học và quý thầy cô đã d y dỗ và t o mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận v n Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình luôn động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin ch n thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2021 Học viên Trần Ngọc Nhơn
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Ý ngh a 01 CV Coefficient of variation Độ biến thiên 02 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam Diptheria – Pertussis – B ch hầu – Ho gà – 03 DPT Tetanus Uốn ván 04 ĐVMD Đơn vị miễn dịch 05 FHA Filametous Haemagglutinin Good Manufacturing 06 GMP Thực hành sản xuất tốt Practice 07 IU International unit Đơn vị quốc tế Institute of Vaccines and Viện Vắc xin và Sinh 08 IVAC Medical Biologicals phẩm Y tế 09 MCQG Mẫu chuẩn quốc gia 10 MCQT Mẫu chuẩn quốc tế Viện Kiểm định Quốc National Institute for Control 11 NICVB gia Vắc xin và Sinh of Vaccines and Biologicals phẩm Y tế 12 PT Pertussis Toxin 13 PTN Phòng thí nghiệm 14 SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn
15 TCMR Tiêm chủng Mở rộng 16 VXMC Vắc xin mẫu chuẩn 17 VXMT Vắc xin mẫu thử 18 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 1 Công thức pha chế 1800 ml VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 hấp phụ .............................................................................................................22 Bảng 2.1. Tiêu chuẩn dự kiến của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ......24 Bảng 3.1. Kết quả nhận d ng háng nguyên FH và PT trong mẫu vắc xin RaP01 ...............................................................................................................43 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 .45 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra tính chất vật lý vắc xin ho gà vô bào RaP01 .......48 Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu về h a học của vắc xin RaP01 ..........49 Bảng 3.5. Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin RaP01..........50 Bảng 3.6. Kết quả xác định ĐVMD của vắc xin RaP01 t i IVAC ..................51 Bảng 3 7 Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) ..... 54 Bảng 3 8 Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 5°C ± 3°C .......................55 Bảng 3.9. Kết quả xác định các chỉ tiêu cảm quan và tính chất vật lý theo thời gian của vắc xin RaP01 ở -40°C ± 2°C ....................................................56 Bảng 3.10. Kết quả xác định các chỉ tiêu cảm quan và tính chất vật lý theo thời gian của vắc xin RaP01 ở 5°C ± 3°C........................................................57 Bảng 3 11 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 25°C ± 2°C...............58 Bảng 3 12 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 37°C ± 2°C...............58 Bảng 3 13 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 45°C ± 2°C...............59 Bảng 3.14. Kết quả công hiệu RaP01 t i các thời điểm ủ mẫu ở nhiệt độ 45°C ± 2°C .......................................................................................................60
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 1 Khuẩn l c Bordetella Pertussis trên môi trƣờng Bordert Gengou ... 7 Hình 1 2 Cấu trúc háng nguyên vi huẩn Bordetella pertussis .................... 7 Hình 1 3 Ho gà và mức độ bao phủ tiêm vắc xin DPT3, Việt Nam, ............. 12 Hình 1 4 Bản đồ tỷ lệ tiêm vắc xin ho gà ở trẻ n m 2019 ............................. 12 Hình 1 5 Tỷ lệ tiêm chủng 3 mũi vắc xin ho gà trên toàn thế giới n m 1980 – 2019 ..................................................................................................... 13 Hình 1 6 Sơ đồ t m tắt quy trình sản xuất VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 .............................................................................................................. 23 Hình 2.1. VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc sản xuất t i IVAC ..... 24 Hình 2 2 Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu ...................................................... 27 Hình 3 1 Kết quả kiểm tra vô trùng mẫu RaP01 ............................................ 42 Hình 3 2 Kết quả sau nhuộm của thí nghiệm nhận d ng háng nguyên PT và FH trong mẫu vắc xin RaP01 .................................................................. 42 Hình 3 3 T ng trọng trung bình của chuột nhắt trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01.................................................. 44 Hình 3 4 T ng trọng trung bình của chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01.................................................. 44 Hình 3 5 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đông hô ............................ 46 Hình 3 6 Độ ẩm tồn dƣ của các ống vắc xin RaP01 đông hô ...................... 47 Hình 3 7 Khối lƣợng hô của các ống vắc xin RaP01 đông hô ................... 47 Hình 3 8 Số ĐVMD trung bình của 1 ống vắc xin ho gà RaP01 đông hô chuẩn độ t i IV C và NICVB ........................................................................ 53 Hình 3 9 Đồ thị biểu diễn công hiệu của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ở -40°C ± 2°C ...................................................................................... 54 Hình 3 10 Đồ thị biểu diễn công hiệu của mẫu chuẩn RaP01 ở 5°C ± 3°C .. 55 Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc công hiệu của RaP01 bảo quản ở nhiệt độ 45°C ± 2°C theo các tuần .................................................................. 60
