Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm đối kháng trên tuyến trùng Meloidogyne spp gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:113

Thêm vào BST

Báo xấu

214
lượt xem 77
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài: phân lập và tuyển chọn một số dòng vi nấm bản địa có khả năng ký sinh trên tuyến trùng Meloidogyne spp gây hại trên cây hồ tiêu tại địa bàn tỉnh Đăk Nông, xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến tính ký sinh tuyến trùng của vi nấm đối kháng,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm đối kháng trên tuyến trùng Meloidogyne spp gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN ----------------- HOÀNG NGỌC DUYÊN “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI NẤM ĐỐI KHÁNG TRÊN TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HẠI CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK NÔNG” MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM Buôn Ma Thuột, năm 2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN ----------------- HOÀNG NGỌC DUYÊN “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI NẤM ĐỐI KHÁNG TRÊN TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HẠI CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK NÔNG” LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VĂN NAM Buôn Ma Thuột, năm 2010
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Hoàng Ngọc Duyên
ii LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ sự biết ơn với Tiến sĩ Nguyễn Văn Nam, người Thầy ñã tận tình truyền ñạt kiến thức, theo dõi, dìu dắt, hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành ñề tài này. Tôi vô cùng biết ơn ThS. Nguyễn Quang Tuấn, Chi cục trưởng chi cục BVTV tỉnh Đăk Nông ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong thời gian thực hiện ñề tài. Tôi xin dành sự kính trọng và tình cảm sâu sắc của mình ñến các thầy cô bộ môn sinh học, bộ môn Bảo vệ thực vật, các thầy cô khoa khoa học tự nhiên, khoa Nông lâm nghiệp, trường Đại học Tây Nguyên ñã hết lòng truyền ñạt kiến thức, kinh nghiệm, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài. Xin ñược cảm ơn Ban lãnh ñạo Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Đăk Nông, các ñồng chí ñồng nghiệp trong cơ quan ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, hỗ trợ cho tôi ñược học tập và hoàn thành luận văn này. Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn lớp Cao học SHTN K2 khóa II, các em sinh viên ñang thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn BVTV ñã luôn ñộng viên, tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho người cha kính yêu, ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn. Xin dành tặng gia ñình, những người bạn, ñồng nghiệp và những người thân yêu của tôi những tình cảm chân thành nhất. Buôn Ma Thuột, ngày 18 tháng 09 năm 2010 Học viên Hoàng Ngọc Duyên
iii MỤC LỤC Nội dung Trang Trang phụ bìa Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vẽ, ñồ thị vii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn ñề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2 3.1. Ý nghĩa khoa học 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng 3 4. Giới hạn của ñề tài 3 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về cây hồ tiêu 4 1.1.1. Nguồn gốc cây tiêu 4 1.1.2. Công dụng của cây tiêu 4 1.1.3. Đặc ñiểm hình thái của cây tiêu 5 1.2. Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật. 7 1.3. Đặc ñiểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. 9 1.3.1. Đặc ñiểm sinh học 10 1.3.2. Các yếu tố sinh thái, môi trường ảnh hưởng ñến mật ñộ tuyến trùng 11 1.3.3. Tập quán sinh sống và gây hại 12 1.3.4. Quá trình phát triển của bệnh 13 1.3.5. Các yếu tố lan truyền tuyến trùng ở hồ tiêu 14 1.3.6. Các loài Meloidogyne spp. gây hại quan trọng 15 1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tuyến trùng Meloidogyne spp. 15 1.4.1. Các nghiên cứu về tuyến trùng Meloidogyne spp. trên thế giới 15 1.4.2. Các nghiên cứu về tuyến trùng Meloidogyne spp. tại Việt Nam 19 1.5. Một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. 