Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích đa dạng di truyền của ba loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài ứng dụng phương pháp chỉ thị phân tử SSR để phân tích đa dạng di truyền cho 19 cây bố mẹ tham gia lai giống của 3 loài bạch đàn (E. urophylla, E. exserta, E. camaldulensis), là cơ sở để cho các nhà lai tạo giống biết bản chất quan hệ di truyền giữa các cây trong loài và giữa các loài với nhau để chọn được bố mẹ lai thích hợp nhất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích đa dạng di truyền của ba loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ THU HÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA LOÀI CÂY BỐ MẸ (EUCALYPTUS UROPHYLLA, E. CAMALDULENSIS, E. EXSERTA) LÀM CƠ SỞ ĐỂ XÂY DỰNG CÁC TỔ HỢP BẠCH ĐÀN LAI KHÁC LOÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017
ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ THU HÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA LOÀI CÂY BỐ MẸ (EUCALYPTUS UROPHYLLA, E. CAMALDULENSIS, E. EXSERTA) LÀM CƠ SỞ ĐỂ XÂY DỰNG CÁC TỔ HỢP BẠCH ĐÀN LAI KHÁC LOÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 \ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Việt Cƣờng Hà Nội - 2017
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Cƣờng - Bộ môn Lai giống – Viện NS Giống và CNSH lâm nghiệp, ngƣời đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật; Ban lãnh đạo Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp cùng các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi gửi lời cảm ơn đến bạn bè và ngƣời thân trong gia đình đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, anh, chị và gia đình dồi dào sức khỏe, thành công trong sự nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2017 Học viên Trần Thị Thu Hà
ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i MỤC LỤC ......................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................... 3 1.1. Một số nghiên cứu trong chọn giống cây bạch đàn ................................... 3 1.1.1. Trên thế giới .......................................................................................... 3 1.1.2. Tại Việt Nam ........................................................................................... 6 1.2. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật ADN ........................................ 8 1.3. Ƣu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử ......................................... 13 1.4. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di truyền và chọn giống cây lâm nghiệp ............................................................. 15 1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 15 1.4.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20 CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 25 2.1. Mục tiêu.................................................................................................... 25 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25 2.3. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu ............................................. 25 2.3.1. Đối tượng .............................................................................................. 25 2.3.2. Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 27 2.3.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 27 2.3.4. Hóa chất ................................................................................................ 27 2.3.5. Thiết bị................................................................................................... 28
iii 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 28 2.4.1. Các phương pháp sử dụng trong phòng thí nghiệm ............................. 28 2.4.2. Các phương pháp ngoài hiện trường .................................................... 35 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 37 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 40 3.1. Phân tích đa dạng di truyền của các cây bố mẹ đã chọn .......................... 40 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................ 40 3.1.2. Kết quả phản ứng PCR từ ADN tổng số của các mẫu bạch đàn với các mồi SSR ........................................................................................................... 40 3.1.3. Kết quả phân tích quan hệ di truyền giữa các cây bố mẹ chọn lai giống................................................................................................................41 3.2. Xây dựng các tổ hợp lai ........................................................................... 