Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân loại và quan hệ di truyền các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm cập nhật thông tin về thành phần loài, phân loại, phân bố, một số đặc điểm sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus ở Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân loại và quan hệ di truyền các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM LAN ANH PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN CÁC LOÀI THUỘC GIỐNG ẾCH CÂY Gracixalus (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM PHẠM LAN ANH PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN CÁC LOÀI THUỘC GIỐNG ẾCH CÂY Gracixalus (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM Ngành: Sinh thái học Mã số: 8.42.01.20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS NGUYỄN THIÊN TẠO 2. PGS.TS HOÀNG VĂN NGỌC THÁI NGUYÊN - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) và PGS. TS. Hoàng Văn Ngọc (Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên). Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là hoàn toàn trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó. Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2020 Tác giả luận văn Phạm Thị Lan Anh i
LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm n chân thành và tri ân sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thiên Tạo (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam) và PGS.TS Hoàng Văn Ngọc (Trường Đại học sư phạm, Đại học Thái Nguyên) đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm n thầy cô trong khoa Sinh học, Phòng Đào tạo Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa học. Đặc biệt, em xin cảm n Phòng Bảo t n Thiên nhiên (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) đã gi p đ , cung cấp tài liệu và các trang thiết bị trong thời gian nghiên cứu tại đây. Tôi xin cảm n Ban Lãnh đạo, các cán b ki m lâm của khu bảo t n thiên nhiên Na Hang, Tuyên Quang đã cung cấp thông tin và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình khảo sát thực địa. Xin được t lòng biết n sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã đ ng viên và ủng h tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu này. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát tri n khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.05-2019.334 Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020 Học viên Phạm Lan Anh ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii MỤC LỤC .......................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................... v DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH........................................................................................... vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài......................................................... 2 4. N i dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ................................. 4 1.1. Tổng quan về nghiên cứu lư ng cư ở Việt Nam ......................................... 4 1.1.1. Lược sử nghiên cứu lư ng cư ở Việt Nam ................................................ 4 1.1.2. Lược sử nghiên cứu các loài lư ng cư thu c giống Gracixalus ............... 5 Chƣơng 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 9 2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................... 