21 1.5.1. Biện pháp chọn giống 22 1.5.2. Biện pháp canh tác 22 1.5.3. Biện pháp hóa học 24 1.5.4. Biện pháp phòng trừ tổng hợp 25 1.5.5. Biện pháp sinh học 26 1.6. Vi sinh vật ñối kháng và ký sinh tuyến trùng gây hại cây trồng 26 Chương II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu 31 2.2. Nội dung nghiên cứu 31 2.3. Thời gian và ñịa ñiểm thực hiện 31 2.4. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 32 2.4.1. Vật liệu 32 2.4.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 32
iv 2.4.3. Các công thức môi trường 33 2.5. Phương pháp nghiên cứu 35 2.5.1. Phương pháp thu mẫu 35 2.5.2. Phương pháp xử lý mẫu 36 2.5.3. Phương pháp ly trích tuyến trùng 36 2.5.4. Nhân nuôi tuyến trùng Meloidogyne spp. trong phòng thí nghiệm 37 2.5.5. Phân lập nấm và giữ mẫu nấm 37 2.5.6. Xác ñịnh khả năng ñối kháng của các loài nấm phân lập ñược lên tuyến trùng Meloidogyne spp. trong ñiều kiện invitro 38 2.5.7. Phương pháp nhân nuôi các chủng nấm ñược tuyển chọn 39 2.5.8. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng ký sinh của nấm 40 2.6. Thử nghiệm tính ñối kháng của một số chủng nấm có tính ñối kháng cao trong ñiều kiện nhà lưới 41 2.7. Phương pháp xác ñịnh số lượng bào tử 43 2.8. Phương pháp xử lý số liệu 44 Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45 3.1. Phân lập, làm thuần và lưu giữ các chủng nấm bản ñịa ở các ñịa ñiểm nghiên cứu 45 3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng KS tuyến trùng 47 3.2.1. Sàng lọc khả năng ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm 47 3.2.2. Hình thức ký sinh trứng tuyến trùng của các chủng nấm trong ñiều kiện nghiên cứu 50 3.2.3. Khả năng ký sinh của các chủng nấm tuyển chọn 50 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng KS của nấm lên tuyến trùng Meloidogyne spp. 52 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến khả năng KS của nấm 52 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng ký sinh của nấm 55 3.3.3. Ảnh hưởng của pH ñến khả năng ký sinh của nấm 56 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng ñến khả năng KS của nấm 57 3.3.5. Một số yếu tố sinh học của nấm liên quan ñến khả năng ký sinh của nấm 57 3.4. Đặc ñiểm hình thái và phân loại của các chủng nấm tuyển chọn 59 3.4.1. Đặc ñiểm hình thái 59 3.4.2. Vị trí phân loại của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 61 3.5. Nhân nuôi các dòng nấm tuyển chọn 64 3.5.1. Môi trường nhân nuôi cấp 1 64 3.5.2. Môi trường nhân nuôi cấp 2 65 3.6. Khảo sát khả năng ký sinh của các chủng nấm lên tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây tiêu trong ñiều kiện nhà lưới 67 3.6.1. Diễn biến chỉ tiêu sinh trưởng của cây tiêu ở các CT thí nghiệm 67 3.6.2. Sự biến ñộng mật ñộ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong ñất và trong rễ tiêu thí nghiệm theo thời gian 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 Kết luận 75 Kiến nghị 76 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật CBM: Chitin Broth Medium CT: Công thức IJ1: Infective Juvenile 1 (Ấu trùng tuổi 1) IJ2: Infective Juvenile 2 (Ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm) M.: Meloidogyne MA: Maize Agar MM: Minimum Mineral MT: Môi trường KDTV: Kiểm dịch thực vật KHVQH: Kính hiển vi quang học KD: Kinh doanh KS: Ký sinh KT: Kích thước KTCB: Kiến thiết cơ bản SXL: Sau xử lý PGA: Potato Glucose Agar PL: Phụ lục PTSH: Phòng trừ sinh học PRBA: Peptone Rose Bengal Agar T.: Trichoderma TCA: Trichloroacetic WA: Water Agar