45 3.2.1. Xác định thời điểm nở hoa, kết quả của các cây bố mẹ tham gia lai giống 45 3.2.2. Lai giống ............................................................................................... 46 3.2.3. Khảo nghiệm các tổ hợp bạch đàn lai tại Trường Sơn – Lương Sơn - Hòa Bình ......................................................................................................... 48 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 55 4.1. Kết luận .................................................................................................... 55 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 56 Tiếng Việt:....................................................................................................... 56 Tiếng Anh:....................................................................................................... 58 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 62
iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified fragment length polymorphism APS Amonium Persulfate ARN Axit Ribonucleic bp Base pair cM Centi Morgan CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide CTPT Chỉ thị phân tử cs Cộng sự CU Dòng bạch đàn lai E. camaldulensis x E. urophylla dNTPs Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid ISSR Inter-Simple sequence repeat kb Kilo base MAS Marker Assisted Selection Nu Nucleotide PCR Polymerase chain reaction. PU Dòng bạch đàn lai giữa E. pellita và E. urophylla QTL Quantitative trait locus RAPD Random Amplified Polymosphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate
v SNP Single nucleotide polymorphism SSR Simple sequence repeats STS Sequence Tagged Sites TBE Tris-Boric Acid-EDTA TE Tris-EDTA UC Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. camaldulensis UE Dòng bạch đàn lai E. urophylla và E. exserta UP Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. pellita
vi DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Danh mục các cây bạch đàn bố mẹ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ..............................................................................................................................26 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.............................................................. 31 Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền giữa 19 cây bạch đàn ................................. 41 Bảng 3.2. Vật hậu học của các loài cây tham gia lai giống ............................ 45 Bảng 3.3. Danh mục 61 tổ hợp lai giữa 3 loài bạch đàn ................................. 46 Bảng 3.4. Sinh trƣởng các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình.. ............................. 48 Bảng 3.5. Sinh trƣởng của các tổ hợp bạch đàn lai thuận nghịch ................... 51 Bảng 3.6. Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình .................... 51
vii DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang Hình 2.1. Cây bố mẹ U4 (D1.3=17,9 cm) (U4 - sinh trƣởng chậm) .......................27 Hình 2.2. Cây bố mẹ U3 (D1.3=39,8cm) (U3 – sinh trƣởng nhanh)……………….27 Hình 2.3. Mẫu lá bảo quản ........................................................................................29 Hình 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ...................................................................32 Hình 2.5. Lắp đặt dàn giáo lai giống .........................................................................36 Hình 2.6. Chọn hoa và khử đực …………………………………………………...36 Hình 2.7. Chụp bao cách ly …………………………………………………………36 Hình 3.1. Kết quả điện di tinh sạch ADN tổng số 19 cây bạch đàn .........................40 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của mồi EMBRA229 và EMBRA165 với 19 mẫu bạch đàn trên gel polyacrylamide 4,5% .................................................41 Hình 3.3. Cây phân loại di truyền của 19 cây bạch đàn ............................................42 Hình 3.4. Quan hệ di truyền giữa 19 cây bạch đàn ...................................................42 Hình 3.5. Tổ hợp bạch đàn lai C4U4 ở Hòa Bình .....................................................53