9 2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 9 2.3. Phư ng pháp nghiên cứu .............................................................................. 9 2.3.1. Khảo sát thực địa ....................................................................................... 9 2.3.2. Trong phòng thí nghiệm .......................................................................... 11 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 15 3.1. Phân loại các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam ............................. 15 3.1.1. Đặc đi m hình thái các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam ........... 16 3.2. Phân tích mối quan hệ di truy n các loài trong giống Gracixalus.............. 30 iii
3.2.1. Sự sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam dựa trên đoạn gen 16S-rARN ................................................................... 30 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ................................................................. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 37 iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 16S-rRNA : 16S ribosomal RNA 12S-rRNA : 12S ribosomal RNA cs : C ng sự DNA : Axit đê ôxi ribônuclêic ĐDSH : Đa dạng sinh học et al. : Và tác giả khác IEBR : Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật IUCN : Tổ chức Bảo t n Thiên nhiên Quốc tế KBTTN : Khu Bảo t n thiên nhiên LC : Lư ng cư LCBS : Lư ng cư và Bò sát PCR : Phản ứng chuỗi polymerase PL : Phụ lục TS : Tiến sĩ VNMN : Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam VQG : Vườn quốc gia ♂ : Con đực ♀ : Con cái v
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các m i sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống Gracixalus ..................................................................... 14 Bảng 3.1. Thông tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu ....................... 30 Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền 16S-rARN giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam .................................................................... 35 vi
DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. S đ đo mẫu ếch nhái không đuôi ................................................... 12 Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại BI phân tích từ trình tự gen ti th 16S rRNA với đ dài 542 nucleotid các loài thu c giống Gracixalus và các loài ngoài nhóm. Các số nhánh trên và nhánh dưới lần lượt là xác suất sau Bayes (BPP) và ML bootstrap (chỉ các giá trị trên 70% được hi n thị). .............................................................. 34 vii
MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Số lượng loài lư ng cư (LC) ghi nhận phân bố ở Việt Nam tăng nhanh trong các thập kỷ qua từ 82 loài vào năm 1996 [9] lên đến 186 loài vào năm 2009 và cho tới nay có khoảng 290 loài được ghi nhận. Kết hợp phư ng pháp so sánh hình thái, phân tích âm sinh học và dữ liệu sinh học phân tử đã phát hiện nhiều loài mới cho khoa học, đặc biệt là các nhóm loài có đặc đi m hình thái tư ng đ ng và nhóm các loài phức hợp ẩn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Chỉ riêng họ Ếch cây (Rhacophoridae), trong khoảng 10 năm trở lại đây đã có h n 30 loài mới được phát hiện và ghi nhận phân bố mới ở Việt Nam. Giống Gracixalus trước đây được coi là m t phân giống