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 3.1. Số lượng các chủng vi nấm phân lập ñược tại các ñịa ñiểm nghiên cứu…………………………………………………………………… 45 Bảng 3.2. Mật ñộ vi nấm phân lập từ ñất tại các ñịa ñiểm nghiên cứu………… 45 Bảng 3.3. Thành phần vi nấm phân lập ñược từ các mẫu ñất, mẫu rễ của bốn ñịa ñiểm nghiên cứu…………………………………………………. 47 Bảng 3.4. Khả năng ký sinh trứng tuyến trùng của các chủng nấm……………. 48 Bảng 3.5: Tỷ lệ ký sinh của 04 chủng nấm có hoạt tính ký sinh cao trên tuyến trùng Meloidogyne spp………………………………………………. 51 Bảng 3.6. Đặc ñiểm khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy và tỷ lệ ký sinh của nấm trên các môi trường khác nhau………………………………………. 54 Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm ở các nhiệt ñộ khác nhau………… 55 Bảng 3.8. Tỷ lệ ký sinh trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. ở các mức pH khác nhau……………………………………………………………. 56 Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 ở các thời gian chiếu sáng khác nhau…………………………………………... 57 Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme Chitinase của 04 chủng nấm C07, C22, DY16, T7 sau 12 ngày………………………………………………………….. 58 Bảng 3.11. Hoạt tính protease, chitinase và tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16, T7………………………………………………… 59 Bảng 3.12. Đặc ñiểm hình thái của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy………...................................... 59 Bảng 3.13. Khả năng sinh bào tử của 04 chủng C07, C22, DY16 và T7 trên môi trường PGA…………………...……………………………………... 65 Bảng 3.14. Số lượng bào tử thu ñược của 04 chủng C07, C22, DY16 và T7 ở 02 tỷ lệ cơ chất khác nhau trên môi trường nhân nuôi…………………. 66 Bảng 3.15. Số lượng tuyến trùng/100g ñất, trứng/5g rễ và tỷ lệ nốt sần trên bộ rễ tiêu sau khi chủng nấm và xử lý tuyến trùng ở kỳ ñiều tra tuần 8... 72
vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang Hình 3.1. Tỷ lệ (%) mật ñộ vi nấm phân lập ñược tại các ñịa ñiểm nghiên cứu 46 Hình 3.2. Tỷ lệ các giống nấm chính xuất hiện tại mẫu ñất và mẫu rễ tại các ñịa ñiểm nghiên cứu………………………………………………... 46 Hình 3.3. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm sàng lọc......................................... 49 Hình 3.4. Tỷ lệ ký sinh sau 3 ngày của các chủng nấm..................................... 49 Hình 3.5. Khả năng ký sinh của các chủng nấm lên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp…………………………………………………… 50 Hình 3.6. Tỷ lệ ký sinh của 04 chủng nấm có hoạt tính ký sinh cao trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp………………………………………. 51 Hình 3.7. Khả năng ký sinh của các chủng nấm ñược tuyển chọn lên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp………………………………………. 52 Hình 3.8. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 ở các môi trường nuôi cấy khác nhau…………………………………………. 53 Hình 3.9. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 ở các mức nhiệt ñộ khác nhau……………………………………………. 55 Hình 3.10. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm ở các mức pH khác nhau……….. 56 Hình 3.11. Hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nấm C07, C22, DY16, T7 sau 12 ngày……………………………………........................... 58 Hình 3.12. Khuẩn lạc chủng C07 (A); C22 (B); DY16 (C) và T7 (D)………… 60 Hình 3.13. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm C07…………………………… 62 Hình 3.14. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm C22…………………………… 62 Hình 3.15. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm DY16…………………………. 63 Hình 3.16. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm T7…………………………….. 64 Hình 3.17. Khả năng sinh bào tử của chủng C07, C22, DY16 và T7 trên môi trường PGA………………………………………………………… 65 Hình 3.18. Số lượng bào tử thu ñược của 04 chủng C07, C22, DY16 và T7 ở 02 tỷ lệ cơ chất khác nhau trên môi trường nhân nuôi……………... 66 Hình 3.19. Diễn biến chiều cao cây tiêu ở các công thức thí nghiệm qua các1 thời ñiển nghiên cứu………………………………………………... 68