1 MỞ ĐẦU Bạch đàn là cây lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh, có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái nên đƣợc xem là một trong những loài cây dẫn đầu về trồng rừng sản suất trên thế giới với tổng diện tích đạt 20,07 triệu ha vào năm 2014. Gỗ bạch đàn đƣợc sử dụng cho ngành xây dựng, đóng đồ nội thất, nguyên liệu chế biến ván ép, ván dăm và ngành công nghiệp giấy cũng nhƣ sản phẩm sinh khối cho ngành năng lƣợng. Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chƣơng trình cải thiện giống cây rừng, với mục tiêu chính là tăng nâng cao chất lƣợng sản phẩm gỗ, cải thiện các đặc tính sinh học nhƣ: tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi, chống chịu sâu, bệnh… Hiện nay, ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di truyền làm cơ sở cho quá trình chọn giống là hƣớng nghiên cứu có triển vọng. Có nhiều loại chỉ thị phân tử nhƣ: AFLP, RFLP, RAPD, SSR, STS, SNP,…mỗi kỹ thuật có ƣu nhƣợc - điểm riêng, trong đó đƣợc sử dụng phổ biến là chỉ thị RAPD và SSR. Chỉ thị RAPD phù hợp cho nghiên cứu những loài mới chƣa biết rõ thông tin về trình tự ADN và chƣa có nghiên cứu nào phát triển bộ chỉ thị cho loài này. Do chỉ thị RAPD là mồi đơn với trình tự là một chuỗi nucleotide ngắn (5-12 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên ở nhiều vị trí nên khi sử dụng chỉ thị RAPD trong nghiên cứu, kết quả của mỗi lần thí nghiệm có thể khác nhau, vì vậy cần phải có sự lặp lại các thí nghiệm. Trong khi đó, chỉ thị SSR là các cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên hai đầu của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc hiệu và thống nhất chung cho cùng một đoạn ADN không phân biệt các cá thể trong cùng một loài, nhƣng giữa các cá thể trong cùng một loài thì số lần lặp lại là khác nhau. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị SSR cho kết quả chính xác hơn so với chỉ thị RAPD và thƣờng đƣợc sử dụng cho nghiên cứu các loài
2 đã có những bộ chỉ thị phát triển riêng cho loài hoặc những loài trong cùng một chi. Năm 2001, tại trƣờng Đại học Tasmania của Úc, Steane và cs đã sử dụng 12 cặp mồi có kí hiệu EMCRC dùng để nhân bản các chỉ thị SSR ở cây bạch đàn. Ngoài ra còn khoảng 30 cặp mồi mang các đoạn lặp lại (CA)n và (CAG)n cũng đƣợc tạo ra bằng việc sử dụng thƣ viện bộ gen [41]. Cho đến nay với đối tƣợng cây bạch đàn, số lƣợng chỉ thị SSR đã lên đến hàng nghìn, nhƣng bộ chỉ thị phân tử SSR đang đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phổ biến nhất là EMBRA, có 300 mồi SSR với tên gọi EMBRA đã đƣợc các nhà khoa học tại Braxin phát triển [25]. Trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ “Phân tích đa dạng di truyền của ba loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài”, học viên đã ứng dụng phƣơng pháp chỉ thị phân tử SSR để phân tích đa dạng di truyền cho 19 cây bố mẹ tham gia lai giống của 3 loài bạch đàn (E. urophylla, E. exserta, E. camaldulensis), là cơ sở để cho các nhà lai tạo giống biết bản chất quan hệ di truyền giữa các cây trong loài và giữa các loài với nhau để chọn đƣợc bố mẹ lai thích hợp nhất. Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, do TS. Nguyễn Việt Cƣờng làm chủ nhiệm đề tài và tôi có tham gia thực hiện một số phép lai giống và phân tích đa dạng di truyền các loài cây bố mẹ trong phòng thí nghiệm.
3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Một số nghiên cứu trong chọn giống cây bạch đàn 1.1.1. Trên thế giới Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc bộ Sim (Myrtales), họ Sim (Myrtaceae). Hiện nay, chi này gồm hơn 700 loài, hầu hết có nguồn gốc từ Úc, còn một số loài khác có xuất xứ từ New Guinea và Indonesia. Các loài bạch đàn đã đƣợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ, Đông Nam Á…[45]. Bạch đàn là cây sinh trƣởng nhanh, gỗ đƣợc dùng làm nguyên liệu giấy, ván dăm, ván sợi ép, đồ mộc, gỗ xây dựng, cột chống... Ngoài ra, lá của một số loài bạch đàn còn đƣợc sử dụng để tách chiết tinh dầu và chế biến dƣợc phẩm. Trên thế giới, bạch đàn là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích ngày càng đƣợc mở rộng. Theo số liệu công bố, rừng trồng bạch đàn đến năm 2009 đã đạt khoảng 19,5 triệu ha tại 3 châu lục lớn là Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á-Thái Bình Dƣơng. Ấn Độ là nƣớc có diện tích rừng trồng bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2009 ƣớc tính có khoảng 3,9 triệu ha [46]. Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến lƣợc cải thiện giống cây rừng. Các chƣơng trình khảo nghiệm giống bạch đàn ở một số quốc gia đã và đang đƣợc chú trọng. Tại Nam Phi, từ năm 1973 đến năm 1983, Darrow đã tiến hành 9 khảo nghiệm phối hợp 26 xuất xứ Bạch đàn caman (E. camaldulensis), 23 xuất xứ Bạch đàn tere (E. tereticornis) và 23 xuất xứ Bạch đàn grandis (E. grandis). Kết quả cho thấy, ở những vùng ẩm thì Bạch đàn grandis cho năng suất cao nhất, sau đó đến Bạch đàn tere. Còn ở những vùng khô hạn và có sƣơng giá thì Bạch đàn caman lại cho năng suất cao hơn [30].
