Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp Enzyme Chitinase

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp Enzyme Chitinase cao tập trung khảo sát khả năng sinh Enzyme Chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ; nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng thu được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp Enzyme Chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------- Nguyễn Thị Hà TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CAO Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2011
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học của tôi - Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố Tác giả luận văn
LỜI CÁM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy là giảng viên khoa sinh học trường Đại học su phạm TP HCM, người đã định hướng đề tài cho tôi, quan tâm, giúp đỡ và thông cảm cho hoàn cảnh của tôi. Người đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi, đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn TS. Dương Thị Hương Giang là giảng viên giảng dạy môn Enzyme học, viện công nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, người đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin cám ơn các em sinh viên: Phạm Thị Mỹ Ánh, Cao Thị Mỹ Phương, Nguyễn Huỳnh Trang Thu Hương, Nguyễn Trần Khiết lớp Công nghệ sinh học tiên tiến K33, Quang Anh Thư, Trần Kim Thoa, Vương Thị Hồng Thắm lớp Sư phạm Sinh học K34 đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong quá trình thực nghiệm và tổng hợp kết quả. Tôi xin cám ơn cha mẹ, chồng và các người thân của tôi, những người đã chăm sóc cho con tôi, và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình đi học và thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011 Nguyễn Thị Hà
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................................ 2 15T 15T LỜI CÁM ƠN ...................................................................................................................................... 3 15T T 5 1 MỤC LỤC ........................................................................................................................................... 4 15T T 5 1 DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................................................... 8 15T 15T MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1 15T T 5 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................. 2 15T 15T 1.1. NS trong hệ sinh thái RNM ...................................................................................................... 2 15T 15T 1.1.1. Giới thiệu về RNM ............................................................................................................. 2 T 5 1 15T 1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM .......................................................................................... 3 T 5 1 T 5 1 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................................... 3 T 5 1 15T 1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản ........................................................................................................ 4 T 5 1 15T 1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa .......................................................................................... 4 T 5 1 T 5 1 1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi ......................................................................................... 7 T 5 1 T 5 1 1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM ........................................................................ 9 T 5 1 T 5 1 1.2. 15T Chitin và chitinase ................................................................................................................ 10 15T 1.2.1. Nguồn chitin: ................................................................................................................... 10 T 5 1 15T 1.2.2. Chitinase ........................................................................................................................... 13 T 5 1 15T 1.2.2.1. Nguồn chitinase: ........................................................................................................ 13 T 5 1 15T 1.2.2.2. Cơ chế hoạt động: ...................................................................................................... 13 T 5 1 15T 1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase: .................................................................. 14 T 5 1 T 5 1 1.2.2.4. Tính chất sinh hóa của chitinase ................................................................................. 14 T 5 1 T 5 1 1.2.2.5. Phân loại chitinase ..................................................................................................... 15 T 5 1 15T 1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase .............................................................................................. 16 T 5 1 15T 1.2.3. NS với khả năng sinh enzyme chitinase ........................................................................... 19 T 5 1 T 5 1