viii Hình 3.20. Diễn biến số lá/cây tiêu ở cácc công thức thí nghiệm qua các thời ñiểm nghiên cứu……………………………………………………. 68 Hình 3.21. Cây tiêu sau 06 tuần chủng tuyến trùng và xử lý nấm……………... 69 Hình 3.22. Diễn biến chiều dài/bộ rễ qua các thời ñiểm nghiên cứu…...……… 69 Hình 3.23. Bộ rễ tiêu sau khi chủng tuyến trùng và xử lý nấm sau 6 tuần…….. 70 Hình 3.24. Diễn biến trọng lượng tươi và trọng lượng khô/cây……….............. 70 Hình 3.25. Diễn biến trọng lượng tươi và trọng lượng khô/bộ rễ……………… 71 Hình 3.26. Số lượng tuyến trùng Meloidogyne spp. trong 100g ñất, trứng tuyến trùng trong 5g rễ qua các kỳ ñiều tra………………………… 72
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn ñề Cây hồ tiêu có nguồn gốc từ Ấn ñộ, ñược gây trồng cách ñây khoảng 6.000 năm. Hồ tiêu ñã trở thành một loại gia vị phổ biến rất quan trọng, chiếm 34% tỷ lệ giao dịch trong thị trường gia vị. Nhu cầu sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm ngày càng tăng, các sản phẩm thực phẩm có thành phần hồ tiêu ngày càng ña dạng và nhiều chủng loại như: trong sản xuất mì ăn liền, trong bột nêm, trong các loại nhân bánh và có trong cả kẹo,... Tại một số nước người ta sử dụng hồ tiêu trong dược phẩm và hóa mỹ phẩm. Việt Nam hiện nay là một trong những nước ñứng ñầu về xuất khẩu hồ tiêu trên thể giới. Diện tích hồ tiêu Việt Nam hiện nay khoảng 55.000 ha (2008), với sản lượng xuất khẩu hàng năm chiếm 50% tổng sản lượng xuất khẩu tiêu toàn cầu, khẳng ñịnh vị trí số 1 trên thị trường quốc tế. Vì vậy, cây hồ tiêu là một trong những cây trồng mang lại nguồn thu nhập quan trọng cho nhiều ñịa phương trong cả nước. Từ năm 1995 trở lại ñây, cây hồ tiêu ñược phát triển với quy mô và tốc ñộ khá lớn tại các tỉnh Đăk Lăk, Đăk Nông, Gia Lai, Bình Phước, Quảng Trị, Đồng Nai,… Chỉ tính riêng hai tỉnh Đăk Lăk và Đăk Nông thì từ năm 1995 ñến nay, diện tích hồ tiêu mới phát triển lên tới gần 10.000 ha. Tuy nhiên trong năm 2005, 2006 và ñầu năm 2007, dịch hại trên cây hồ tiêu phát sinh và gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng sản xuất hồ tiêu tập trung. Riêng tại Đăk Nông, bệnh hại rễ do nấm và tuyến trùng làm chết 969 ha tiêu trong năm 2005. Một trong những ñối tượng gây hại quan trọng trên cây tiêu hiện nay là tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) Meloidogyne spp. Đây ñược coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong ngành nông nghiệp. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp thế giới và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng khí hậu khác nhau. Hiện nay khoảng 80 loài ký sinh thuộc giống này,
2 trong ñó có 4 loài ký sinh gây hại phổ biến là M.incognita, M.arenaria, M.javanica và M.hapla [18]. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng một số loại thuốc ñặc hiệu như Furadan, Marshal, Oncol, Nokap, Vimoca,… Hiệu quả có làm giảm mật số tuyến trùng, nhưng vườn cây vẫn bị bệnh và phải áp dụng thuốc cho các năm tiếp theo. Việc sử dụng thuốc chưa mang lại hiệu quả cao và sẽ dẫn ñến hiện tượng kháng thuốc, mất cân bằng hệ sinh vật và vi sinh vật ñất, dễ dẫn ñến hiện tượng bộc phát các dịch bệnh khác và ñặc biệt là ảnh hưởng môi trường và tồn dư thuốc trong nông sản. Trong khi ñó, việc áp dụng các kỹ thuật tiến bộ về công nghệ sinh học cũng như công nghệ vi sinh trong trồng trọt hiện nay vẫn còn nhiều hạn chế, nông dân chưa có thói quen sử dụng các sản phẩm sinh học. Đứng trước tình hình ñó, việc nghiên cứu và chọn lọc vi sinh vật bản ñịa có tính ký sinh, ñối kháng cao trên tuyến trùng hại tiêu là vấn ñề ñáng quan tâm, nhằm giảm thiệt hại và nâng cao năng suất, sản lượng, chất lượng sản phẩm. Một trong những biện pháp hiệu quả góp phần ñảm bảo an toàn cho con người và không gây ô nhiễm môi trường là dùng biện pháp sinh học ñể phòng trừ. Do vậy mà chúng tôi thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm ñối kháng trên tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi nấm bản ñịa có khả năng ký sinh trên tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây hồ tiêu tại ñịa bàn tỉnh Đăk Nông. - Xác ñịnh một số yếu tố ảnh hưởng ñến tính ký sinh tuyến trùng của vi nấm ñối kháng. - Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. của các dòng nấm tuyển chọn trên cây tiêu trong ñiều kiện nhà lưới. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học
