Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập vi khuẩn nitrate hóa thu tại vùng biển đảo Hải Phòng - Quảng Ninh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn tiến hành thu thập các mẫu nghiên cứu và xác định các yếu tố môi trường tại vùng biển đảo Hải Phòng và Quảng Ninh; phân lập, xác định mật độ và thuần khiết các chủng vi khuẩn nitrate; phân loại và định danh được các chủng vi khuẩn nitrate hóa bằng khóa phân loại Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập vi khuẩn nitrate hóa thu tại vùng biển đảo Hải Phòng - Quảng Ninh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Phonephet KONGMANY PHÂN LẬP VI KHUẨN NITRATE HÓA THU TẠI VÙNG BIỂN ĐẢO HẢI PHÒNG - QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Phonephet KONGMANY PHÂN LẬP VI KHUẨN NITRATE HÓA THU TẠI VÙNG BIỂN ĐẢO HẢI PHÒNG - QUẢNG NINH Ngành: Di truyền học Mã số: 8.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Đỗ Mạnh Hào 2. TS. Hoàng Phú Hiệp THÁI NGUYÊN, NĂM 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng cá nhân tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả Phonephet KONGMANY i
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Mạnh Hào - Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn, Viện Tài Nguyên và Môi Trường Biển, TS. Hoàng Phú Hiệp- Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ cho tôi những kiến thức, những kinh nghiệm, lời khuyên quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình triển khai, thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn cùng các kỹ thuật viên của Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp Cao học K26 và các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên những người đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tinh thần cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Thái Nguyên, ngày 22 tháng 09 năm 2020 Học viên Phonephet KONGMANY ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC............................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vii MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 1.1. Quá trình nitrate hóa trong chu trình nitơ ..................................................... 3 1.2. Nhóm vi khuẩn nitrate hóa ........................................................................... 8 1.2.1. Đặc điểm chung ......................................................................................... 8 1.2.2. Vi khuẩn oxy hóa ammonia ....................................................................... 9 1.2.3. Vi khuẩn oxy hóa nitrite ............................................................................ 9 1.3. Chu trình Nitơ trong đầm nuôi thủy sản và ứng dụng của nhóm vi khuẩn nitrate hóa trong nuôi trồng thủy sản ...................................................... 10 1.3.1 Chu trình Nitơ trong đầm nuôi thủy sản ................................................... 10 1.3.2. Ứng dụng của nhóm vi khuẩn nitrate hóa trong nuôi trồng thủy sản...... 12 1.4. Tình hình nghiên cứu nhóm vi khuẩn nitrate hóa trên thế giới và Việt Nam ....... 14 1.4.1. Tình hình nghiên cứu nước ngoài ............................................................ 14 1.4.2. Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước ............................. 16 Chương 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 20 2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất, địa điểm, thời gian nghiên cứu........................ 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 22 2.2.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu.................................................. 22 iii