của giống Aquixalus (Delorme và c ng sự, 2005). Tuy nhiên, Li và c ng sự, 2008 và 2009 dựa trên các bằng chứng về di truyền phân tử đã khẳng định Gracixalus là m t giống riêng biệt. Hiện nay, có 17 loài được ghi nhận phân bố ở My-an-ma, Lào, Thái Lan, Trung Quốc và Việt Nam, trong đó ở Việt nam đã ghi nhận 11 loài. Đáng ch ý, có 10 loài mới được phát hiện từ năm 2010 cho đến nay (Rowley và c ng sự, 2011, 2014; 2020 Mo và c ng sự, 2013; Nguyễn và c ng sự, 2013; Matsui và c ng sự, 2015, 2017; Zeng và c ng sự, 2017; Chen và c ng sự, 2018; Wang và c ng sự, 2018; Yu và c ng sự, 2019). Điều này cho thấy mức đ đa dạng cao về thành phần các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam. Thêm vào đó, các kết quả phân tích về mối quan hệ di truyền và phát sinh loài thu c nhóm G. jinxiuensis cho thấy vấn đề phân loại học vẫn chưa được giải quyết và cần thiết có những nghiên cứu cụ th h n (Matsui và c ng sự, 2017, Chen và c ng sự, 2018). Mặt khác, các loài thu c giống Ếch cây Gracixalus đa số có kích thước nh , màu sắc trầm tối phù hợp với lối sống gần mặt đất của ch ng, lưng màu nâu, xám hay xám nâu có m t vệt hình chữ X màu nâu nhạt ở lưng; có m t sọc đen chạy từ mũi đến mắt và từ sau ổ mắt qua màng nhĩ về phía vai, bụng 1
thường có màu trắng đục và xuất hiện nhiều hạt, tay không có màng b i và đặc biệt trong giống ếch này có loài phát ra âm thanh như tiếng chim hót. Do vậy, ch ng được các nhà nghiên cứu quan tâm và tìm hi u. Ứng dụng phư ng pháp nghiên cứu sinh học phân tử là m t công cụ hữu hiệu hỗ trợ công việc phân loại và phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, các nhóm loài có sự tư ng đ ng về hình thái, các loài mới được phát hiện và mô tả gần đây dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử. Vì những lý do nêu trên, học viên tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân loại và quan hệ di truyền các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm cập nhật thông tin về thành phần loài, phân loại, phân bố, m t số đặc đi m sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài thu c giống Ếch cây Gracixalus ở Việt Nam. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học cập nhật về phân loại học dựa trên các dữ liệu hình thái học và sinh học phân tử của các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam, đ ng thời các đặc đi m sinh học sinh thái từ các dẫn liệu ghi chép, quan sát ngoài thực địa. Mô tả hình thái, biện luận mối quan hệ di truyền và cung cấp m t số đặc đi m sinh học sinh thái về sinh cảnh sống, phân bố của các loài. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung số liệu góp phần xây dựng c sở khoa học cho công tác quản lý, xây dựng kế hoạch bảo t n các loài đ ng vật đặc hữu và có phân bố hẹp. Đ ng thời bổ sung tư liệu và mẫu vật cho Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. 4. Nội dung nghiên cứu Đ thực hiện được các mục tiêu trên, đề tài dự kiến tri n khai các n i dung nghiên cứu cụ th như sau: 2
- N i dung 1: Nghiên cứu đặc đi m hình thái các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam. + Cập nhật danh sách các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam. + Mô tả, phân tích đặc đi m hình thái các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam và cập nhật thông tin về phân bố của loài. - N i dung 2: Nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam. + So sánh sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus dựa vào kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S-rARN thu c hệ gen ty th . + Xây dựng cây quan hệ di truyền giữa các loài dựa trên giải trình tự mẫu vật Gracixalus thu thập ở Việt Nam và các trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen. 3
Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về nghiên cứu lƣỡng cƣ ở Việt Nam 1.1.1. Lược sử nghiên cứu lưỡng cư ở Việt Nam Theo Nguyen et al. (2009) [30], nghiên cứu về LC ở Việt Nam có lịch sử khá lâu đời nhưng bắt đầu phát tri n mạnh vào các giai đoạn cuối thế kỷ XIX, giữa và cuối thế kỷ XX và đặc biệt là những năm đầu thế kỷ XXI. Trước năm 1945, các nghiên cứu về LC ở Việt Nam chủ yếu do các nhà khoa học nước ngoài thực hiện như: Tirant (1885), Boulenger (1903), Smith (1921, 1924, 1932)... [2] và hàng loạt công trình phát hiện loài mới được công bố vào nửa đầu thế kỷ XX nhưng đáng ch ý là các công trình của Anderson L.G (1942), Bourret (1937, 1942) mang tựa đề Les Batraciens de l’Indochine (1942) [10]. Cuốn sách đã mô tả 171 loài và phân loài LC ở vùng Đông Dư ng (Việt Nam, Lào, Campuchia), trong đó có 78 loài ghi nhận ở Việt Nam. Bên cạnh đó cuốn sách đã công bố danh sách các địa đi m nghiên cứu trên toàn vùng Đông Dư ng, tổng quan lịch sử nghiên cứu LC ở vùng này; công trình còn đưa ra các đặc đi m hình thái dùng trong phân loại LC, các ghi ch đặc đi m sinh học, phân bố theo các vùng địa lý, phân bố theo đ cao, định loại và mô tả các loài. Mẫu vật và tư liệu mà tác giả phân tích được mang về từ vùng Viễn Đông, bán đảo Đông Dư ng, vịnh Bengal, Đông Ấn, Java và được lưu trữ tại Bảo tàng Tự nhiên Paris. Đây có th coi là tài liệu đầy đủ nhất về LC trong khu vực vào những năm giữa thế kỷ XX. Tuy nhiên, thời gian này công tác nghiên cứu LC mới chỉ dừng ở mức thu thập mẫu vật, thống kê, phân loại và lập danh sách loài. Từ năm 1945 đến năm 1954, Việt Nam tiến hành cu c kháng chiến chống thực dân Pháp, nên việc nghiên cứu LC bị gián đoạn. Trong giai đoạn này hầu như không có công trình nghiên cứu LC nào ở Việt Nam. 4
Sau hòa bình lặp lại ở miền Bắc Việt Nam (1954-1975) các nghiên cứu về thành phần loài LC mới được tăng cường bởi các tác giả Việt Nam. Có th k tên m t số nhà nghiên cứu tiêu bi u: Đào Văn Tiến, Trần Kiên, Nguyễn Văn Sáng, H Thu Cúc (1956-1976), Đào Văn Tiến và Lê Vũ Khôi (1956),... và các nghiên cứu r ng khắp từ cả hai miền Bắc và Nam. Trong báo cáo của Ủy ban Khoa học và kỹ thuật Nhà nước, 1981 về LCBS miền Bắc Việt Nam (1956- 1976) đã ghi nhận 69 loài LC dựa trên mẫu vật thu tại 11 địa đi m nghiên cứu thu c miền Bắc [8]. Từ năm 1975 đến nay, nổi bật là các nghiên cứu m t số các tác giả có th k đến như: Năm 1977, Đào Văn Tiến đã tổng hợp và công bố khóa định loại 87 loài LC trong bài báo về “Định loại LC Việt Nam” [7]. Năm 1981, Trần Kiên và cs. đã thống kê thành phần loài đ ng vật toàn miền Bắc từ năm 1956 đến năm 1976 in trong “Kết quả điều tra c bản đ ng vật miền Bắc Việt Nam”, trong đó có 69 loài LC [1]. Tiếp đó, Inger et al. (1999) đã tiến hành điều tra, đánh giá và ghi nhận 100 loài LC phân bố ở Việt Nam, tăng h n 20% so với nghiên cứu của Bourret (1942). Năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và H Thu Cúc xuất bản chuyên khảo Danh lục Bò sát và LC Việt Nam ghi nhận 82 loài LC [4]. Đến năm 2005 số lượng loài tăng lên gấp đôi (162) được Nguyễn Văn Sáng và cs. thống kê trong cuốn Danh lục ếch nhái và Bò sát Việt Nam [5]. Cuốn Danh lục gần đây nhất của Nguyen et al. (2009) ghi nhận tổng số 177 loài LC ở Việt Nam [30]. Năm 2014 có 222 loài LC được ghi nhận phân bố, tăng thêm 20,27% so với năm 2009. 