1.2.3.1. Một số chủng NS có HT chitinase cao........................................................................ 19 T 5 1 T 5 1 1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chitinase ở NS ............................................... 20 T 5 1 T 5 1 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngoài nước ............................................ 21 15T T 5 1 1.3.1. Ngoài nước...................................................................................................................... 21 T 5 1 15T 1.3.2. Trong nước....................................................................................................................... 24 T 5 1 15T Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................................. 25 15T T 5 1 2.1. Vật liệu .................................................................................................................................... 25 15T T 5 1 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 25 T 5 1 15T 2.1.2. Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ ......................................................................... 25 T 5 1 T 5 1 2.1.3. Môi trường ....................................................................................................................... 26 T 5 1 15T 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................................... 27 15T 15T 2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống .......................................................................................... 27 T 5 1 T 5 1 2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi ...................................................................................... 27 T 5 1 T 5 1 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS .............................................................. 28 T 5 1 T 5 1 2.2.4. Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5] ............................................................. 28 T 5 1 T 5 1 2.2.5. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL ............... 29 T 5 1 T 5 1 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase ................................. 29 T 5 1 T 5 1 2.2.7. Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy .......................................... 29 T 5 1 T 5 1 2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường T 5 1 kính vòng phân giải ................................................................................................................... 30 15T 2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu ................ 30 T 5 1 T 5 1 2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8] ............................................................................. 33 T 5 1 T 5 1 2.2.11 Khảo sát MT và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase của các chủng T 5 1 NS. [4], [10], [23], [32], [33] ...................................................................................................... 35 15T 2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong MT nuôi cấy ..................................... 35 T 5 1 T 5 1 2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy....................................................................................... 35 T 5 1 T 5 1
2.2.11.3. Khảo sát pH của MT ................................................................................................ 35 T 5 1 15T 2.2.11.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ....................................................................................... 36 T 5 1 T 5 1 2.2.11.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl .................................................................... 36 T 5 1 T 5 1 2.2.11.6. Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin ........................................................................... 36 T 5 1 T 5 1 2.2.12. Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P. citrinum bằng qui hoạch thực nghiệm [10], [17]..... 36 T 5 1 T 5 1 2.2.13. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum [4], [43], [44] ............. 39 T 5 1 T 5 1 2.2.13.1. Thu nhận tủa protein ................................................................................................ 39 T 5 1 15T 2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CPE chitinase thô [9] ......................... 39 T 5 1 T 5 1 2.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của chitinase ..................................................... 39 T 5 1 T 5 1 2.2.14. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của T 5 1 chế phẩm enzyme chitinase [4], [20] .......................................................................................... 40 T 5 1 2.2.15. Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm T 5 1 [4], [46]....................................................................................................................................... 41 T 5 1 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................................... 42 15T T 5 1 3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ 15T T 5 1 ........................................................................................................................................................ 42 3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng thu được ................................................. 43 15T T 5 1 3.2.1. Chủng nấm số 16 ............................................................................................................. 43 T 5 1 15T 3.2.2. Chủng nấm số 10 ............................................................................................................. 45 T 5 1 15T 3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 15T chủng NS P. citrinum và A. protuberus ......................................................................................... 47 T 5 1 3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuôi cấy ................................................................... 47 T 5 1 T 5 1 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .................................................................................. 48 T 5 1 T 5 1 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy ............................................................................. 51 T 5 1 T 5 1 3.3.6. Ảnh hưởng của HL chitin trong MT nuôi cấy ................................................................. 53 T 5 1 T 5 1