1 MỤC LỤC LỜI C M ĐO N LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC ......................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1 T NG QU N TÀI LIỆU ........................................................... 6 1 1 T NG QU N VỀ BỆNH HO GÀ ............................................................ 6 1 1 1 Tác nh n g y bệnh và cơ chế bệnh sinh.................................................. 6 1.1.1.1. Vi khuẩn ho gà ..................................................................................... 6 1 1 1 2 Các yếu tố độc lực và háng nguyên bảo vệ ........................................ 7 1 1 1 3 Cơ chế bệnh sinh ................................................................................ 10 1 1 2 Đƣờng l y và dịch tễ học bệnh Ho gà ................................................... 11 1.2. VẮC XIN HO GÀ .................................................................................... 12 1.2.1. Miễn dịch bảo vệ đối với ho gà............................................................. 12 1 2 2 Các lo i vắc xin ho gà ........................................................................... 13 1.2.3. Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà .................................................. 15 1.2.4. Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ............................... 16 1.2.4.1. Mẫu chuẩn quốc tế vắc xin ho gà vô bào ........................................... 16 1.2.4.2. Nhu cầu tính cần thiết của vắc xin mẫu chuẩn quốc gia ................... 16 1 2 4 3 Đặc điểm vắc xin mẫu chuẩn quốc gia .............................................. 17 1 2 4 4 Đánh giá chất lƣợng vắc xin mẫu chuẩn ............................................ 18 1.2.4.5. Chuẩn định với mẫu chuẩn quốc tế .................................................... 19 1 2 4 6 Đánh giá tính ổn định ......................................................................... 19
2 1.2.5. Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia ... 21 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU .................. 24 2 1 ĐỐI TƢỢNG NGHI N CỨU ................................................................. 24 2.2. VẬT LIỆU NGHI N CỨU ..................................................................... 25 2 2 1 Động vật thí nghiệm .............................................................................. 25 2.2.2. Sinh phẩm – h a chất ............................................................................ 25 2.2.3. Dụng cụ - thiết bị................................................................................... 26 2 3 PHƢƠNG PHÁP ...................................................................................... 27 2 3 1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm ............................................................. 27 2 3 2 Phƣơng pháp xác định các đặc tính ỹ thuật ........................................ 28 2 3 2 1 Phƣơng pháp iểm tra vô trùng .......................................................... 28 2 3 2 2 Phƣơng pháp iểm tra nhận d ng háng nguyên PT FH ............... 28 2 3 2 3 Phƣơng pháp iểm tra an toàn chung................................................. 29 2 3 2 4 Phƣơng pháp iểm tra cảm quan và tính chất vật lý .......................... 29 2 3 2 5 Phƣơng pháp iểm tra các chỉ tiêu h a học ....................................... 31 2.3.2.6. Kiểm tra các đặc tính háng nguyên .................................................. 35 2 3 3 Phƣơng pháp xác định đơn vị miễn dịch trong ống vắc xin mẫu chuẩn (nối chuẩn)....................................................................................................... 38 2 3 4 Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ....................................................................................................... 39 2 3 4 1 Nghiên cứu tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) ............ 39 2 3 4 2 Nghiên cứu tính ổn định ở các dải nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản ................................................................................................................. 39 2.3.5. Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff......................... 39 2 3 6 Phƣơng pháp xử lý số liệu..................................................................... 40 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 41
3 3.1. KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH CHẤT LƢỢNG LÔ VẮC XIN RaP01 ĐÔNG KHÔ DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO................................................................................................................. 41 3.1.1. Kết quả kiểm tra vô trùng ..................................................................... 41 3.1.2. Kết quả kiểm tra nhận d ng háng nguyên aP...................................... 42 3.1.3. Kết quả kiểm tra an toàn chung ............................................................ 43 3.1.4. Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý...................................... 45 3.1.5. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu h a học ................................................... 49 3.1.6. Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin ho gà vô bào RaP01 .............................................................................................................. 50 3.2. KẾT QUẢ CHUẨN ĐỊNH ĐƠN VỊ MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO RaP01 ....................................................................................... 50 3.3. KẾT QUẢ NGHI N CỨU TÍNH N ĐỊNH CỦA VẮC XIN HO GÀ RaP01 ............................................................................................................... 53 3 3 1 Tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản ......................................................... 53 3 3 1 1 Tính ổn định về công hiệu ở nhiệt độ -40°C ± 2°C và 5°C ± 3°C........... 53 3 3 1 2 Tính ổn định về cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 ở các nhiệt độ bảo quản ...................................................................................... 56 3 3 2 Tính ổn định ở nhiệt độ thúc đẩy nhanh và dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ................................................. 58 3 3 2 1 Tính ổn định ở các nhiệt độ 25°C ± 2°C; 37°C ± 2°C và 45°C ± 2°C58 3.3.2.2. Dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 .............................................................................................................. 59 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 62 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 62 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 63 PHỤ LỤC
4 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ở Việt Nam, bệnh ho gà lƣu hành ở tất cả các tỉnh thành trong cả nƣớc. Khi chƣa thực hiện chƣơng trình Tiêm chủng mở rộng (TCMR), bệnh ho gà thƣờng xảy ra và t o thành dịch ở nhiều địa phƣơng đặc biệt nghiêm trọng ở miền núi nơi c trình độ kinh tế - xã hội phát triển thấp. Bệnh thƣờng diễn biến nặng, dễ tử vong do bị bội nhiễm g y biến chứng viêm phổi viêm phế quản - phổi, nhất là ở trẻ dƣới 5 tuổi và trẻ suy dinh dƣỡng. Dịch c tính chu kỳ khoảng 3-5 n m N m 1979 tỷ lệ mắc bệnh ho gà rất cao với 134 trƣờng hợp mắc bệnh/100 000 d n Sự ra đời của vắc xin ho gà vào n m 1923 mang một ý ngh a lịch sử quan trọng Các d ng vắc xin ho gà đang đƣợc sử dụng hiện nay là vắc xin ho gà toàn tế bào bất ho t và vắc xin ho gà vô bào tinh chế từ các thành phần háng nguyên của vi khuẩn ho gà đều c hả n ng t o miễn dịch bảo vệ chống l i bệnh Nghiên cứu sản xuất vắc xin ho gà t i Việt Nam c từ n m 1959 t i Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng nuôi cấy vi khuẩn ở d ng t nh và sản xuất vắc xin theo phƣơng pháp cổ điển N m 1990 Viện Vắc xin đã sản xuất thành công vắc xin ho gà toàn tế bào bất ho t trên d y chuyền lên men do Quỹ Nhi đồng Liên hợp quốc (UNICEF) tài trợ. Hiện nay ƣớc tính hằng n m cả nƣớc sử dụng từ 5 đến 7 triệu liều vắc xin ho gà Với nhu cầu lớn về cung ứng vắc xin ho gà hằng n m nhƣ vậy thì việc kiểm soát chất lƣợng vắc xin là rất cần thiết Tuy nhiên hiện nay, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) chỉ cung cấp mẫu chuẩn quốc tế (MCQT) cho chuẩn định mẫu chuẩn quốc gia (MCQG) Do đ WHO huyến cáo các quốc gia đặc biệt các quốc gia c ngành công nghiệp sản xuất vắc xin, phải tự sản xuất MCQG để chủ động trong việc kiểm tra chất lƣợng vắc xin. Nhận biết tính cấp thiết về nhu cầu vắc xin mẫu chuẩn (VXMC) dùng trong kiểm định trong huôn hổ dự án sản phẩm quốc gia vắc xin sử dụng cho ngƣời, viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB) phối hợp với các nhà sản xuất trong nƣớc thực hiện dự án sản xuất 11 lo i
5 MCQG, trong đ Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) tham gia sản xuất lô VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 từ n m 2019 và đã hoàn thành vào n m 2020 Với ý ngh a nhƣ trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá chất lƣợng và tính ổn định của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Lô vắc xin ho gà vô bào đông hô RaP01 để dự tuyển MCQG dùng cho xác định công hiệu vắc xin ho gà vô bào. 4. Nội dung nghiên cứu - Xác định đặc tính ỹ thuật của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01 dự tuyển MCQG. - Xác định đơn vị miễn dịch (ĐVMD) của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01 theo MCQT. - Nghiên cứu tính ổn định và dự đoán tuổi thọ của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01. 5. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài Thành công của đề tài sẽ t o ra đƣợc lô mẫu chuẩn ho gà vô bào ở cấp độ quốc gia Đ y là một mẫu chuẩn thiết yếu hông thể thiếu đối với việc kiểm định và cấp phép sử dụng các lo i vắc xin ho gà vô bào. Thành công này g p phần vào thành công của dự án sản phẩm quốc gia sản xuất 11 lo i mẫu chuẩn dùng trong iểm định các vắc xin thiết yếu của chƣơng trình TCMR quốc gia. Sự ra đời của mẫu chuẩn ho gà vô bào quốc gia giúp chủ động trong quá trình iểm định chất lƣợng vắc xin và tiết kiệm ngo i tệ cho đất nƣớc. Do đ đề tài c ý ngh a hoa học và thực tiễn rất lớn.