1.1.2. Lược sử nghiên cứu các loài lưỡng cư thuộc giống Gracixalus Họ ếch cây Rhacophoridae được đánh giá là m t trong những họ có số lượng và thành phần loài đa dạng trong lớp LC. Hiện nay trên thế giới họ Rhacophoridae có khoảng h n 430 loài, thu c 17 giống. Chúng phân bố chủ yếu ở Châu Phi, Trung Quốc, Ấn Đ , các nước Đông Nam Á, Nhật Bản và Đài Loan [30]. 5
Năm 2014, Nguyễn và c ng sự đã ghi nhận ở Việt Nam có sự phân bố của khoảng 70 loài trong họ ếch cây, đến nay là 82 loài thu c 12 giống Chirixalus, Feihyla, Gracixalus, Kurixalus, Liuixalus, Nyctixalus, Philautus, Polypedates, Raorchestes, Rhacophorus, Theloderma, và Zhangixalus trong đó giống Gracixalus ghi nhận được 11 loài, chiếm khoảng 13,4% tổng số loài. Theo Delorme, Dubois, Grosjean và Ohler, 2005 Gracixalus thu c phân giống Aquixalus của họ Ếch cây Rhacophoridae. Mặt khác, bằng cách sử dụng phân loại cổ xưa Pyron và Wiens, 2011 đã đặt Gracixalus thu c Philautus (Sensuricto) và xác nhận m t cách đ n thuần. Giống Ếch cây - Gracixalux Delorme, M., A. Dubois, S. Grosjean, and A. Ohler, 2005 hiện ghi nhận tổng số 17 loài trên thế giới và ở Việt Nam đã ghi nhận 11 loài (Frost 2019), g m Gracixalus ananjevae (Matsui và Orlov, 2004); G. gracilipes (Bourret, 1937); G. jinxiuensis (Hu, 1978); G. lumarius (Rowley, Lê, Đậu, Hoàng và Cao, 2014); G. nonggangensis (Mo, Zhang, Luo, Zhou và Chen, 2013); G. quangi (Rowley, Dau, Nguyễn, Cao và Nguyễn, 2011); G. quyeti (Nguyễn, Hendrix, Böhme, Vũ và Ziegler, 2008; G. sapaensis (Matsui, Ohler, Eto và Nguyễn, 2017); G. supercornutus (Orlov, Ho và Nguyễn, 2004); Gracixalus trieng Rowley, Le, Hoang, Cao, and Dau, 2020; và G. yunnanensis (Yu, Li, Wang, Rao, Wu và Yang, 2019) Kurixalus ananjevae (Matsui & Orlov, 2004) lần đầu được Matsui và Orlov mô tả với tên khoa học là Chirixalus ananjevae dựa trên hai mẫu chuẩn thu tại tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam vào năm 2004 [26]. Theo Nguyễn Văn Sáng và cs. (2005), C. ananjevae có tên phổ thông là Nhái cây ananjeva và là loài ghi nhận mới cho khoa học [5]. Đây là loài có đặc đi m hình thái rất giống với loài C. eiffingeri và C. idiootocus (bây giờ thu c giống Kurixalus) và cho tới nay loài mới chỉ được ghi nhận tại tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam [26]. Năm 2014, Rowley et al. sử dụng kết quả phân tích sinh học phân tử đã chuy n loài sang giống Gracilxalus với tên gọi G. ananjevae [36]. 6
Ứng dụng kỹ thuật của sinh học phân tử đã gi p các nghiên cứu hệ thống và tu chỉnh vị trí phân loại của các họ, các giống hoặc chia tách các loài phức tạp m t cách chính xác h n. Frost et al. (2006) đã xây dựng cây quan hệ di truyền của hầu hết các họ ếch nhái trên toàn thế giới, công trình này đã tu chỉnh vị trí phân loại của rất nhiều họ và giống lư ng cư, trong đó có m t số giống phân bố ở Việt Nam như các loài thu c giống Paa chuy n sang giống Nanorana, các loài thu c giống Chirixalus chuy n sang giống Chiromantis, các loài thu c giống Rana chuy n sang giống Huia, Hylarana và Sylvirana,...