Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tố gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hơp̣ hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B. cereus. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tố gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐINH THỊ NGA TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐINH THỊ NGA TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S Phùng Tôn Quyền . Hà Nội - 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những sự giúp đỡ này. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Tôn Quyền là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên Đinh Thị Nga Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Tác giả Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm .. 3 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) ................................ 3 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ................................................. 3 1.2. Tổng quan về Bacillus cereus .................................................................... 5 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus ..................................................... 5 1.2.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 7 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 7 1.2.4. Đặc điểm sinh trưởng .......................................................................... 8 1.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá................................................................. 10 1.2.6. Đặc điểm huyết thanh học ................................................................. 11 1.2.7. Đặc điểm phân loại ............................................................................ 12 1.3. Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus ................................................. 12 1.3.1. Các loại độc tố ruột (enterotoxin) ...................................................... 12 1.3.2. Độc tố gây nôn (cereulide) ................................................................ 16 1.3.3. Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực phẩm..................................................................................................... 18 1.4. Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus ................................................... 19 1.4.1. Nguồn gốc lây nhiễm B. cereus ......................................................... 19 1.4.2. Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus ......................... 20 1.4.3. Liều lượng gây ngộ độc ..................................................................... 21 1.4.4. Triệu chứng ........................................................................................ 22 1.5. Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus trong thực phẩm .............................................................................................. 23 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1.5.1. Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao ............................................... 23 1.5.2. Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ thấp .............................................. 24 1.5.3. Sử dụng chất bảo quản ....................................................................... 25 1.5.4. Thực hiện điều kiện vệ sinh tốt GHP (good hygienic practices) và thực hành sản xuất tốt GMP (good manufacturing practices) [45] ............. 25 1.6. Một số phương pháp nghiên cứu để nhận biết Bacillus cereus ............... 26 1.6.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. ............ 26 1.6.2. Phương pháp dựa trên đặc điểm huyết thanh học.............................. 28 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 31 2.1. Vật liệu. .................................................................................................... 31 2.1.1. Sinh phẩm. ......................................................................................... 31 2.1.2. Hóa chất và thiết bị. ........................................................................... 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 34 2.2.1. Phương pháp phân lập ....................................................................... 34 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn. .......................... 34 2.2.3. Phương pháp tách DNA tổng số ........................................................ 34 2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli. ...................................... 35 2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen. ................................................... 