3 - Chủ ñộng sử dụng và bảo tồn nguồn tài nguyên vi sinh vật phong phú, ña dạng tại ñịa phương. - Bộ giống vi nấm ñược phân lập từ tự nhiên có thể dùng ñể tạo nguồn giống ban ñầu cho các công trình nghiên cứu tìm hiểu cơ chế tác ñộng ñối kháng của các loài vi nấm ñối kháng tuyến trùng; góp phần làm sáng tỏ cơ sở khoa học về mối quan hệ giữa vi nấm ñối kháng với tuyến trùng gây bệnh hại cây trồng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng - Góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của nguồn tài nguyên vi sinh vật bản ñịa vốn rất phong phú, ña dạng. - Sử dụng các chủng vi nấm ñối kháng như là một tác nhân sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng tại ñịa phương. Đồng thời sử dụng các chủng này trong việc sản xuất phân bón sinh học thế hệ mới, vừa có tác dụng phòng ngừa tác nhân gây bệnh, vừa ñẩy mạnh các quá trình phân hủy tàn dư thực vật trong ñất, tạo sự cân bằng sinh thái và bảo vệ môi trường. 4. Giới hạn của ñề tài Trong quá trình thực hiện, do thời gian, trang thiết bị, hóa chất có hạn nên chúng tôi chỉ tiến hành phân lập, thử tính ký sinh của một số chủng nấm phân lập ñược tại một số vùng trồng tiêu trọng ñiểm tại Đăk Nông. Đồng thời, tất cả nghiên cứu chỉ ñược thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa ñược ñưa vào thử nghiệm phòng trừ cây tiêu trên ñồng ruộng nên chưa ñánh giá ñược khả năng thực nghiệm phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. của các loài nấm phân lập ñược.
4 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây hồ tiêu 1.1.1. Nguồn gốc cây tiêu Tiêu có nguồn gốc ở vùng Ghats miền Tây Ấn Độ, ở ñây có nhiều giống tiêu hoang dại, mọc rất lâu ñời. Sau ñó, tiêu ñược người Hindu mang tới Java (Indonesia) vào khoảng 600 năm sau công nguyên. Cuối thế kỷ 12, tiêu ñược trồng ở Mã Lai. Đến thế kỷ 18, tiêu ñược trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào ñầu thế kỷ 20 thì tiêu ñược trồng nhiều ở các nước nhiệt ñới như Châu Phi với Mandagasca, Nigieria, Congo và Châu Mỹ với Brazil, Mexico,… Tiêu du nhập vào Đông Dương từ thế kỷ 17 nhưng mãi ñến thế kỷ 18 mới bắt ñầu phát triển mạnh khi một số người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở vùng dọc bờ biển vịnh Thái Lan như Konpong, Trach, Kep, Kampot và tiêu vào Đồng bằng Sông Cửu Long qua ngõ Hà Tiên của tỉnh Kiên Giang, rồi sau ñó lan dần ñến các tỉnh khác ở miền Trung – Tây Nguyên như Thừa Thiên – Huế, Quảng Trị, Đăk Lăk, Gia Lai, Đăk Nông,… 1.1.2. Công dụng của cây tiêu Tiêu là loại cây trồng có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao. Tiêu ñược sử dụng làm gia vị, trong y dược, trong công nghiệp hương liệu và làm chất trừ côn trùng. - Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp cho việc chế biến các món ăn. Vì vậy mà tiêu ñã trở thành gia vị ñược dùng rất phổ biến trên thế giới. - Trong y dược: Do có sự hiện diện của chất piperin, tinh dầu và nhựa có mùi thơm, cay, nóng ñặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng. Ngoài ra, tiêu còn có tác dụng làm cho ấm bụng, thường dùng chung với gừng ñể chữa chứng tiêu chảy, ói mửa khi ăn nhằm món ăn lạ, dùng chung với hành lá trong tô cháo giải cảm… Tuy nhiên, khi dùng quá nhiều, tiêu