2.2.2. Phương pháp phân tích thông số thủy lí .................................................. 23 2.3.3. Phương pháp phân tích thông số thủy hóa .............................................. 23 2.3.4. Phương pháp phân tích, xác định mật độ vi khuẩn tổng số và vi khuẩn nitrate hóa ................................................................................................ 24 2.3.5. Phương pháp phân lập, làm giàu và thuần khiết các chủng vi khuẩn nitrate hóa ................................................................................................ 25 2.3.6. Phương pháp xác định hình thái tế bào, nhuộm Gram tế bào vi khuẩn .. 26 2.3.7. Định danh các chủng vi khuẩn nitrate hóa bằng gen 16S rRNA ............ 27 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 29 3.1. Kết quả quan trắc các yếu tố môi trường khu vực nghiên cứu................... 29 3.1.1. Kết quả các thông số thủy lí .................................................................... 29 3.1.2. Kết quả các thông số thủy hóa................................................................. 30 3.1.3. Kết quả vi sinh vật ................................................................................... 32 3.2. Kết quả phân lập và thuần khiết các chủng vi khuẩn nitrate............................... 33 3.2.1. Nhân giống cấp 1 ..................................................................................... 33 3.2.2. Nhân giống cấp 2 ..................................................................................... 35 3.3. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn nitrate hóa ................................ 36 3.3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa ................................................. 36 3.3.2. Định danh các chủng vi khuẩn nitrate hóa .............................................. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 46 PHỤ LỤC ............................................................................................................... iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Diễn giải 1 AOB Ammonia-oxidizing bacteria 2 BBCs Rotating Biological Contactors 3 BOD Nhu cầu oxy sinh hóa 4 COD Nhu cầu oxy hóa học 5 DO Nhu cầu oxy 6 GHCP Giới hạn cho phép 7 MBR Membrance Bio Reator 8 MBBR Moving Bed Biological Reactor 9 NOB Nitrite-oxidizing bacteria 10 SAF Submerged Aerated Filter 11 SBR Sequencing batch reactor 12 TAN Ammonia tổng số v
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Bảng tọa độ thu mẫu..................................................................... 20 Bảng 2.2. Công thức pha môi trường tự dưỡng Winogradsky – agar .......... 22 Bảng 2.3. Công thức pha môi trường dị dưỡng PCA ................................... 22 Bảng 2.4. Phương pháp phân tích thông số thủy lí ....................................... 23 Bảng 2.5. Phương pháp phân tích các thông số thủy hóa ............................. 23 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR .......................................................... 27 Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR .................................................. 28 Bảng 3.1. Kết quả đo thông số thủy lí tại các khu vực nghiên cứu .............. 29 Bảng 3.2. Kết quả đo thông số thủy hóa tại khu vực nghiên cứu ................. 30 Bảng 3.3. Kết quả đo vi sinh vật tổng số tại khu vực nghiên cứu ................ 32 Bảng 3.4. Kết quả đo vi khuẩn nitrate hóa tại khu vực nghiên cứu ............. 32 Bảng 3.5. Kết quả lượng cơ chất tiêu thụ trong một ngày ở từng thời điểm của các mẫu thu thập tại Quảng Ninh trong thời gian làm giàu ............................................................................................... 34 Bảng 3.6. Kết quả lượng cơ chất tiêu thụ trong một ngày ở từng thời điểm của các mẫu thu thập tại Hải Phòng trong thời gian làm giàu ............ 