36 2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose................................................. 36 2.2.7. Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet. .................................... 36 2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng. ... 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 39 3.1. Phân lâ ̣p Bacillus cereus trên môi trường MYP ...................................... 39 3.2. Phát hiện gen mã hóa độc tố của Bacillus cereus bằ ng phản ứng PCR... 39 3.3. Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA. .................................. 41 3.3.1. Tách dòng gen bceT, nhe và hblA. .................................................... 41 3.3.2. Đo ̣c trin ̀ h tự gen má hóa các đô ̣c tố ................................................... 44 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 47 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 49 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 1 Bp Base pair 2 Bc Bacillus cereus 3 CFU Colony Forming Unit 4 dH2O Deion water 5 DNA Deoxyribonucleotide acid 6 dNTP deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate 7 ĐC Đối chứng 8 E. coli Escherichia coli 9 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid 10 EtBr Ethidium Bromide 11 kDa Kilo Dalton 12 OD Optical density - mật độ quang học 13 PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi 14 SDS Sodium dodecyl sulphate 15 Sol Solution 16 TE Tris EDTA 17 X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Danh mục hình Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B. cereus ........................................... 7 Hình 1.2: Khuẩn lạc B. cereus trên môi trường thạch huyết ............................ 8 Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B. cereus.......................................... 11 Hình 1.4. Cấu trúc hoá học của cereulide [24] ............................................... 17 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc .Bcereus trên môi trường MYP sau 12 giờ nuôi...... 39 Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố của gen bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) ............................... 40 Hình 3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α ................... 41 Hình 3.4. Điê ̣n di sản phẩ m cắ t DNA plasmid các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng trên gel 1% agarose ....................................................................... 42 Hình 3.5 . Điê ̣n di sản phẩ m PCR của các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng trên gel 1% agarose ..................................................................... 43 Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế ...................................... 44 Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế .................................... 45 Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế ..................................... 46 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Danh mục bảng Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus .... 10 Bảng 1.2. Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus ......................... 13 Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu. ........................... 32 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU Bacillus cereus thuô ̣c nhóm 1 chi Bacillus là vi khuẩn hình que , Gram dương và sinh bảo tử . B. cereus thường xuấ t hiê ̣n trong đấ t , trong sữa nguyên liê ̣u, trong các sản phẩ m từ sữa và trong các loa ̣i ngũ cố c . B. cereus có khả năng liên quan đế n các bê ̣nh về đường ruô ̣t như gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K (Beecher, Wong, 1994). Ngoài ra , B. cereus còn có khả năng sản sinh một loại độc tố chịu nhiệt n on-riposome peptide synthetase (NRPS-cereulide) (Agata et al., 1995). Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực kiểm nghiệm. Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác. Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc di truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng vài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao. Những phương pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công nghệ thực phẩm hiện đại. xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam”. Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất nguyên liệu chế tạo kit phát hiện các độc tố của vi khuẩn B. cereus sau này. 1