6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. T NG QU N VỀ BỆNH HO GÀ 1.1.1. Tác nhân gây bệnh và cơ chế bệnh sinh 1.1.1.1. Vi khuẩn ho gà Bệnh ho gà là một bệnh nhiễm trùng cấp tính đƣờng hô hấp với đặc tính là các cơn ho đặc trƣng và éo dài trong thời gian rất l u N m 1991 WHO đã đƣa ra tiêu chuẩn chẩn đoán xác định bệnh ho gà gồm 4 yếu tố sau: (1) cơn ho ịch phát éo dài 21 ngày hoặc hơn (2) nuôi cấy xác nhận c vi khuẩn ho gà (3) háng thể háng háng nguyên ngƣng ết hồng cầu d ng sợi (FHA) hoặc háng thể háng độc tố ho gà (PT) trong huyết thanh t ng và (4) c tiền sử tiếp xúc trực tiếp hoặc c sự liên hệ chặt chẽ với bệnh nh n mắc bệnh ho gà [1]. Tác nh n g y bệnh là vi huẩn ho gà (Bordertella pertussis) Đ y là vi khuẩn c hình thái cầu trực khuẩn hay hình bầu dục ích thƣớc nhỏ 0,3 – 0 8 µm x 0 2 - 0 3 µm, gram m hông di động. Vi khuẩn bắt màu thuốc nhuộm tốt với xanh Methylen, Phenol Toludin hay Fusin kiềm. Khi bắt màu thuốc nhuộm chung quanh và 2 cực của vi khuẩn c màu đậm hơn [2]. Vi khuẩn ho gà sống hiếu hí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp từ 35°C – 37°C, trong khoảng pH từ 7,0 – 7,2. Vi khuẩn mọc trên môi trƣờng th ch máu đòi hỏi cả 2 yếu tố V và X Khuẩn l c nhỏ tròn bờ đều, lồi, ẩm ƣớt, mờ đục hoặc xanh nh t nhƣ xà cừ hoặc sáng b ng c ánh im Xung quanh huẩn l c c vòng tan máu Trên môi trƣờng lỏng làm đục nhẹ môi trƣờng ánh hơi sáng Vi khuẩn tƣơng đối trơ hông lên men hầu hết các lo i đƣờng Tính chất đề háng yếu, bị bất ho t ở 56°C sau 30 phút Vi huẩn ém bền với tác nh n h a học và chất sát huẩn [3].