5 có thể gây táo bón, kích thích niêm mạc dạ dày, gây sốt, viêm ñường tiểu và có khi gây tiểu ra máu. - Trong công nghiệp hương liệu: Chất piperin trong hạt tiêu ñược thủy phân thành piperidin và acid piperic. Oxy hóa acid piperic bằng permanganate kali (KMnO4), thu ñược piperonal (heliotropin nhân tạo) có mùi hương tương tự như heliotropin và coumarin, dùng ñể thay thế các hương liệu này trong kỹ nghệ làm nước hoa. Tinh dầu tiêu với mùi thơm ñặc biệt ñược sử dụng trong công nghiệp hương liệu và hóa dược. - Trừ côn trùng: Trước kia, người ta dùng dung dịch chiết xuất từ hạt tiêu xay tẩm vào da trong khi thuộc ñể ngừa côn trùng phá hoại, nhưng từ khi xuất hiện các loại thuốc hóa học công dụng và rẻ tiền hơn thì tiêu không còn ñược sử dụng trong lĩnh vực này nữa. 1.1.3. Đặc ñiểm hình thái của cây tiêu * Hệ thống rễ: Thường gồm từ 3 – 6 rễ cái và một chùm rễ phụ ở dưới mặt ñất, trên ñốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). - Rễ cọc: Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới có rễ cọc. Rễ này ñâm sâu xuống ñất ñến ñộ sâu 2,5 m, làm nhiệm vụ chính là hút nước. - Rễ cái: Các rễ này cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. Đối với cây tiêu trồng bằng giâm cành, sau khi trồng ra ngoài nọc ñược 1 năm, các rễ cái này có thể ăn sâu ñến 2 m. - Rễ phụ: Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày ñặc, phân bố nhiều nhất ở ñộ sâu 15 – 40 cm, làm nhiệm vụ hút nước và hút chất dinh dưỡng trong ñất ñể nuôi cây. Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu ñược ngập úng, do ñó ñể tạo cho rễ cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút ñược nhiều chất dinh dưỡng thì phải thường xuyên có biện pháp cải tạo làm cho ñất ñược tơi xốp, tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần úng nước từ 12- 24 giờ thì bộ rễ cây tiêu ñã bị tổn thương ñáng kể và có thể dẫn tới việc hư thối và dây tiêu có thể bị chết dần.
6 - Rễ bám: Mọc ra từ các ñốt trên thân ở trên không, làm nhiệm vụ chính là giúp cây tiêu bám vào choái, vách tường… ñể vươn lên cao. Khả năng hút nước và hút chất dinh dưỡng của rễ bám rất hạn chế, gần như không ñáng kể. * Thân, cành, lá: Tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo ñược phân thành nhiều ñốt, tại mỗi ñốt có một lá ñơn, hình trái tim, mọc cách. Ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát sinh thành các cành tược, cành lươn, cành ác (cành cho trái) tùy theo từng giai ñoạn phát triển của cây tiêu. - Cành tược (cành vượt): Thường phát sinh từ mầm nách trên các cây tiêu nhỏ hơn 1 tuổi. Đối với cây trưởng thành, cành tược phát sinh từ các mầm nách trên khung cành thân chính phía dưới thấp của trụ tiêu, và thường là cành cấp 1. Đặc ñiểm của cành tược là góc ñộ phân cành nhỏ, dưới 450, cành mọc tương ñối thẳng. Cành tược có sức sinh trưởng mạnh, khỏe, thường ñược dùng ñể giâm cành nhân giống. - Cành lươn: Cành phát sinh từ mầm nách gần sát gốc của bộ khung thân chính của cây tiêu trưởng thành. Đặc trưng của cành lươn là có dạng bò sát ñất và các lóng rất dài. Cành lươn cũng ñược dùng ñể nhân giống, tuy vậy, tỷ lệ sống thấp và cây thường ra hoa trái chậm hơn so với cành tược nhưng tuổi thọ lại dài và năng suất cao. - Cành cho trái (còn gọi là cành ác hay cành ngang): Đó là cành mang trái, thường phát sinh từ mầm nách trên cây tiêu lớn hơn 1 năm tuổi. Đặc trưng của cành ác là góc ñộ phân cành lớn, mọc ngang, ñộ dài của cành thường ngắn hơn 1 m, cành khúc khuỷu và lóng rất ngắn, cành cho trái trên bộ khung cây tiêu ña số là cành cấp 2 trở lên. Cành cho trái nếu ñem giâm cành cũng ra rễ, cho trái rất sớm. Tuy vậy, cây phát triển chậm, không leo mà mọc thành bụi vì lóng ñốt không có rễ bám hoặc rất ít. Cây mau cỗi và năng suất thường thấp. * Hoa, quả: Cây tiêu ra hoa dưới dạng hoa tự hình gié, treo lủng lẳng, dài 7 – 12 cm tùy giống tiêu và tùy ñiều kiện chăm sóc. Trên gié hoa có bình quân 20 – 60 hoa xếp thành hình xoắn ốc, hoa tiêu lưỡng tính hay ñơn tính.