4 Chew T.K. (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 nơi khác nhau trên bán đảo Malaysia. Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trƣởng tốt nhất là loài Bạch đàn caman (2 xuất xứ Bắc Úc) và Bạch đàn degluta, các loài triển vọng khác là Bạch đàn brassiana, Bạch đàn urô và Bạch đàn tere [29]. Rao D.V. (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của Bạch đàn caman, Bạch đàn tere tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana của Ấn Độ. Qua điều tra sinh trƣởng cho thấy có 10 xuất xứ Bạch đàn caman và 5 xuất xứ Bạch đàn tere sinh trƣởng tốt [38]. Viện nghiên cứu lâm nghiệp Dehra Dun ở Ấn độ đã tạo đƣợc 2 giống bạch đàn lai ký hiệu là F.R.I-4 và F.R.I-5, có sức sinh trƣởng nhanh và có tính thích nghi rộng hơn loài thuần, tại tuổi 4 cây lai có khối lƣợng thể tích gấp 3 lần Bạch đàn tere cùng tuổi. Tổ hợp lai Bạch đàn tere x Bạch đàn grandis có khả năng sinh trƣởng tốt trên đất khô và nghèo dinh dƣỡng mà chính ở đó Bạch đàn grandis lại sinh trƣởng rất kém. Chứng tỏ ƣu thế lai thể hiện mạnh nhất ở nơi trồng không thuận lợi cho loài thuần [33], [32]. Từ năm 1989, Viện lâm nghiệp nhiệt đới Trung Quốc cũng tạo ra 204 cây lai từ các cặp bố mẹ giữa Bạch đàn urô với các loài Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn ƣớt và Bạch đàn pellita. Trong đó một số cá thể cây lai từ các tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn tere và Bạch đàn urô x Bạch đàn caman đã có ƣu thế lai rõ rệt về sinh trƣởng so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vƣợt bố mẹ với các trị số tƣơng ứng là 120,7% và 89,4% [40]. Theo Turvey (1995), tổ hợp lai giữa Bạch đàn grandis với Bạch đàn urô có năng suất rừng trồng lên 45,5 m3/ha (2,5 tuổi) trong lúc xuất xứ Wetar tốt nhất của bạch đàn urô chỉ đạt 29,31 m3/ha [42]. Nghiên cứu ƣu thế lai về năng suất đƣợc thực hiện trên các tổ hợp Bạch đàn grandis x Bạch đàn urô, Bạch đàn pellita x Bạch đàn urô, kết quả cho thấy
5 chúng là những tổ hợp lai có ƣu thế lai vƣợt hơn các loài thuần và là giống sản xuất ở Braxin và Congo [21]. Chƣơng trình cải thiện giống bạch đàn dựa trên phép lai đôi và lai ba cũng đƣợc thực hiện tại Braxin. Sinh trƣởng về thể tích ở tuổi 7 của những cá thể lai ba [Bạch đàn urô x (Bạch đàn caman x Bạch đàn grandis)] là 0,331 m3/cây đã vƣợt các cây lai tốt nhất của các tổ hợp lai đôi (GU, GC, UC) có các trị số tƣơng ứng là 0,290m3/cây; 0,253 m3/cây; 0,234 m3/cây và loài thuần Bạch đàn urô, Bạch đàn grandis với các trị số tƣơng ứng là 0,229 m3/cây và 0,247 m3/cây(Assis, 2000) [18]. Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã lai giữa Bạch đàn ƣớt (E. saligna) với Bạch đàn liễu (E. exserta) tạo ra đƣợc một số tổ hợp lai có khả năng vƣợt trội hơn loài Bạch đàn liễu tới 82% về thể tích thân cây, trong đó tổ hợp lai nghịch Bạch đàn liễu x Bạch đàn ƣớt có sinh trƣởng nhanh hơn tổ hợp lai thuận Bạch đàn ƣớt x Bạch đàn liễu. Hiện các giống lai đƣợc trồng chủ yếu ở các vùng ven biển vì chúng có khả năng chịu gió bão tốt đồng thời sinh trƣởng nhanh [40]. Thông thƣờng ƣu thế lai thể hiện rõ hơn trong những điều kiện môi trƣờng sống bất lợi và chúng có phạm vi thích ứng rộng hơn mức bình thƣờng. Nghiên cứu của Verryn (2000) cho thấy những tổ hợp lai có khả năng chống chịu với điều kiện môi trƣờng bất lợi tốt là Bạch đàn grandis x Bạch đàn caman, Bạch đàn grandis x Bạch đàn tere, Bạch đàn grandis x Bạch đàn urô. Ƣu thế lai về sinh trƣởng và tính chịu lạnh đƣợc tìm thấy ở tổ hợp lai Bạch đàn grandis x Bạch đàn niten, còn ƣu thế lai về sinh trƣởng và chống chịu bệnh loét thân thể hiện ở tổ hợp lai Bạch đàn grandis x Bạch đàn urô [43]. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn các cặp bố mẹ trong lai giống có tác động nhiều đến biểu hiện của ƣu thế lai, thƣờng các cặp bố mẹ có sinh trƣởng tốt cho ƣu thế lai mạnh hơn các cặp bố mẹ có sinh trƣởng kém. Ngoài