7 Hình 1.1. Khuẩn l c Bordetella Pertussis trên môi trƣờng Bordert Gengou 1.1.1.2. Các yếu tố độc lực và kháng nguyên bảo vệ Vi khuẩn ho gà sở hữu một lo t các yếu tố độc lực, bao gồm các yếu tố bám dính và các độc tố trong đ một số là các háng nguyên c hả n ng ích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống l i ho gà ( háng nguyên bảo vệ). Hình 1.2. Cấu trúc háng nguyên vi huẩn Bordetella pertussis [4] - FHA (Filamentous haemagglutinin adhesin: yếu tố ngƣng ết hồng cầu d ng sợi): FH là một protein diềm tua c trọng lƣợng ph n tử 220 kDa, bao phủ bề ngoài vi huẩn FH c thể hấp phụ đƣợc trên bề mặt nhiều lo i tế bào và làm ngƣng ết chúng đ ng vai trò thiết yếu trong quá trình bám dính
8 của vi khuẩn vào tế bào biểu mô đƣờng hô hấp. Bản th n FH hông c thành phần g y độc cho tế bào nhƣng vai trò của n trong việc hình thành nên độc lực của vi khuẩn là rất quan trọng. Kháng thể háng FH c thể g y cản trở quá trình nhiễm trùng bằng việc làm cho vi khuẩn hông bám dính đƣợc vào tế bào vật chủ FH là một thành phần háng nguyên quan trọng thƣờng c trong vắc xin ho gà vô bào [4]. - FIM hay GG (Fimbriae hay gglutinogen: ngƣng ết nguyên 1 2 3): Các ngƣng ết nguyên là các háng nguyên bề mặt ho gà hông chịu nhiệt, liên quan đến các type huyết thanh của vi khuẩn g y bệnh và sự ngƣng ết của vi khuẩn Chúng c vai trò trong việc giúp vi huẩn bám vào đƣờng hô hấp vật chủ thông qua việc bám dính các tế bào biểu mô lông và tế bào đơn nh n Trong thực tế háng thể háng FIM t o miễn dịch bảo vệ thụ động đối với chuột chống l i nhiễm trùng hô hấp với vi khuẩn ho gà [5]. - PRN (Pertactin hay protein màng ngoài tế bào hay protein 69 kDa): Bên c nh các FIM một háng nguyên protein màng ngoài c trọng lƣợng ph n tử xấp xỉ 60 kDa cũng là một háng nguyên c ho t tính g y đáp ứng miễn dịch Pertactin đƣợc cho là c vai trò giúp vi huẩn bám dính vào tế bào vật chủ tƣơng tự FH và FIM [5]. - PT (Pertussis Toxin: độc tố ho gà): Đ y là một ngo i độc tố mang bản chất protein c cấu trúc phức hợp đƣợc tiết ra trong giai đo n vi khuẩn nh n lên m nh PT c cấu trúc ngo i độc tố điển hình theo iểu A - B bao gồm 6 chuỗi, trọng lƣợng ph n tử 105 kDa. Tiểu phần là chuỗi S (26 kDa) và tiểu phần B là một phức hợp gồm 5 chuỗi từ S2 đến S5 theo tỷ lệ ph n tử lƣợng là 1:2:1:1 [3]. PT chịu trách nhiệm g y nên một lo t các biểu hiện bệnh lý đặc trƣng của ho gà gồm: làm t ng m nh b ch cầu máu ngo i vi trong đ chủ yếu là Lymphocyte t ng nh y cảm với các amin hữu cơ Histamine, ho t h a tế bào β của tụy làm giảm Glucose máu ích thích hay ức chế hệ thống miễn dịch thông qua các tế bào mô lympho, PT tác động lên tế bào nuôi và c thể làm tan máu thậm chí trên in vitro t o nên sự co cụm tế bào và ngƣng ết hồng cầu. Kháng