7 Trái tiêu thuộc loại trái hạch, không có cuống, mang 1 hạt hình cầu. Từ khi hoa xuất hiện ñầy ñủ cho ñến khi trái chín kéo dài từ 7 – 10 tháng chia làm các giai ñoạn sau: - Hoa tự xuất hiện ñầy ñủ ñến khi hoa nở thụ phấn: 1 – 1,5 tháng. - Thụ phấn, phát triển trái (4 – 5,5 tháng): giai ñoạn này tiêu lớn nhanh về kích thước và ñạt ñộ lớn tối ña của trái, ñây là giai ñoạn tiêu cần nước và dinh dưỡng nhất. - Trái chín (2 – 3 tháng): Trong giai ñoạn này hạt bắt ñầu phát triển, ñạt ñường kính tối ña. Trái tiêu thường chín tập trung vào các tháng 1 – 2 trong năm, ñôi khi kéo dài ñến các tháng 4 – 5 do các lứa hoa ra trễ và cũng tùy theo giống. 1.2. Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật là nhóm ñộng vật không xương sống có ñặc ñiểm sinh thái thích nghi với ñời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số ñặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở ñộng vật và các nhóm sinh thái khác như: có kích thước hiển vi; phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa ñể châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng; kích thước của trứng lớn so với kích thước cơ thể; ñời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật ñang phát triển. Trong ñó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất. Về mặt phân loại học, tuyến trùng ký sinh thực vật gồm 4 nhóm liên quan ñến 4 bộ tuyến trùng là: Bộ Tylenchida (chỉ trừ một số loài tuyến trùng họ Tylenchidae); Bộ Aphelenchida; Các loài tuyến trùng họ Longidoridae của bộ Dorylaimida; Các loài tuyến trùng họ Trichodoridae thuộc bộ Triplonchida. Trong các nhóm ký sinh trên thì nhóm loài thuộc bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng ký sinh ñông ñảo nhất và có tầm quan trọng nhất ñối với sản xuất nông nghiệp. Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật ñang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong ñó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất.
8 Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của thực vật, một số khác thâm nhập vào các mô sâu hơn, và một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng ñặc biệt tại nơi chúng ký sinh. Tác hại do tuyến trùng gây ra ñối với thực vật thường là tương ñối nhẹ, tuy nhiên khi mật ñộ lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật. Ngoài ra, một vài tuyến trùng có thể làm giảm khả năng của thực vật kháng lại sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác và làm cho tác hại ñối với thực vật càng trầm trọng thêm. Một số tuyến trùng ký sinh chuyển hóa có khả năng mang truyền virus gây bệnh cho thực vật. Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5% sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh ñối với cây trồng nông nghiệp ước tính là hàng trăm tỷ ñô la Mỹ mỗi năm. Về hình thức kí sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể phân thành 3 nhóm ký sinh như sau: - Ngoại ký sinh: tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong mô thực vật mà bám bên ngoài bề mặt rễ, dinh dưỡng của tuyến trùng bằng việc sử dụng kim chích châm chích và hút chất dinh dưỡng trong tế bào thực vật. - Bán nội ký sinh: chỉ phần ñầu của tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài ñất. - Nội ký sinh: toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nhóm này ñược chia 2 nhóm nhỏ: Nội ký sinh di chuyển: tuyến trùng vẫn giữ khả năng di chuyển trong mô thực vật và chúng chuyển ñộng từ mô này ñến mô khác ñể dinh dưỡng. Nội ký sinh cố ñịnh: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng tại một nơi cố ñịnh (tạo nên các tế bào dinh dưỡng), chúng mất khả năng di chuyển và trở nên phình to ra (béo phì). Các kiểu ký sinh trên ñây không loại trừ lẫn nhau vì một số giống tuyến trùng có thể là bán nội ký sinh hoặc ngoại ký sinh di chuyển phụ thuộc vào vật chủ. Ở tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne spp.) và tuyến trùng bào nang