3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả T 5 1 năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum ................................................................ 55 T 5 1 3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum ........................................ 58 15T T 5 1 3.4.1. Thu nhận CP chitinase thô bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 ......................................................... 58 T 5 1 R R R R R R1 T 5 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase ............................................ 58 T 5 1 T 5 1 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thô ........................................... 60 T 5 1 T 5 1 3.5. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thô để phòng trừ nấm hại cây trồng ........ 62 15T T 5 1 3.5.1. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani. 62 T 5 1 T 5 1 3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm 64 T 5 1 T 5 1 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 66 15T T 5 1 4.1. Kết luận ................................................................................................................................... 66 15T T 5 1 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................................. 67 15T T 5 1 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................. 67 15T 15T PHỤ LỤC........................................................................................................................................... 74 15T T 5 1 PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE ............................................................... 74 15T T 5 1 PHỤ LỤC 2 – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD ..................................................................... 75 15T T 5 1 PHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM ............................................................................... 76 15T T 5 1 PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH ................................................................................................ 77 15T 15T PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU .......................................... 79 15T T 5 1
DANH MỤC VIẾT TẮT BT: bào tử BSA: Bovine serum albumin CPE: chế phẩm enzyme DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit HT: hoạt tính HTC: hoạt tính chung HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lượng KL: khuẩn lạc MT: môi trường NC: nuôi cấy OD: mật độ quang ∆OD: hiệu số giữa mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu thật PTHQ: phương trình hồi qui RNM: rừng ngập mặn U: đơn vị hoạt độ enzyme TTN: thuốc trừ nấm
MỞ ĐẦU RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt ở đây đã làm cho sinh vật, cũng như NS có tính thích nghi cao và tạo ra sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với điều kiện khác. Hệ vi sinh vật ở đây rất đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất có HT sinh học như các loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… và chất kháng sinh để có thể phân hủy các chất có trong hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ô nhiễm. Một trong những nguồn rác thải dồi dào ở RNM đó là các loại vỏ của động vật chân khớp ở biển như: tôm, cua, ghẹ…có thành phần chủ yếu là chitin. Chitin là chất khó phân hủy. Có thể sử dụng nhiều biện pháp hóa lý khác nhau để phân hủy chitin nhưng chi phí rất cao. Hiện nay người ta đã nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm… nhưng chỉ có enzyme chitinase do vi sinh vật tổng hợp đặc biệt là do nấm tổng hợp mới có HT cao, ổn định với nhiệt độ và pH. Ngoài ra enzyme chitinase còn có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học. Khả năng khử chitin làm cho chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm MT. Chitinase được khai thác sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinh học. Chúng cũng có vai trò quan trọng trong sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất các chitooligosaccharid hoạt hóa. Trong vitro những thí nghiệm thử HT kháng nấm bằng cách sử dụng Trichderma harzianum đã làm phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides. Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn một số chủng NS từ RNM Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao” Mục tiêu của đề tài: Góp phần tìm hiểu đặc điểm và vai trò của enzyme chitinase từ các chủng NS có nguồn gốc từ RNM Cần Giờ làm cơ sở cho việc ứng dụng trong thực tiễn Nhiệm vụ của đề tài 1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM. Chọn ra 2 chủng có khả năng sinh enzyme chitinase cao 2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài 2 chủng thu được
3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS đã chọn. Chọn ra 1 chủng NS có HT enzyme chitinase cao để tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm. 4. Thu nhận và nghiên cứu một số đặc điểm của CPE chitinase thô 5. Bước đầu thử nghiệm tác dụng chế phẩm chitinase thô trong phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng Địa điểm và thời gian nghiên cứu Nghiên cứu nội dung 1 tại PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM Nghiên cứu nội dung 2 tại Phòng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp. HCM Nghiên cứu nội dung 3,4,5 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 4 năm 2011 đến tháng 9 năm 2011 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NS trong hệ sinh thái RNM 1.1.1. Giới thiệu về RNM * Giới thiệu chung về RNM Diện tích RNM trên thế giới khoảng 15.429.000 ha. Khu vực châu Á có diện tích RNM lớn nhất là Ấn Độ-Thái Bình Dương với diện tích khoảng 6.9 triệu ha. Nước có diện tích RNM lớn nhất châu Á là Bangladet với 600.000 ha. Việt Nam có 252.500 ha RNM phân bố ở cả 3 miền: bắc, trung, nam RNM được hình thành nhờ phù sa do các con sông cùng với trầm tích biển do thủy triều mang vào tạo thành các bãi lầy. RNM chịu tác động của cả biển lẫn lục địa nên tài nguyên sinh vật rất đa dạng phong phú và chính sự tác động này đã làm cho sinh vật có những cơ chế tồn tại rất đặc biệt RNM có những vai trò hết sức quan trọng: Hạn chế tác hại của song thần và bão lớn, bảo vệ đê biển, làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều cường, bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ
nước ngầm, làm sạch MT nước khi có lũ quét, sạt lở đất, cung cấp nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu và lợi ích của con người * Giới thiệu về RNM Cần Giờ - Tp HCM RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn, nằm ở cửa ngõ đông nam thành phố Hồ Chí Minh. Thuộc xã Long Hòa, huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. RNM có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa thấp. Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ dao động nhiệt P P trong ngày 5-70C, thời điểm có nhiệt độ cao nhất: tháng 12, tháng 1. Độ mặn trung bình: 1,5 – 2,5 %, P P tùy theo khu vực có thể lên đến 18%, độ mặn phụ thuộc vào thủy triều của biển đông và lưu lượng nước sông Đồng Nai, sông Sài Gòn. Độ mặn lớn nhất khi triều cường, nhỏ nhất khi triều kém Hệ sinh vật: thực vật trên 150 loài, động vật thủy sinh không xương sống trên 700 loài, cá trên 137 loài, động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài động vật có vú, chim có khoảng 130 loài. Vi sinh vật gồm nấm men, NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… vi sinh vật có vai trò hết sức quan trọng đối với hệ sinh thái RNM. Vi sinh vật phân bố rộng rãi và có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Nhiều vi sinh vật có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên cho đến nay những nghiên cứu về vi sinh vật ở RNM còn rất ít, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của hệ vi sinh vật RNM 1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái NS là nhóm có cấu tạo tế bào nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ ngoài vào trong gồm: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và nhân phân hóa. Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng gọi là neocercosporin Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên cơ quan sinh sản, đó chính là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành BT là một tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu. Mỗi loài nấm có hình dạng BT và màu sắc BT có khác nhau. Chính màu sắc của BT đã tạo nên màu sắc của các KL và màu sắc đặc trưng của các chi và loài nấm. Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10µm, đôi khi rất lớn tới 25µm nhưng cũng có khi rất nhỏ chỉ 1-2µm. Chiều dài sợi nấm có thể đạt vài chục centimet. Sợi nấm có thể có vách ngăn tạo thành dạng đa bào, tuy nhiên do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào có thể có một, hai nhiều nhân hay chẳng có nhân nào. Sợi nấm cũng có thể không có vách ngăn, bên trong sợi nấm chứa nhiều nhân được gọi là các tế bào đa nhân, gặp ở các lớp Trichomycetes, Oomycetes
Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên cơ quan sinh sản là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành nên các BT. BT là một tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu. Khi BT được phân tán từ cơ thể mẹ đến nguồn cơ chất thích hợp nó sẽ nảy mầm, phát triển theo cả 3 chiều tạo thành hệ sợi nấm mới. Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên rất nhiều tạo thành một đám, ta có thể quan sát bằng mắt thường. Hệ sợi nấm phát triển đến giai này được gọi là KL. Tùy theo loài mà KL có các hình dạng khác nhau nhưng thường có hình cầu. Sau một thời gian, trên các sợi nấm khí sinh sẽ hình thành các BT có hình dạng và màu sắc khác nhau đặc trưng cho từng loài 1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản NS có nhiều hình thức sinh sản, trong đó chủ yếu là hình thức sinh sản bằng BT. Sau đây là một số hình thức sinh sản ở NS: Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính theo kiểu đứt đoạn, sinh sản vô tính bằng BT áo, sinh sản vô tính bằng BT kín, sinh sản vô tính bằng BT đính Sinh sản hữu tính: sinh sản hữu tính bằng BT túi (Ascospore), sinh sản hữu tính bằng BT đảm (Basidiospore), sinh sản hữu tính bằng BT noãn (Oospore), sinh sản hữu tính bằng BT tiếp hợp (Zigospore). 1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa - Sinh lí: Các loài sinh vật nói chung và NS nói riêng có sự sinh trưởng, phát triển và đặc điểm phân bố phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố MT. RNM là một hệ sinh thái chịu nhiều tác động của gió bão, chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền (chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp) lẫn chất thải từ MT biển…Vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh. Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS ở RNM. Nhiệt độ: NS thuộc nhóm VSV ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 200C – 500C, cá P P P P biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 00C và 600C. P P P P pH: là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của NS, NS phát triển tốt ở MT hơi axit (pH = 4 – 6). Tuy nhiên cũng có một số loài phát triển ở pH < 3 hay pH < 9 (Ingold, 1967). pH làm thay đổi tính chất của màng tế bào và làm ảnh hưởng đến sự phân ly của các cấu tử thức ăn trong MT. Do đó, sự hấp thu các loại thức ăn vào trong tế bào bị thay đổi. MT có pH quá cao hay quá thấp đều làm cho sự sinh trưởng của NS yếu đi.