9 thể háng PT c thể trung hòa hay bất ho t các ho t tính sinh học của PT trên in vivo và in vitro Ngoài ra PT còn c hả n ng tác động đến đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua cơ chế điều hòa miễn dịch, t o nên sự t ng sản tế bào miễn dịch làm tế bào T tiết Interlekin IL-2 và Interferon γ (IFN γ) và làm t ng sự biểu thị ph n tử CD28 trên bề mặt của chúng Do đ PT là thành phần hông thể thiếu trong vắc xin ho gà vô bào [6]. - CT ( denylatecyclase: độc tố enzym): CT là một protein đơn c trọng lƣợng ph n tử 177 Da và thuộc nh m độc tố c cấu trúc d ng A-B giống nhƣ độc tố b ch hầu Độc tố c cả 2 ho t tính Enzym: ho t tính denylate Cyclase và ho t tính ly giải hồng cầu, nằm trên 2 vùng hác nhau của ph n tử CT Đ y là một độc tố quan trọng giúp vi khuẩn x m nhập vào biểu mô hô hấp Ngoài ra n còn c hả n ng ức chế đáp ứng miễn dịch nhờ cơ chế g y độc tế bào và ức chế sự trình diện của các háng nguyên với tế bào Lympho T Các hiệu quả trên nhằm trốn tránh đáp ứng miễn dịch và éo dài sự sống s t của Bordetella Pertussis trong tế bào vật chủ [4]. - TCT (Traheal Cytotoxin: độc tố hí quản): Các cơn ho gà đặc trƣng c thể đƣợc quy cho TCT Đ y là một Disaccharide Tetrapeptide, trọng lƣợng ph n tử 921 Dalton đƣợc phát sinh từ lớp Petidoglycan ở vỏ của tế bào vi khuẩn TCT làm tổn thƣơng lớp tế bào biểu mô của phổi và chịu trách nhiệm về bệnh lý t i chỗ trong nhiễm trùng Bordetella Pertussis [5]. - DNT (Dermonecrotic Toxin: độc tố g y ho i tử da): DNT còn đƣợc gọi là độc tố g y chết hay độc tố hông bền với nhiệt (HLT: heat labit toxin), c trọng lƣợng ph n tử 102 Da đƣợc tìm thấy trong tất cả các loài Bordetella. Độc tố thuộc về nh m các yếu tố g y ho i tử do tác động đến sự điều hòa t ng trƣởng hoặc ph n chia của vi khuẩn g y nên phản ứng viêm loét ho i tử xung quanh vùng vi huẩn x m nhập trên tế bào biểu mô hô hấp. DNT là độc tố c cơ chế họat động phức t p tác động của n đến các phản ứng sinh lý đối với vật chủ chƣa rõ [6].
10 - LPS (Lipopolysacchaide) hay nội độc tố (endotoxin): LPS là thành phần chính của màng ngoài vi huẩn hiện diện ở nhiều loài vi huẩn gram m Đối với vi khuẩn ho gà LPS chịu trách nhiệm ích thích tế bào tiết các cyto ine hác của phản ứng viêm đặc biệt là IL-1β đƣợc cho là đ ng vai trò chính trong phản ứng toàn th n và của hệ thần kinh khi bị nhiễm trùng hay sau tiêm vắc xin [4]. LPS hông c vai trò trong miễn dịch bảo vệ đối với ho gà 1.1.1.3. Cơ chế bệnh sinh Vi khuẩn x m nhập vào cơ thể qua đƣờng hô hấp trên sau đ các độc tố của vi khuẩn g y ho i tử ở biểu mô đƣờng hô hấp hay g y tổn thƣơng ở lớp đáy và lớp giữa của tế bào biểu mô g y viêm cấp tính đƣờng hô hấp và ích thích sự t ng bài tiết của dịch rỉ nhầy của tế bào biểu mô hô hấp Thƣơng tổn xảy ra chủ yếu ở phế quản và tiểu phế quản Khí quản và thanh quản c thể bị tổn thƣơng nhƣng nhẹ hơn Dịch rỉ nhầy c thể làm tắc nghẽn các tiểu phế quản g y xẹp phổi hu trú hay g y bội nhiễm ở phổi đặc biệt hay xảy ra ở trẻ sơ sinh Những thƣơng tổn t i phổi chủ yếu do các độc tố của vi khuẩn tác động đến thần kinh phế quản làm xuất tiết ở phế quản hoặc làm giãn phế quản t m thời [7]. Ngo i độc tố do vi khuẩn tiết ra x m nhập vào máu g y nên các rối lo n trao đổi chất của tế bào vật chủ do làm rối lo n sinh tổng hợp MP vòng và là nguyên nh n của hàng lo t những biến đổi sinh học nhƣ: t ng b ch cầu lympho ích thích tế bào β tiết insulin g y h đƣờng huyết t ng sự thủy ph n lipid làm biến đổi sự di trú của đ i thực bào ảnh hƣởng đến hiệu lực miễn dịch,... Nội độc tố lipopolysaccharide (LPS) là một độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn ít c ý ngh a trong sinh bệnh học của ho gà nhƣng l i chịu trách nhiệm về các phản ứng toàn th n chung ở giai đo n đầu của bệnh Ngoài ra vi huẩn còn c những thành phần c ho t tính sinh học hác nhƣ độc tố hông bền với nhiệt (HLT) độc tố hí quản (TCT) độc tố enzyme adenylcyclase (ACT), yếu tố ngƣng ết hồng cầu hình sợi (FH ) các ngƣng ết nguyên bề mặt (FIM hay