9 (Heterodera /Globora), ấu trùng tuổi 2 là giai ñoạn xâm nhập vào rễ. Nhưng ở các tuyến trùng ngoại ký sinh và hầu hết nội ký sinh di chuyển thì hầu như tất cả các giai ñoạn ñều có thể dinh dưỡng và xâm nhập vào rễ. Ở một số tuyến trùng (như ở Rotylenchus), con cái trước trưởng thành là giai ñoạn xâm nhập, còn ấu trùng và con ñực vẫn ở trong ñất và không dinh dưỡng. Tóm lại, do nhận thức về tuyến trùng thực vật ngày càng phát triển, ñặc biệt ñể ñáp ứng cho một nền nông nghiệp bền vững với trình ñộ sản xuất cao trong sự hiện diện của tuyến trùng ký sinh, cần phải nghiên cứu mọi khía cạnh của mối quan hệ qua lại giữa tuyến trùng thực vật và thực vật trên cơ sở sử dụng kiến thức tích lũy ñược của nhiều ngành sinh học và các lĩnh vực liên quan nhằm tìm hiểu, nghiên cứu các biện pháp quản lý, phòng trừ ñối tượng này một cách có hiệu quả (Vũ Triệu Mân, 2007) [18]. 1.3. Đặc ñiểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. Tuyến trùng sần rễ (root-knot nematodes) ñược coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất, chúng gây hại trên hơn 3.000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao gồm hầu hết các cây trồng quan trọng như rau màu, ñậu ñỗ, ngũ cốc, cây hòa thảo, cây bụi và cây ăn quả, thảo mộc và nhiều loài cây cảnh thân gỗ (Malcolm & Charles, 2000) [52]. Tuyến trùng gây giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Hiện nay ñã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong ñó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla. Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới. Ngoài ra, một số loài khác mặc dù cũng gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1 - 2 cây trồng và phân bố hẹp. Tuyến trùng Meloidogyne spp. (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là loài tuyến trùng nội ký sinh rễ thuộc: - Giống Meloidogyne - Họ Meloidogynidae - Bộ Tylenchida
10 1.3.1. Đặc ñiểm sinh học Trứng của tuyến trùng sần rễ ñược con cái ñẻ ra ngoài trong một bọc gelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng có thể nằm bên trong nốt sần. Sau quá trình phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 ngay bên trong trứng. Lần lột xác thứ nhất xảy ra trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2. Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm IJ2 mà không cần có sự kích thích của rễ thực vật. Khi chuẩn bị xâm nhập vào rễ, IJ2 tập trung dọc theo các tế bào non ngay tại phía sau vùng ñỉnh rễ. IJ2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở ñỉnh rễ, nơi các rễ bên mọc ra tạo nên ñiểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi IJ2 tiếp xúc với bề mặt rễ, chúng thường dùng kim hút châm chích và xâm nhập ngay vào trong rễ. Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ. Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau ñó tuyến trùng ñịnh vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt ñầu quá trình dinh dưỡng. Khi dinh dưỡng, tuyến trùng cắm phần ñầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay ñổi và hình thành các ñiểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5 - 6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) ñược tạo thành trong vùng nhu mô hoặc vùng mô libe, nơi ñầu tuyến trùng. Đây là sự thích nghi chuyển hóa cao của tế bào, chúng ñược tạo ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ (gall hoặc root-knot). Sần rễ thường ñược tạo thành trong vòng 1 - 2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập. Kích thước của nốt sần liên quan ñến cây chủ, số lượng IJ2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh. Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt ñầu một cách nhanh chóng quá trình thay ñổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra và các nội quan cũng dần ñược phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và ñạt ñến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là