34 Bảng 3.7. Kết quả lượng cơ chất tiêu thụ trong một ngày ở từng thời điểm của các mẫu có hoạt tính cao trong thời gian làm giàu ....... 36 Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập được tại Hải Phòng, Quảng Ninh............................ 37 Bảng 3.9. Nồng độ cơ chất NH4+ và sản phẩm NO2+ tạo thành của các chủng vi khuẩn nitrate hóa trước và sau nuôi 15 ngày ................ 38 Bảng 3.10. Đặc điểm hình dạng tế bào vi khuẩn, Gram và hình ảnh tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được tại Hải Phòng, Quảng Ninh .............................................................................................. 39 Bảng 3.11. Kết quả so sánh trình tự tương đồng bằng công cụ BLAST ........ 42 Bảng 3.12. Bảng tên định danh của các loài vi khuẩn nitrate hóa phân lập được tại Hải Phòng và Quảng Ninh ............................................. 44 vi
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Chu trình nitơ vi sinh vật trong hệ sinh thái tự nhiên ..................... 3 Hình 1.2. Bốn giống vi khuẩn chủ yếu tham gia vào quá trình nitrite hóa ........ 7 Hình 1.3. Ba giống vi khuẩn chủ yếu tham gia vào quá trình nitrate hóa....... 7 Hình 1.4. Các giai đoạn trong quá trình nitrate hóa ........................................ 9 Hình 1.5. Chu trình Nitơ trong hệ sinh thái ao nuôi thủy sản ....................... 11 Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống nuôi thủy sản hoàn lưu ......................................... 13 Hình 2.1. Sơ đồ địa điểm thu mẫu tại tỉnh Quảng Ninh................................ 21 Hình 2.2. Sơ đồ địa điểm thu mẫu tại thành phố Hải Phòng......................... 21 Hình 3.1. Kết quả PCR các mẫu DNA vi khuẩn nitrate hóa ......................... 42 vii
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Quá trình nitrate hóa sinh học đã được Schoesing và Müntz phát hiện năm 1877, nhưng đến năm 1890, nhà khoa học người Nga Winogradsky mới phân lập được các chủng vi khuẩn này nhờ sử dụng môi trường khoáng vô cơ [19]. Sau đó, nhiều chủng vi khuẩn nitrate hóa đã được phân lập từ các môi trường khác nhau trên khắp thế giới. Cho đến nay, các nhà khoa học đã ghi nhận được khoảng 11 loài thuộc 9 giống khác nhau. Dựa vào đặc tính sử dụng cơ chất, vi khuẩn nitrate hóa được chia thành hai nhóm là nhóm oxy hóa ammonia thành nitrite và nhóm oxy hóa nitrite thành nitrate. Nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia gồm các loài thuộc giống Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus và Nitrosovibrio. Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB) gồm các loài thuộc giống Nitrobacter, Nitrospira, Nitrospina, Candidatus Nitromaritima, hoặc Nitrococcus [13]. Đã có nhiều nghiên cứu phát hiện ra một số nhóm vi khuẩn khác cũng có khả năng nitrate hóa, chúng có khả năng dinh dưỡng tùy nghi (mixotrophy) - tức là có cả khả năng dinh dưỡng tự dưỡng và dị dưỡng đồng thời [23], [28]. Ammonia và nitrite là sản phẩm của quá trình phân hủy các chất thải giàu đạm từ nguồn chất thải sinh hoạt, nhà máy chế biến thức ăn, nuôi trồng thủy sản, ... Hai chất này cũng được sinh ra thông qua bài tiết trực tiếp từ gia súc, gia cầm, vật nuôi. Nếu ammonia và nitrite không được xử lý mà thải trực tiếp vào nguồn nước xung quanh sẽ gây ô nhiễm môi trường. Ammonia và nitrite đều có tính độc đối với động vật thủy sinh. Ammonia ở dạng khí (NH3) có thể gây độc cho động vật thủy sinh tại nồng độ rất thấp đến 0,01 ppm. Sự có mặt của ammonia và nitrite không những gây độc trực tiếp đối với thủy sinh vật mà còn kích thích sự nở hoa của tảo dẫn đến mất cân bằng hệ sinh thái thủy vực. Trong tự nhiên, việc loại bỏ nitrite và ammonia được thực hiện thông qua quá trình nitrate hóa sinh học bởi nhóm vi khuẩn nitrate hóa. Trước tiên, ammonia được oxy hóa thành 1