6 ra các nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hƣởng của việc chọn loài để lai cũng tác động đến biểu hiện ƣu thế lai, các loài có quan hệ di truyền xa nhau cho ƣu thế lai mạnh hơn những loài có quan hệ gần gũi [22]. 1.1.2. Tại Việt Nam Bạch đàn đƣợc du nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, đến nay đã trở thành nhóm cây trồng chủ lực trong các chƣơng trình trồng rừng tập trung và phân tán ở nƣớc ta. Tổng diện tích trồng bạch đàn đến năm 2001 là 348.000 ha chiếm 30% diện tích trồng rừng cả nƣớc. Cùng với nhóm loài keo, rừng trồng bạch đàn đã góp phần đáng kể đáp ứng nhu cầu gỗ nguyễn liệu, ván dăm, gỗ trụ mỏ góp phần cải thiện đời sống cho ngƣời dân làm nghề rừng. Các kết quả nghiên cứu ở giai đoạn trƣớc đã xác định đƣợc một số loài bạch đàn có triển vọng trong trồng rừng là Bạch đàn urô chủ yếu cho các tỉnh miền Bắc và Tây Nguyên ; Bạch đàn caman và Bạch đàn tere chủ yếu cho các tỉnh miền Trung và miền Nam ; Bạch đàn pellita cũng là một loài rất có triển vọng trên các vùng sinh thái trong cả nƣớc. Một số loài có triển vọng nhƣ Bạch đàn uro, Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn pellita cũng đã đƣợc xây dựng rừng giống và vƣờn giống [8],[14]. Từ năm 1991, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã tiến hành chọn lọc cây trội và ghép một số cây Bạch đàn urô (U), Bạch đàn caman (C) và Bạch đàn liễu (E). Giai đoạn 1996 – 2000, Trung tâm đã nghiên cứu và tiến hành lai giống thuận nghịch cho ba loài nói trên bằng phƣơng pháp thụ phấn có kiểm soát và tạo ra nhiều tổ hợp lai UC, CU, UE, EU, CE, EC và UU. Qua khảo nghiệm đã chọn lọc đƣợc 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai đều có sinh trƣởng nhanh hơn các loài bố mẹ. Các giống lai này đã đƣợc Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật theo quyết định số 4356 ngày 19/9/2001 và tác giả là GS. Lê Đình Khả cùng tập thể cán bộ Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng [7].
7 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) đã nghiên cứu chọn giống bạch đàn theo sinh trƣởng và kháng bệnh, cho thấy 3 loài bạch đàn là Bạch đàn caman, Bạch đàn brassiana và Bạch đàn tere có nhiều xuất xứ sinh trƣởng khá, có khả năng kháng bệnh hại, đề tài chọn đƣợc số dòng có sinh trƣởng nhanh và kháng bệnh cao. Qua nghiên cứu và kế thừa ở các giai đoạn trƣớc đề tài đã thu đƣợc các kết quả sau: Tuyển chọn đƣợc 8 dòng bạch đàn có chỉ số bệnh thấp, sinh trƣởng nhanh từ khu khảo nghiệm 50 dòng ở Sông Mây, trong đó 2 dòng SM16 và SM23 đã đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật. Hai dòng này sinh trƣởng nhanh đạt trên 25 m3/ha/năm và chống chịu tốt với bệnh hại lá tại Bình Dƣơng và Bình Phƣớc [11]. Dự án Sida-SAREC nghiên cứu cải thiện giống cây rừng trong đó có nghiên cứu về lai giống giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn pellita, kết quả năm 2005-2006 đã tạo ra đƣợc 60 tổ hợp lai UP và PU, qua khảo nghiệm ở Hà Nội, Nghệ An, Quảng Trị, Bình Dƣơng cho thấy có sự khác biệt về sinh trƣởng ở các tổ hợp lai và các lập địa, kết quả có 3 tổ hợp lai có triển vọng U70P28, U87P22, U87P8 cho lập địa Ba Vì và 2 tổ hợp lai cho Đông Hà Quảng Trị là U70P48, U87P22 [9]. Đề tài “Nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông” của TS. Nguyễn Việt Cƣờng đã chọn đƣợc 25 dòng bạch đàn lai (CU89, UE35, UE52, GU94, UE34, UE46, UE69, UC80, UE27, UE30, UE73, UU9, UE24, UE3, UE85, UE23, UC2, UU80, UG24, CU98, CU82, UG54, UG55, TU104, TP12) có sinh trƣởng nhanh hơn các đối chứng U6, GU8, PN2 và PN14 ở giai đoạn từ tuổi 2 đến tuổi 6. Trong số đó, có 5 dòng đã đƣợc công nhận là giống quốc gia là UE24, UC80, UG24, CU82, CU98 [5]. Nhƣ vậy, bạch đàn lai đƣợc đánh giá có ƣu thế lai và sinh trƣởng tốt hơn bố mẹ của chúng [6]. Cho đến nay, nhiều tổ hợp lai có sinh trƣởng vƣợt trội hơn bố mẹ đã đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật.