[16]. Về quan hệ di truyền, các nghiên cứu về các loài thu c giống Gracixalux còn khá hạn chế với m t số quan đi m khác nhau. M t số công trình công bố có liên quan như: Năm 2008, Dubois và c ng sự đã cung cấp bằng chứng phân tử cho sự liên kết của Gracixalus với Aquixalus mặc dù sau đó Li, Che, Bain, Zhao, và Zhang, 2008 trên c sở b dữ liệu phân tử lớn h n, đã cung cấp bằng chứng phân tử rằng Aquixalus (Sensuricto) nên được đặt trong Kurixalus và Gracixalus nằm cách xa Kurixalus, Gracixalus được xác định là 1 chi. Năm 2013, Li et al đã phân tích mối quan hệ di truyền của m t số loài của giống Gracixalux ở Trung Quốc và m t số tỉnh thu c Việt Nam, xác nhận mối quan hệ họ hàng của Gracixalus và Philautus. Cũng năm 2011 nhóm Rowley, Nguyen, Dau, Nguyen, và Cao đã đề xuất trên c sở bằng chứng phân tử rằng hai nhánh chính có th được phân định: (1) nhánh này có Gracixalus jinxiuensis và m t số loài chưa được đặt tên trước đây, (2) m t nhánh khác bao g m ít nhất Gracixalus quyeti, Gracixalus gracilipes, Gracixalus supercornutus và Gracixalus quangi. Năm 2014, Rowley cùng c ng sự đã cung cấp bằng chứng phân tử s b cho các mối quan hệ trong chi. 7
Matsui et al. (2017), đã phân tích về mối quan hệ của quần th loài Gracixalux ở miền Bắc Việt Nam dựa trên phân tích gen ty th và phát hiện và mô tả m t loài mới Gracixalus sapaensis. Ngoài ra, gần đây m t số nhà nghiên cứu dựa trên sự khác biệt về di truyền phân tử và hình thái đã phát hiện và mô tả các loài mới cho khoa học thu c giống Gracixalus g m: Chen et al năm 2018 phát hiện, mô tả loài G. tianlineneis; Zeng et al., 2018 phát hiện, mô tả loài G. guangdongensis; Yu et al năm 2019 phát hiện, mô tả loài G. yunnanensis; và G. triengi được Rowley et al phát hiện và mô tả năm 2020. Năm 2015, 65 Rowley cùng c ng sự nghiên cứu đặc đi m sinh học, sinh thái, sinh sản, trứng, phôi, ấu trùng và tiếng kêu của ba loài ếch Gracixalus gracilipes, G. quangi, G. supercornutus. Kết quả nghiên cứu cung cấp các thông tin về sinh học, sinh thái, sinh sản, trứng, phôi, ấu trùng và tiếng kêu như chim hót của ba loài này. Chen, Bei, Liao, Zhou và Mo, 2018 đã cung cấp m t cây ML phân tử của loài Gracixalus và cung cấp m t bản đ sinh thái của loài Gracixalus . Năm 2020, Nguyễn, Dư ng, Lưu và Poyarkov cung cấp m t bảng các đặc đi m hình thái cho loài này. 8
Chƣơng 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm cập nhật thông tin về thành phần loài, phân loại, phân bố, m t số đặc đi m sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài thu c giống Ếch cây Graxcixalus ở Việt Nam. 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các loài lư ng cư thu c giống Ếch cây Graxcixalus ở Việt Nam. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Khảo sát thực địa * Chuẩn bị dụng cụ đi thực địa: Bản đ , GPS, túi nilong, c n, xi lanh, khay, bút kim, giấy can, b đ mổ, lọ đựng mẫu vật, sổ ghi nhật ký, máy ảnh, đèn pin (c lớn, c nh ). * Địa điểm thu mẫu:. - Sử dụng mẫu được thu thập tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. - Ngoài ra, chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa trong khoảng thời gian 20 ngày từ tháng 5 đến tháng 7 năm 2019, vào thời gian này các loài Lư ng cư ra hoạt đ ng, kiếm ăn và sinh sản. Nghiên cứu đã thực hiện các đợt khảo sát m t số địa đi m thu c khu vực miền núi phía Bắc.  Đợt 1 từ ngày 15 đến ngày 21 tháng 6 năm 2019 tại Khu bảo t n thiên nhiên Na Hang, Tuyên Quang.  Đợt 2 từ ngày 22 tháng 6 đến ngày 25 tháng 6 năm 2019 tại Yên Bái. * Thời gian thu mẫu: Đ thu thập mẫu và các số liệu hình thái có liên quan, ch ng tôi tiến hành khảo sát thực địa cả ban ngày và ban đêm. Thường tập trung ven các suối nh , vũng nước, ao nh , vùng đầm lầy, hang hốc, n i phủ nhiều lá mục ven các đường mòn trong rừng. 9