*/ Mục tiêu của nhiệm vụ: - Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B. cereus. */ Nhiệm vu của đề tài: - Phân lập vi khuẩn B.cereus tư các mẫu phẩm thu thập tại một số quán an vỉa hè tại hà nội, - Sàng lọc hệ gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy , trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K - Tách dòng và đọc trình tự các gen HBL, NHE, BCET và cytotoxin K từ một số chủng vi khuẩn B. cereus. 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [3]. 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[60]. Trong các vụ ngộ độc thực phẩm hiện nay, nguyên nhân do vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao. Có rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus… [59]. Do đó việc tìm hiểu các đặc tính của chúng là vô cùng cần thiết để có thể đưa ra biện pháp kiểm soát hiệu quả. Dưới đây là đặc tính của một số chủng vi khuẩn có nguy cơ ngộ độc cao: Staphylococus aureus S. aureus thường gặp ở các món ăn như salat cà chua, bánh sandwich và các sản phẩm đóng hộp. Khi S. aureus nhiễm vào thực phẩm, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng nôn, choáng váng và đau quặn bụng [59,60]. 3
Salmonellae sp. Salmonellae thường tồn tại trong các thực phẩm có hàm lượng protein cao như thịt, cá, trứng…Salmonellae có thể sinh trưởng trong thực phẩm, nhưng không sinh độc tố, khi chúng vào trong ruột hoặc vào máu chúng mới sinh độc tố. Bệnh ngộ độc do Salmonellae có triệu chứng điển hình như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau đầu [59,60]. Clostridium perfrigens C. perfrigens thường xuất hiện trong đất, nước do đó chúng rất dễ nhiễm vào thức ăn. Khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật, chúng thường cư trú trong ruột non. Nếu thực phẩm chứa một lượng lớn vi khuẩn này được tiêu hoá thì khi C. perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước [59,60]. Vibrio cholerae V. cholerae thường có mặt trong những thực phẩm chưa được nấu chín kỹ đặc biệt là các loại thuỷ, hải sản sống. Ngộ độc do V. cholerae có các triệu chứng điển hình như nôn, tiêu chảy dữ dội và liên tục nhưng không đau bụng. Bệnh nhân nếu không điều trị kịp thời sẽ bị mất nước nghiêm trọng, trụy tim dẫn đến tử vong [59,60]. Escherichia coli E. coli là vi khuẩn sống chủ yếu trong ruột của người và động vật. Nhiễm trực khuẩn đường ruột này với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc. Triệu chứng bệnh chủ yếu là đau bụng dữ dội, tiêu chảy, có thể nôn mửa [59,60]. Ngoài ra còn rất nhiều loại vi khuẩn khác có khả năng gây ngộ độc đã được nghiên cứu. Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nhìn chung vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở 2 dạng: Ngộ độc do ăn phải thức ăn có độc tố của vi khuẩn mà không cần có mặt tế bào của chúng (Staphylococus aureus) và ngộ độc do ăn phải thức ăn nhiễm một số lượng 4
lớn tế bào hoặc bào tử vi khuẩn để khi vào tới ruột non chúng phát triển sinh độc tố gây ngộ độc ( Salmonella). Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus cereus lại có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở cả hai dạng trên với hai thể bệnh điển hình là nôn và tiêu chảy. 1.2. Tổng quan về Bacillus cereus B. cereus thuộc nhóm 1 chi Bacillus. Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường sống, chúng mang đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, tế bào có dạng hình que, hô hấp hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43]. Hiện nay, có khoảng trên 100 loài thuộc chi này đã được miêu tả, một số loài có ứng dụng trong công nghiệp (sản xuất emzym) hoặc trong nông nghiệp (sản xuất thuốc trừ sâu sinh học), một số loài lại gây bệnh cho người và động vật. Các loài gây bệnh quan trọng thường nằm trong nhóm Bacillus cereus (nhóm 1 chi Bacillus) gồm Bacillus cereus, Bacillus myco¿des, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium và mới đây có thêm hai loài là Bacillus weihenstephanensis và Bacillus pseudomyco¿des được phát hiện [38]. Các loài trong nhóm này có độ tương đồng về trình tự 16S, 23S rất cao và chúng có % (G + C) tương đồng khoảng 31%-41%. Đây chính là những đặc điểm quan trọng để phân loại chúng thuộc nhóm Bacillus cereus [43]. Trong các loài thuộc nhóm B. cereus có liên quan tới an toàn thực phẩm và sức khoẻ con người thì B. thuringiensis được biết đến như là một loài vi khuẩn có khả năng hình thành protein tinh thể độc có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, B. anthracis là tác nhân gây bệnh than. Ngoài ra, B. cereus, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis thường được tìm thấy trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm bị hỏng [14]. Trong số đó, B. cereus là nguyên nhân chủ yếu và quan trọng nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm. 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus B. cereus được Frankland phân lập đầu tiên vào năm 1887 từ không khí tại một chuồng bò [64]. Năm 1906 ở Châu Âu, 300 người bệnh được đưa vào 5