8 1.2. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật ADN Sự ra đời của các kỹ thuật chỉ thị phân tử từ năm 1980 đã đem đến sự tiến bộ ở tất cả các lĩnh vực của sinh học hiện đại, mở ra triển vọng có thể nắm bắt và tiến tới cải biến cũng nhƣ điều khiển các gen quy định tính trạng quan trọng. Chỉ thị phân tử là các gen hoặc các đoạn ADN hệ gen. Chúng có thể dựa trên cơ sở kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để phát hiện các locus đơn gen hoặc đa gen, có thể đòi hỏi hoặc không đòi hỏi trình tự, có thể khác nhau về mức độ tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng nhƣ bản chất của sự đa hình mà chúng phát hiện. Kỹ thuật chỉ thị phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền đƣợc nghiên cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lƣợng lớn sự đa hình tạo ra do tỷ lệ đột biến cao và vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị hình thái. Chỉ thị ADN đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, năng suất và phẩm chất giống. Mỗi loại chỉ thị ADN đƣợc phát triển bằng một kỹ thuật tƣơng ứng. Kỹ thuật chỉ thị ADN lý tƣởng cần phải có các tiêu chí sau: cho đa hình cao và phân bố đều trong genom; cho sự phân biệt rõ sự khác nhau về di truyền, tạo nhiều chỉ thị độc lập và chính xác; đơn giản, nhanh và ít tốn kém; cần ít mẫu và ADN; liên kết với kiểu hình nhất định; có thể lặp lại trong các nghiên cứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ và chính xác, có nhiều allen (hàm lƣợng thông tin cao), không cần biết trƣớc thông tin về genom và cơ thể.
9 Một số chỉ thị ADN hiện đang đƣợc sử dụng phổ biến là chỉ thị Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP ) và các chỉ thị dựa vào PCR nhƣ đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD), mircosatellite hay còn gọi là đa hình các đoạn lặp lại ngẫu nhiên (SSR), đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP)…  Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn - Restriction Fragment Length Polymorphism): Enzyme giới hạn là các nuclease có khả năng nhận biết những đoạn ADN có trình tự nucleotide xác định, nó sẽ bám vào đoạn ADN đó và cắt cả hai sợi của phân tử ADN vào giữa 2 nucleotide đối xứng nhau tại điểm cắt hạn chế. Kỹ thuật RFLP đƣợc xây dựng dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các chuỗi nucleotide trong phân tử ADN và khi ADN bị cắt bởi enzyme giới hạn thì tạo ra những phân đoạn khác nhau về kích thƣớc hay chiều dài [1].  Chỉ thị phân tử RAPD (đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên - Random Amplified Polymorphism DNA): RAPD đƣợc hình thành dựa trên phƣơng pháp PCR. Nếu thực vật có bộ gen hoàn toàn giống nhau, khi nhân bằng PCR với các mồi ngẫu nhiên thì các đoạn ADN thu đƣợc sẽ hoàn toàn giống nhau về kích thƣớc và cấu trúc. Khi điện di trên gel thì kết quả nhân gen sẽ thu đƣợc số băng, vạch ADN ở những vị trí giống nhau trên bản gel. Nếu bộ gen khác nhau thì kết quả thu đƣợc trên điện di đồ là không giống nhau. RAPD là kỹ thuật dựa trên PCR với một mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên gồm khoảng từ 5÷12 nucleotide, các mồi này thƣờng có hơn 60 % (G + C) để đạt đƣợc liên kết với mẫu đủ mạnh. Sự nhân ADN chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở hai tiêu điểm có sự định hƣớng ngƣợc nhau trong khoảng 2000 nucleotide dọc theo nhiễm sắc thể. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, càng dễ