 Ban ngày: Từ 8h00 đến 11h00, khảo sát các tuyến đường và chụp ảnh sinh cảnh, quan sát các nhân tố tác đ ng tới sinh cảnh và loài.  Ban đêm: Các loài Lư ng cư thường hoạt đ ng và kiếm ăn nên ch ng tôi tiến hành khảo sát từ 19h00 đến 1h00 ngày hôm sau đ thu thập mẫu vật và đo đếm các chỉ số hình thái và sinh thái liên quan. * Thu thập số liệu về đặc điểm sinh thái: Thông tin về sinh cảnh sống, n i thu thập mẫu và điều kiện môi trường (nhiệt đ , đ ẩm) cũng sẽ được ghi nhận tại địa đi m thu mẫu đ phục vụ việc phân tích đặc đi m phân bố của từng loài. * Phương pháp thu mẫu: Chủ yếu thu thập bằng tay. * Xử lý mẫu vật: Mẫu LC được thu đ trong túi nilong, sau khi chụp ảnh m t số mẫu được trả về tự nhiên, mẫu vật đại diện cho các loài ở các địa đi m khảo sát được giữ lại làm tiêu bản nghiên cứu. * Làm tiêu bản: Xử lý và bảo quản mẫu vật theo tiêu chuẩn của các bảo tàng trong nước và trên thế giới qua tham khảo tài liệu của Simmon (2002) [39] và Ngô Đắc Chứng & Nguyễn Quảng Trường (2015). - Gây mê: Mẫu vật được gây mê bằng miếng bông thấm etyl acetate. Thu bổ sung mẫu c hay mẫu gan đ phân tích DNA và lưu trữ trong c n 95% và bảo quản trong tủ lạnh. - Cố định mẫu: Việc cố định mẫu cần đảm bảo mẫu có hình dạng dễ phân tích hoặc dễ quan sát sau này. Sắp xếp mẫu vật theo hình dạng mong muốn, sau đó phủ nilong m ng lên toàn khay cố định mẫu, ngâm trong c n 80-90% trong vòng 4-10 giờ. Đối với LC c lớn cần tiêm c n 100% vào bụng và c của con vật đ tránh thối h ng mẫu. - Ký hiệu mẫu: Cần đeo nhãn kí hiệu vào cho mẫu vật. Nhãn và chỉ bu c không thấm nước, chữ viết trên nhãn không bị tan trong c n. Khi đeo nhãn cần bu c chỉ quanh khớp giữa xư ng đùi và ống chân tránh bị tu t. 10
- Bảo quản mẫu vật: Đ bảo quản mẫu vật lâu cần chuy n sang ngâm c n 70%. Các bình đựng mẫu phải có nắp kín đ tránh bay h i c n và làm khô mẫu. Mẫu vật phải được bảo quản trong phòng đủ điều kiện (nhiệt đ và đ ẩm thấp, tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời, có khay và giá đựng). 2.3.2. Trong phòng thí nghiệm a) Phân tích đặc điểm hình thái: Mẫu trưởng thành: Các chỉ tiêu về kích thước theo tài liệu của Orlov et al. 2012, được đo bằng thước kẹp điện tử Alpha-Tool với đ n vị đo nh nhất là 0,01 mm. Ngoài giá trị nh nhất (min) và giá trị lớn nhất (max), giá trị trung bình và đ lệch chuẩn (TB ± SD) với số cá th tối thi u n > 2 cũng được thống kê trong bảng các chỉ tiêu hình thái. Tổng số 26 chỉ tiêu hình thái được đo đếm và phân tích, bao g m: 1 SVL = Chiều dài mút mõm-lỗ 14 AG = Khoảng cách từ nách đến huyệt bẹn 2 HW = Chiều r ng đầu (đo ở 15 FLL = Dài chi trước (từ mút đi m r ng nhất của đầu) ngón tay III đến nách) 3 HL = Dài đầu (đo từ mút mõm 16 FFL = Chiều dài ngón tay I đến gờ sau của xư ng hàm) 4 HD = Chiều cao đầu (đo ở đi m 17 TFL = Chiều dài ngón tay III cao nhất của đầu, thường ở phía trước ổ mắt) 5 UEW = R ng mí mắt (phần r ng 18 FTD = Đường kính lớn nhất của nhất của mí mắt trên) đĩa bám ngón tay III 6 ED = Đường kính ổ mắt (theo 19 HLL = Dài chi sau (từ mút ngón chiều ngang) chân IV đến bẹn) 7 TD = Đường kính lớn nhất của 20 FL = Chiều dài đùi (từ hậu môn màng nhĩ đến đầu gối) 11