bệnh viện với những triệu chứng của bệnh đường ruột do ăn phải món thịt băm bị nhiễm số lượng lớn một loại vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, hình que được gọi tên là Bacillus peptonificans. Sau này nó được đổi tên là Bacillus cereus [61,64]. Từ năm 1926 đến năm 1929: Theo thông báo có hai vụ ngộ độc liên quan tới một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus hiếu khí có trong nước sốt vani và món thịt đông.Từ năm 1936 đến năm 1943: Trong 367 vụ ngộ độc ở thành phố Stockholm thì có 117 vụ nguyên nhân là do Bacillus spp. Tuy nhiên do chưa có những hiểu biết rõ ràng về B. cereus nên chưa thể khẳng định rõ vai trò của chúng trong các vụ ngộ độc trên [61]. Năm 1950, Steinar Hauge nhà khoa học người Na Uy với những thí nghiệm đặc biệt đã khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và là tác nhân gây bệnh cho con người. Để cung cấp bằng chứng khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, Hauge đã chứng minh bằng cách uống môi trường nuôi cấy B. cereus. Ông đã nuôi chúng tới mật độ 4.106 tế bào /g và uống 200ml. Sau 13 giờ, ông cảm thấy đau bụng dữ dội và bị tiêu chảy ra nước. Đó là những thí nghiệm đầu tiên về loại B. cereus gây tiêu chảy. Năm 1954, một số cuộc thí nghiệm với những người tình nguyện ở Mỹ đã thất bại trong việc xác nhận lại những thí nghiệm của Hauge. Đến năm 1969, những vụ ngộ độc thực phẩm do B. cereus đầu tiên đã được công bố ở Mỹ [64]. Năm 1971, 20 năm sau khi B. cereus được công nhận là tác nhân gây ra thể bệnh tiêu chảy, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một loại ngộ độc khác gây ra bởi B. cereus được gọi là typ gây nôn. Loại B. cereus gây nôn được phát hiện sau 6 vụ ngộ độc xảy ra ở Anh với các triệu chứng buồn nôn và nôn mửa sau khi ăn món cơm rang của một nhà hàng Trung Quốc [61,64]. Từ đó đến nay rất nhiều viện nghiên cứu của các nước trên thế giới đã và đang tiến hành nghiên cứu về B. cereus cũng như các độc tố của chúng nhằm tìm ra các 6
phương pháp phát hiện nhanh chính xác vi khuẩn này trong các loại thực phẩm, góp phần giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm do nó gây ra. Ở Việt Nam hiện nay, chưa có những nghiên cứu cụ thể, chi tiết về B. cereus mặc dù một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus khác đã được nghiên cứu kỹ như B. thuringiensis, B. antharcis… 1.2.2. Đặc điểm hình thái B. cereus thuộc chi Bacillus, là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43]. Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus thì Bacillus cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3-5 ỡm, rộng 1-1,2ỡm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B. cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động. B. cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1-1,5ỡm, bào tử nang không phồng. Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối (Hình 1.1) [61,64]. A B Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B. cereus 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy B. cereus có thể sinh trưởng, phát triển ở dải nhiệt độ, pH rất rộng. Chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 4-5ºC trong khi đó một số chủng lại có thể phát triển ở nhiệt độ 55ºC. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của B. cereus là 30- 37ºC. Độ pH biến thiên từ 4,3-9,3; pH tối ưu là 7-7,2. Độ hoạt động của nước > 0,92. B. cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7- 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [23,37,61,64]. B. 7
cereus phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí. Tuy nhiên, quá trình sản sinh độc tố đặc biệt là độc tố gây nôn sẽ không xảy ra ở nhiệt độ 40ºC cũng như trong điều kiện kỵ khí [28,33,36]. Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP (manitol-yolk- polimyxin) trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7-7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B. cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzym lecithinase) [22,23,37,63]. Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA (meat- pepton-agar), khuẩn lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4-0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,43]. Hình 1.2: Khuẩn lạc B. cereus trên môi trƣờng thạch huyết Trên môi trường thạch máu cừu, B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết (Hình 1.2). Đây là một đặc điểm được sử dụng để phân biệt B. cereus và B. anthracis do B. anthracis không có khả năng sinh haemolysin. Haemolysin là một trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. cereus [23,37]. 1.2.4. Đặc điểm sinh trưởng Đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. cereus nói riêng đó là khả năng hình thành bào tử. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể 8
tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất. Vì vậy, khả năng lây nhiễm B. cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn. Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng, khô hạn… B. cereus sẽ sinh nội bào tử. Nội bào tử nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài. Khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu …, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất. Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất lợi nội bào tử lại được hình thành [2]. Bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng [62,64]. Ở thể sinh dưỡng B. cereus, dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao thì bào tử của nó lại có khả năng kháng lại nhiệt độ cao. Trong sữa, bào tử B. cereus có thể chịu đựng được nhiệt độ 100ºC trong 2-3 phút trong khi đó các quá trình thanh trùng sữa thường chỉ xảy ra tại nhiệt độ 70-80ºC trong vài phút; trong thực phẩm có nồng độ axít thấp (pH>4,5) B. cereus có thể chịu được khoảng 5 phút [61]. Đặc biệt, trong thực phẩm có hàm lượng lipit cao như trong dầu đậu nành thì bào tử B. cereus có thể chịu được nhiệt độ 121ºC trong 30 phút [62]. Vì vậy, trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B. cereus. Ngoài ra, bào tử B. cereus còn chịu được tia bức xạ cao hơn tế bào sinh dưỡng. Nếu ta có thể tiêu diệt được 90% tế bào sinh dưỡng B. cereus ở 0,17- 0,65 kGy thì để tiêu diệt được 90% bào tử B. cereus thì cường độ bức xạ phải là 1,25- 4 kGy. Đặc biệt, bào tử B. cereus kỵ nước hơn bào tử của các loài Bacillus spp. Do vậy, chúng có thể bám chặt vào bề mặt của những dụng cụ, máy móc dùng cho quá trình chế biến thực phẩm 9
[12]. Điều này chứng tỏ bào tử B. cereus không chỉ nhiễm từ thực phẩm mà còn từ những dụng cụ chế biến hay đựng thực phẩm và bất cứ lúc nào chúng cũng có thể gây nguy hiểm cho an toàn sức khoẻ con người. 1.2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá B. cereus có rất nhiều đặc điểm sinh lý, sinh hoá giống với một số loài thuộc nhóm Bacillus cereus. Bảng 1 sau đây tóm tắt một số đặc điểm chính để phân biệt một số loài thuộc nhóm 1 chi Bacillus này: Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus B. B. B. B. B. Đặc điểm cereus thuringiensis myco¿des anthracis megaterium Nhuộm Gram + + + + + Phản ứng catalase + + + + + Khả năng chuyển +/- +/- - - +/- động Phản ứng khử + +/- + + - nitrate Kháng lysozyme + + + + - Phản ứng với + + + + - lòng đỏ trứng Lên men glucose + + + + - kỵ khí Phản ứng VP + + + + - Sinh axít từ - - - - + manitol Sinh hemolysin + + + - - Sinh tinh thể độc - + - - - Chú thích: +: phản ứng dương tính ư: phản ứng âm tính +/-: 50-50% phản ứng dương tính 10
Bảng 1 cho thấy 4 loài B. cereus, B. thuringiensis, B. myco¿des, B. anthracis có những đặc điểm sinh lý, sinh hoá rất giống nhau chỉ có B. megaterium là có nhiều đặc điểm khác hơn cả. Tuy nhiên, trong 4 loài đó thì mỗi loài vẫn có những đặc điểm riêng: B. myco¿des có khả năng hình thành khuẩn lạc hình rễ cây trên môi trường dinh dưỡng cơ bản, trong khi đó B. anthracis lại không có khả năng chuyển động và không sinh haemolysin. Trên môi trường thạch huyết B. anthracis vẫn có khả năng hình thành khuẩn lạc có kích thước 0,3-0,5cm nhưng không phân giải huyết, B. thuringiensis có khả năng sinh protein tinh thể độc. Trong khi đó, B. cereus lại có khả năng chuyển động và phân giải huyết rất mạnh, không hình thành khuẩn lạc dạng rễ cây và không có khả năng sinh protein tinh thể độc [37]. 1.2.6. Đặc điểm huyết thanh học Hiện nay theo một số nghiên cứu, B. cereus có 13 kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên O) và giống như B. thuringiensis, B. cereus cũng có kháng nguyên tiêm mao (kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử dụng cho phân loại B. cereus. 23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới các thể bệnh gây ra bởi B. cereus. Các nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết thanh 1,2,6,8,10,12 và 19 thường liên quan tới các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu chảy còn các nhóm huyết thanh 1,5,8,12,19 của B. cereus lại liên quan tới những vụ ngộ độc thể nôn. Trong đó, typ huyết thanh H1 thường chiếm ưu thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [23,61]. Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B. cereus 11