10 thực hiện phản ứng RAPD – PCR, ngƣợc lại khi mồi càng dài thì khả năng bắt cặp càng khó nhƣng tính chính xác thì cao hơn, thông thƣờng sử dụng mồi có 10 nucleotide. Do mồi sử dụng có 10 nucleotide nên xác suất bắt cặp một đoạn nucleotide trong genom có 10 gốc bổ trợ vào khoảng 1/410 ≈ 1/106 = 1/1000000. Nhƣ vậy cứ khoảng một triệu gốc nucleotide sẽ có một vị trí gồm 10 nucleotid của khuôn ADN có trình tự bổ sung với mồi ngẫu nhiên. RAPD tạo ra các đoạn ADN không mang chức năng mã hoá, có kích thƣớc từ nhỏ hơn 100 bp đến nhiều hơn 2 kb. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là do đột biến ở vị trí gắn mồi làm ngăn trở việc bắt cặp của mồi. ADN đƣợc nhân lên sau đó đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dƣới đèn tử ngoại (Li, 1999) []. Số liệu thu đƣợc là sự có mặt hoặc vắng mặt của các đoạn này, chỉ thị RAPD đƣợc xem nhƣ các yếu tố “trội” trong di truyền Mendel ở một cơ thể lƣỡng bội [1].  Chỉ thị phân tử AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn cắt nhân bội - Amplified Fragment Length Polymorphism). AFLP gồm hai nội dung cơ bản: - Cắt ADN bằng các enzyme giới hạn (Restrition Enzyme) có bổ sung các adaptor đặc hiệu, tạo thành các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng cho các mồi đã đƣợc chọn từ trƣớc. - Nhân đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR với hai loại mồi khác nhau.  Chỉ thị phân tử STS (Vị trí chuỗi đánh dấu - Sequence Tagged Sites): Trong nghiên cứu lập bản đồ gen ở ngƣời năm 1989, Olson và cs đã nêu ra ý tƣởng sử dụng những vị trí đánh dấu trình tự STS, dựa vào một loại locus đã biết (gen, cDNA, hoặc gen tách dòng) đƣợc nhân lên bởi mồi PCR thiết kế dựa và trình tự đầu cuối của những locus đặc trƣng này. Dựa trên cơ sở PCR nó phát hiện một điểm có trình tự xác định, nó không đòi hỏi sự phân lập nhƣng đòi hỏi trình tự. Mồi có 18 - 20bp đƣợc thiết kế để nhân đoạn ADN ngắn, duy nhất trên ADN đã biết trình tự sự đa hình
11 nói chung đƣợc xác định nhƣ sự khác nhau về kích thƣớc của sản phẩm PCR trên gel agarose.  Chỉ thị phân tử EST (Expressed Sequence Tag): Là một chỉ thị dựa trên cơ sở PCR với mồi dài 18 – 20 nucleotide đƣợc thiết kế từ những phần trình tự đã biết trên hệ gene nhƣ các đoạn cADN, nó không đòi hỏi sự phân lập nhƣng đòi hỏi trình tự và phat hiện vùng biểu hiện duy nhất của hệ gen nên thích hợp đối với lập bản đồ. Sự đa hình nói chung đƣợc phát hiện bởi sự khác nhau về kích thƣớc của sản phẩm PCR. Tuy nhiên, việc thiết kế và chuẩn hóa mồi có thể đòi hỏi sự đầu tƣ đáng kể.  Chỉ thị SCAR (Vùng nhân bản chuỗi đƣợc mô tả - Sequence Characterised Amplified Regions): Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCAR. Các chỉ thị này dựa trên việc tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD đƣợc quan tâm, từ trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thƣờng dùng trong RAPD (24 nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của đoạn RAPD ban đầu.  Chỉ thị CAPS (Chuỗi đa hình nhân bản đƣợc cắt hạn chế - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences): cũng là một ví dụ của STS, đƣợc tạo ra bằng cách cắt các sản phẩm PCR với một enzyme hạn chế. Chỉ thị DNA này vẫn mang những ƣu điểm cơ bản của PCR là chỉ cần một lƣợng nhỏ nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ kết quả huỳnh quang. Các mồi PCR dài hơn (15 - 25 nucleotide) dùng cho CAPs có xu hƣớng tạo ra những sản phẩm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ thuật mồi ngẫu nhiên khác [1].  Chỉ thị SSR (Các chuỗi lặp lại đơn giản - Simple Sequence Repeat): SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản, hay còn gọi là phƣơng pháp vi vệ tinh (microsatellite) đƣợc Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989. Microsatellite có chứa các trình tự ADN, hiện nay đã có những nghiên cứu về vai trò chức năng của chúng trong hệ gen