nitrite (N-NO2) bởi vi khuẩn oxy hóa ammonia, và bước tiếp theo N-NO2 được oxy hóa thành N-NO3 bởi vi khuẩn oxy hóa nitrite. Thông qua quá trình nitrate hóa, các chất ô nhiễm nitơ tích lũy trong quá trình nuôi trồng thủy sản sẽ được loại bỏ. Như vậy, chìa khóa của quá trình xử lý ô nhiễm nitơ sinh học là nhóm vi khuẩn nitrate hóa. Theo nghiên cứu của Alleman và Preston (2005) thì nhóm vi khuẩn nitrate hóa là nhóm vi khuẩn hiếu khí, tự dưỡng bắt buộc [31]. Thông thường, mật độ của nhóm vi khuẩn nitrate hóa có mặt trong môi trường tự nhiên thấp, khoảng 102 – 103 tế bào/ml, trong khi mật độ vi khuẩn tổng số là 10 5 -106 tế bào/ml. Hơn nữa, tốc độ sinh trưởng của nhóm này rất chậm, thời gian thế hệ khoảng 12-32 giờ, nên thường sinh trưởng chậm và kém cạnh tranh so với các nhóm vi sinh vật còn lại. Do vậy, quá trình làm giàu, phân lập vi khuẩn nitrate hóa ra khỏi các nhóm vi khuẩn khác từ môi trường tự nhiên có vai trò quan trọng trong việc tạo bộ sưu tập chủng giống phục vụ xử lý nước ô nhiễm ammonia. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập vi khuẩn nitrate hóa thu tại vùng biển đảo Hải Phòng- Quảng Ninh”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thu thập nguồn gen các chủng vi khuẩn nitrate trong môi trường nước thu tại vùng biển đảo Quảng Ninh - Hải Phòng. 3. Nội dung nghiên cứu - Thu thập các mẫu nghiên cứu và xác định các yếu tố môi trường tại vùng biển đảo Hải Phòng và Quảng Ninh. - Phân lập, xác định mật độ và thuần khiết các chủng vi khuẩn nitrate. - Phân loại và định danh được các chủng vi khuẩn nitrate hóa bằng khóa phân loại Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA. 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Quá trình nitrate hóa trong chu trình nitơ Nitơ là nguyên tố quan trọng cấu thành nên các hợp chất hữu cơ của sự sống như axit nucleic, protein,... vì vậy, chu trình nitơ là một trong những chu trình quan trọng nhất bậc nhất của hệ sinh thái. Nitơ là một nguyên tố rất linh hoạt, tồn tại ở nhiều trạng thái oxy hóa khác nhau, từ trạng thái oxy hóa -3 (ammonium và amino-nitrogen) đến +5 (nitrate) (hình 1.1). Sự chuyển hóa giữa các hợp chất nitơ ở các trạng thái oxy hóa khác nhau trong hệ sinh thái được thực hiện thông qua các phản ứng oxy hóa khử thúc ép bởi nhiệt động học và xúc tác bởi enzyme của vi sinh vật. Trong hầu hết các hệ sinh thái tự nhiên, nhờ có vi sinh vật mà sự tồn tại của nitơ ở các trạng thái oxy hóa khác nhau được cân bằng một cách chủ động để giúp cho hệ sinh thái được duy trì ổn định và có thể ứng được với những thay đổi của môi trường xung quanh. Hình 1.1. Chu trình nitơ vi sinh vật trong hệ sinh thái tự nhiên (A): Chu trình nitơ truyền thống; (B): Chu trình nitơ hiện đại 3
Quá trình amon hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ thành ammonia. Các vi sinh vật có khả năng amon hóa bao gồm nhiều loại sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn xạ khuẩn và nấm khuẩn ty [1]. Các vi sinh vật này có khả năng tiết enzyme phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó chúng dùng các amino acid này trong quá trình đồng hóa và dị hóa. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình này là NH3 và H2S. Vi khuẩn tham gia có thể là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí. Trong điều kiện hiếu khí, hợp chất hữu cơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriace, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong điều kiện kỵ khí là các loài trong giống Clostridium. Trong điều kiện kỵ khí, quá trình amon hóa được thực hiện bởi các vi khuẩn, trực khuẩn kỵ khí tùy nghi [8]. Nitrate hóa là quá trình chuyển đổi từ ammoni (NH4+) thành nitrate (NO3- ) dưới tác dụng của vi sinh vật. Trước hết, ammoni (NH4+) được chuyển hóa thành nitrite (NO2-) bởi vi khuẩn Nitrosomonas, tiếp theo NO2- thành NO3- nhờ các vi khuẩn Nitrobacter, Nitrospinae, Nitrococcus và Nitrospira (Nitrospirae) [15], [22]. Quá trình nitrate hóa bao gồm 2 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Chuyển hóa NH4+ thành NO2ˉ bởi nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia: NH4+ + 1,5O2 → 2H+ + 2H2O + NO2ˉ - Giai đoạn 2: Chuyển hóa NO2ˉ thành NO3ˉ bởi nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite: NO2ˉ + 0,5O2 → NO3ˉ Hai giai đoạn được thực hiện bởi hai giống vi khuẩn có quan hệ mật thiết với nhau và phân bố rộng rãi trong tự nhiên [8]. Vi khuẩn Nitrosomonas là một chi của vi khuẩn Chemoautotrophic, hình que, Gram âm. Sinh vật này oxy hóa 4
ammoniac thành nitrite như một quá trình trao đổi chất. Được gọi là Nitrate hóa (một bước của Nitrate hóa). Vi khuẩn Nitrosomonas rất hữu ích trong xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học. Trong tự nhiên, quá trình nitrate hóa diễn ra gặp rất nhiều ảnh hưởng từ các điều kiện bất thuận của môi trường bên ngoài như nồng độ ammonia, nhiệt độ, pH, nồng độ oxy và các chất độc ức chế quá trình phản ứng [15]. Nồng độ ammonia: khi hàm lượng ammonia vượt quá 10 đến 150 mg/l thì sẽ ức chế quá trình oxy hóa ammonia và vượt quá 0,1 đến 1mg/l thì sẽ ức chế quá trình oxy nitrite. Đối với nồng độ nitrite vượt 0,22 đến 2,8 mg/l sẽ ức chế quá trình oxy hóa nitrite diễn ra để tạo thành nitrate. Nồng độ oxy hòa tan: hệ vi khuẩn nitrate hóa là những nhóm vi khuẩn kị khí bắt buộc, tuy nhiên chúng có thể sống trong thời gian dài ở điều kiện thiếu oxy như trong các lớp bùn hoạt tính của bể xử lí nước thải, tầng đáy của các hồ nước. Quá trình oxy hóa ammonia vẫn diễn ra ở mức độ oxy hòa tan thấp 0,05 mg/l. Và nồng độ oxy hòa tan tối ưu cho hệ vi khuẩn oxy hóa nitrite phát triển tốt là 3 - 4 mg/l O2. Nhiệt độ: nhóm vi khuẩn nitrate hóa là nhóm vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho chúng phát triển là khoảng 25 - 30oC. Quá trình oxy hóa ammonia vẫn diễn ra ở nhiệt độ thấp từ 7 - 35oC và quá trình oxy nitrite thì nhiệt độ diễn ra rộng hơn ở 5 - 42oC. pH: quá trình nitrate hóa diễn ra tạo ra các sản phẩm axit hóa làm giảm pH của môi trường. Do vậy cần bổ sung tính kiềm cho môi trường để duy trì độ pH thích hợp cho vi sinh vật. Vì hầu hết các hệ vi khuẩn nitrate hóa có pH tối ưu dao động trong khoảng 7,5 - 8,0. Tại giá trị pH nhỏ hơn 6 và lớn hơn 10 thì quá trình oxy hóa nitrite sẽ diễn ra chậm và bị ức chế. Nhóm vi khuẩn AOB thích nghi với điều kiện pH trong khoảng 6,7 - 9,2 còn nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite thích nghi trong khoảng pH 8,0 - 9,2. Do đó, cần có một khoảng thời gian để hai nhóm vi khuẩn thích nghi với điều kiện pH của môi trường. 5
Các chất độc: Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp. đều nhạy cảm với một vài hợp chất độc thường gặp trong nước thải. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm của Nitrosmonas sp. thường cao hơn với Nitrobacter sp., các hợp chất này gây ngừng quá trình oxy hoá nitrite vì ức chế các hệ enzyme trên màng của tế bào. Hầu hết các hợp chất diệt khuẩn đều tác động nghiêm trọng đến hoạt động sống của vi khuẩn oxy hoá nitrite (điều này giải thích vì sao các trang trại nuôi trồng thuỷ sản có nguồn nước thải bị ô nhiễm hữu cơ quá cao vì trong quá trình nuôi, người ta đã sử dụng chất diệt khuẩn để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh cho động vật nuôi trồng, đồng thời diệt luôn hệ vi khuẩn có lợi, làm cho khả năng tự làm sạch tự nhiên của ao nuôi bị mất tác dụng). Có thể liệt kê một vài hợp chất gây ức chế vi khuẩn oxy hoá nitrite như sau: nitrapyrin (2-chloro-6-trichloromethylpyridine), allylthiourea (2-propenyl- thiourea), sodium azide (NaN3), DIECA (diethyldithiocarbamate), Acetylen (C2H2), sodium chlorate (NaClO3). Giai đoạn nitrite hóa: chuyển hóa NH4+ thành NO2- bởi nhóm vi khuẩn nitrite hóa. NH4+ + 1,5O2 → 2H+ + 2H2O + NO2ˉ Vi khuẩn tham gia mạnh nhất trong quá trình nitrite hóa là vi khuẩn hóa vô cơ tự dưỡng, hiếu khí bắt buộc. Khi chúng chuyển hóa NH4+ thành NO2- sẽ sinh ra năng lượng và năng lượng này sẽ được các vi khuẩn nitrite hóa sử dụng cho các hoạt động sống của mình. Trong tự nhiên vi khuẩn nitrite hóa hiện diện rất nhiều: Nitrosococcuseanus, Nitrosococcus, Nitrosomonas, Nitrosopira, Nitrosocystis, Nitrosolobus (hình 1.2) [8]. Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện nhất định. Hai pha chủ yếu là pha di động (tế bào có một hay chùm tiên mao) và pha tập đoàn khuẩn keo (các tế bào không di động). 6
Hình 1.2. Bốn giống vi khuẩn chủ yếu tham gia vào quá trình nitrite hóa [8] Giai đoạn nitrate hóa: Chuyển NO2- thành NO3- bởi nhóm vi khuẩn nitrate hóa. NO2- + ½ O2 → NO3- Các vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa là vi khuẩn hóa vô cơ tự dưỡng, vi khuẩn nitrate hóa thường gặp như: Nitrobacter winogradskyi, Nitrobacter agilis, Nitrospina gracili, Nitrococcus mobilis (hình 1.3). Hình 1.3. Ba giống vi khuẩn chủ yếu tham gia vào quá trình nitrate hóa [8] Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặc trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao [8]. 7
Quá trình nitrate hóa đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên, nó giúp loại bỏ chất độc amon trong môi trường từ đó giảm thiểu ảnh hưởng tới sức khỏe của sinh vật. 1.2. Nhóm vi khuẩn nitrate hóa 1.2.1. Đặc điểm chung Hệ vi khuẩn này luôn tồn tại trong đất và trong nước, đặc biệt những nguồn nước giàu chất hữu cơ, khi đó chúng sẽ phân giải NH3 là sản phẩm cuối của quá trình ammon hóa thành nirite, nitrate thích hợp cho cây trồng sử dụng, hoặc là cơ chất cho nhóm vi khuẩn phản nitrate khử về khí nitơ (N2) tự do [17] (hình 1.4). Đồng thời do khả năng linh hoạt trong việc oxy hóa các hợp chất nitơ (N2O, NO, NO2-, NO3-) nên một thời gian dài người ta xem hệ vi khuẩn này xuất phát chỉ từ một chủng. Nguồn gốc phát sinh nhóm vi khuẩn nitrate hóa là từ nhóm vi khuẩn quang hợp do sở hữu chu trình Calvin, cố định CO2 tạo thành các hợp chất carbon dự trữ năng lượng [12]. Hệ vi khuẩn nitrate hóa gồm hai nhóm vi khuẩn riêng biệt là nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia (AOB) và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB) tham gia vào 2 giai đoạn khác nhau của quá trình nitrate hóa [17]. Đặc trưng chung của hệ vi khuẩn nitrate hóa là chúng sống được trong môi trường khoáng vô cơ và oxy hóa chuyên biệt ammonia, nitrite hoặc nitrate, không sử dụng glucose, peptone hay các chất hữu cơ khác để thu năng lượng. Vì vậy, các nhà khoa học xếp chúng vào nhóm khoáng vô cơ tự dưỡng (lithotrophic) để phân biệt với nhóm heterotrophic sống trên môi trường vô cơ lẫn hữu cơ bao gồm các loài nấm (như Aspergillus), vi khuẩn dị dưỡng (Bacillius, Paracoccus, Pseudomonas, Thermus, Azoarcus) cũng sở hữu khả năng oxy hóa ammonia hay nitrite để thu năng lượng, nhưng hoạt tính rất thấp. Vi khuẩn nitrate hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxy hóa cơ chất -NH3 và nitrite. 8
Hình 1.4. Các giai đoạn trong quá trình nitrate hóa [27] NOB là vi khuẩn Gram âm, chúng thu được năng lượng bằng cách chuyển nitrite thành nitrate. Quá trình oxy hóa nitrite là một quá trình hiếu khí nghiêm ngặt và tất cả các yêu cầu C có thể được đáp ứng từ quá trình đồng hóa CO2. Về mặt sinh lý, NOB có thể được chia thành hai nhóm: Nitrobacter, Nitrococcus và nhóm Nitrospira, Nitrospina, Nitrotoga. Nitrobacter và Nitrococcus có khả năng thích nghi với nồng độ cơ chất cao (lên đến 29 mM nitrite) nên trong nuôi cấy có thể quan sát bằng mắt thường. Nhóm thứ hai khó nhận ra trong nuôi cấy và có giới hạn nhất định về nồng độ nitrite [24]. 