11 GG 2 3) đều là các yếu tố độc lực giúp vi huẩn bám định vị và g y tổn thƣơng tế bào biểu mô hô hấp và làm rối lo n các chức n ng sinh học của vật chủ. Những rối lo n hô hấp nhƣ ngƣng thở, ng t thở c lẽ liên quan đến tổn thƣơng trung t m hô hấp ở hành tủy do độc tố g y nên Một số ý iến cho rằng viêm não do ho gà xảy ra trong một số trƣờng hợp c vai trò của độc tố [8]. 1.1.2. Đƣờng lây và dịch tễ học bệnh Ho gà Bệnh l y truyền qua đƣờng hô hấp, bởi các cơn ho từ bệnh nh n và sự tiếp xúc thƣờng xuyên của ngƣời mang mầm bệnh với các cá thể chƣa c miễn dịch Trong quá trình g y bệnh, vi khuẩn bám và định vị vào phần trên của đƣờng hô hấp nhờ các diềm tua nhanh ch ng nh n lên trên bề mặt tế bào biểu mô hô hấp hông x m nhập qua niêm m c mô hay vào máu [3] Trong suốt thập kỷ 60 - 80 của thế kỷ trƣớc hàng n m trên thế giới số ngƣời mắc ho gà hoảng 20 - 40 triệu ngƣời, 90% xảy ra ở các nƣớc đang phát triển và số ngƣời chết hàng n m vì ho gà hoảng 200 000 đến 300.000 ngƣời. Tỷ lệ mắc bệnh đã giảm rõ rệt trong các thập kỷ qua chủ yếu nhờ chƣơng trình TCMR. T i các nƣớc phát triển, tỷ lệ mắc ho gà ở trẻ từ 0,2 – 1% trƣớc hi áp dụng TCMR, sau 20 n m tỷ lệ này đã giảm xuống 0,01% [8]. T i Việt Nam, trong những n m 70 của thế kỷ trƣớc, số mắc trung bình hàng n m dao động từ 70 000 đến 100 000 trƣờng hợp Sau hi đẩy m nh việc TCMR trong đ c việc tiêm phòng vắc xin DPT, từ 1987 đến nay bệnh ho gà hông còn là gánh nặng đối với các hoa l y của bệnh viện từ tuyến huyện đến tuyến trung ƣơng Kết quả giám sát bệnh cho thấy từ n m 1979 – 1988, thời kỳ triển hai TCMR còn thấp, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng n m là 65 1/100 000 d n tỷ lệ chết 0 05/1 000 000 d n Từ n m 1989 đến nay, tỷ lệ TCMR t ng cao nên tỷ lệ mắc trung bình hàng n m trong thời kỳ này là 5 1/100 000 d n giảm 12,8 lần (92 2%) Đồng thời tỷ lệ chết giảm 5 lần (80%) Đặc biệt từ n m 1995 đến nay bệnh đã đƣợc khống chế, tỷ lệ mắc chỉ dƣới 3/100 000 d n Trẻ sơ sinh chiếm 80 - 90% số ngƣời mắc bệnh [9].
12 Hình 1.3. Ho gà và mức độ bao phủ tiêm vắc xin DPT3, Việt Nam, 1981-2005 [10] Hình 1.4. Bản đồ tỷ lệ tiêm vắc xin ho gà ở trẻ n m 2019 [11] 1.2. VẮC XIN HO GÀ 1.2.1. Miễn dịch bảo vệ đối với ho gà Miễn dịch bảo vệ thu đƣợc sau khi khỏi bệnh hoặc sau tiêm vắc xin ho gà Kháng thể đƣợc coi là một phần quan trọng trong miễn dịch bảo vệ chống l i Bordetella Pertussis Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, sự opsonin h a và cố định bổ thể đ ng vai trò quan trọng ngoài cơ chế trung hòa độc tố và ức chế sự bám của vi khuẩn bằng háng thể IgG. Tuy nhiên nhiễm trùng Bordetella Pertussis đã đƣợc chứng minh c 1 pha nhiễm trùng nội bào vì vậy