1.2.2. Vi khuẩn oxy hóa ammonia Việc phân loại vi khuẩn này về cơ bản dựa vào hình dáng của tế bào, sau đó là sự sắp xếp của màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrance). Với các tiêu chí này, người ta đã phân loại vi khuẩn oxy hóa ammonia thành 5 giống chính là Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosoppria, Nitrosolobus và Nitrosovibrio. Trong đó, hiện có 16 loài carboxysome, hoạt tính urease, tốc độ chuyển hóa NH3, nồng độ tới hạn ammonia trong môi trường, yêu cầu về độ mặn và nồng độ muối giới hạn [18], [21]. 1.2.3. Vi khuẩn oxy hóa nitrite Vi khuẩn oxy hóa nitrite thuộc nhóm Gram âm, có nhiều hình dạng khác nhau như hình que, hình cầu và dạng xoắn. Chủ yếu sử dụng nitrite là nguồn sinh năng lượng và CO2 là nguồn cacbon chính. Phần lớn vi khuẩn oxy hóa nitrite 9
thuộc nhóm sống tự dưỡng hóa năng vô cơ nghiêm ngặt, ngoại trừ Nitrobacter có khả năng sống trên môi trường vô cơ và khử nitrat trong điều kiện kị khí để thu năng lượng. Vi khuẩn oxy hóa nitrite thời gian sinh trưởng thường thấp, thời gian thế hệ kéo dài từ 8 giờ đến vài ngày. Tốc độ sinh trưởng bị ảnh hưởng bởi mức độ tập trung cơ chất, nhiệt độ, ánh sáng, pH và oxi hòa tan. Vi khuẩn oxi hóa nitrite phát triển tốt ở nồng độ nitrite từ 2 - 30mM, ở pH 7,5 - 8 và nhiệt độ 25 - 30oC [11]. 1.3. Chu trình Nitơ trong đầm nuôi thủy sản và ứng dụng của nhóm vi khuẩn nitrate hóa trong nuôi trồng thủy sản 1.3.1 Chu trình Nitơ trong đầm nuôi thủy sản Chu trình nitơ trong ao nuôi đóng vai trò quan trọng nhằm chuyển hóa khí độc NH3 thành các sản phẩm phụ an toàn và ít gây hại cho thủy sản. Hiểu được chu trình nitơ trong ao nuôi sẽ giúp bà con nông dân giảm khí độc một cách an toàn và hiệu quả. Trong quá trình nuôi thủy sản, thức ăn dư thừa hay chất thải, xác sinh vật nếu không được xử lí kịp thời chúng sẽ phân hủy và tạo ra khí amoniac (NH3) đây là một loại khí độc ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của các loài thủy sản, thậm chí có thể gây chết. Biện pháp tốt nhất để loại bỏ NH3 trong ao nuôi là tạo ra chu trình nitơ trong nước [33]. Nitơ có thành phần cơ bản của protein và các thành phần khác của tế bào nguyên sinh nên chúng đóng vai trò quan trọng nhất để thúc đẩy sự phát triển của tảo. Tuy nhiên, nếu hàm lượng nitơ trong ao quá lớn có thể phân hủy và tạo ra khí độc NH3 và NO2 (ammoni, nitrite) gây hại cho tôm và cá. Hai loại khí này có thể gây hại ngay cả khi ở nồng độ thấp. Chu trình nitơ trong nước là quá trình nitơ sẽ được chuyển hóa qua lại dưới các dạng hợp chất hóa học của nó. Quá trình này loại bỏ khí NH3 bằng việc tạo ra vi khuẩn có khả năng phá vỡ và chuyển hóa NH3 thành các chất ít gây hại, làm sạch môi trường ao nuôi [33]. 10
Hình 1.5. Chu trình Nitơ trong hệ sinh thái ao nuôi thủy sản [33] Chu trình Nitơ trong ao nuôi diễn ra theo 3 giai đoạn chính (hình 1.5): Giai đoạn 1: Chuyển hóa NH3 → NO2 Chu trình Nitơ trong ao nuôi sẽ được bắt đầu khi mà các chất thải bị phân hủy thành khí NH3. Khi mà NH3 trong ao tăng quá cao so với mức chịu đựng của cây thủy sinh, sẽ xuất hiện vi khuẩn Nitrosomonas (vi khuẩn hiếu khí) tại những nơi có nhiều khí oxy, chúng hấp thụ NH3 rồi thải ra khí NO2 trong môi trường ao nuôi [33]. Giai đoạn 2: Chuyển hóa NO2 → NO3 Khi NO2 xuất hiện kéo theo đó là sự sinh sôi, phát triển của vi khuẩn Nitrospira (vi khuẩn yếm khí) ở những nơi có hàm lượng oxy thấp (môi trường yếm khí). Lúc này chúng sẽ hấp thụ NO2 và thải ra NO3, đồng thời NO3 cũng sẽ bị cây thủy sinh hấp phụ một phần để phát triển [33]. Khác với NH3 và NO2, NO3 không gây độc cho tôm cá ở mức thấp đến trung bình. Tuy nhiên ở nồng độ cao cũng có nguy cơ gây độc nên người nuôi cần điều chỉnh và giữ NO3 ở mức an toàn hoặc chuyển đổi nó thành khí N2 (không gây hại cho tôm) [33]. 11