Ánh sáng: ánh sáng không cần cho quá trình sinh trưởng của hầu hết các loài NS, nhưng ánh sáng lại ảnh hưởng đến sự hình thành BT của một số loài nấm Khí oxi: nồng độ oxi rất cần cho hoạt động sống của NS vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc. Nguồn C: cơ thể nấm không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng và phải sống kí sinh, hoại sinh hay cộng sinh. Chúng là những VSV dị dưỡng hóa năng hữu cơ. NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau, ngoài những đường đơn dễ hấp thụ như glucose chúng cũng sử dụng trực tiếp các đường như mantose, saccarose… Nguồn N: N đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia thành phần cấu tạo của các protein và đặc biệt là enzyme. NS có khả năng đồng hóa cả nguồn N hữu cơ lẫn vô cơ, các chủng NS khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn N. Độ mặn: Đa số các NS ở RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 2% - 20%. Thậm chí một số NS ở RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30%. Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM. - Sinh hóa [1] Trong quá trình sinh trưởng và phát triển NS tiết ra MT ngoài nhiều sản phẩm như các sắc tố, các chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm, trong đó nhiều chất có HT sinh học có ý nghĩa quan trọng đối với con người cũng như hệ sinh thái như các các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng sinh… MT sống khắc nghiệt ở RNM làm cho kiểu trao đổi chất của chúng khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất của chúng, trong đó đặc biệt là hệ enzyme cũng mang tính chất khác lạ hơn HT enzyme thủy phân ngoại bào NS là nhóm VSV có tiềm năng lớn nhất sinh các enzyme thủy phân ngoại bào. Đa phần các enzyme dùng trong công nghiệp có nguồn gốc từ NS. Cellulase: là enzyme ngoại bào có khả năng cắt đứt liên kết 1–4 β - glucosid của phân tử cellulose để tạo thành các đơn phân glucose. Cellulose là thành phần chủ yếu trong xác thực vật do đó enzyme này có vai trò quan trọng trong việc phân giải những hợp chất hữu cơ tồn đọng trong MT. Enzyme này được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như thức ăn gia súc, công nghiệp thực phẩm nhờ khả năng phân giải cellulose. Những NS có khả năng phân giải cellulose là các nấm thuộc chi
Aspergillus (Asp.niger, Asp.flavus, Asp.oryzae…), Fusarium (F.oxysporum, F.solani), Penicillium, Trichoderma… Amylase: là enzyme thủy phân tinh bột và những chất có cấu trúc tương tự. Vì tinh bột cũng là một trong những sản phẩm chủ yếu của thực vật nên vai trò của amylase cũng giữ một vị trí hết sức quan trọng trong việc phân giải các sản phẩm với thành phần chủ yếu là tinh bột và góp phần trong việc làm sạch MT. Những NS có khả năng phân giải mạnh tinh bột là Asp.candidus, Asp.awamori….Cũng như cellulose, dựa vào đặc tính phân giả mạnh tinh bột mà amylase được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực sản xuất rượu, bia, bánh mì… Protease: là enzyme thủy phân liên kết peptid trong các polypeptide tạo thành các chuỗi polypeptide ngắn hơn, các đipeptide hay các axit amin. Trong tự nhiên enzyme này có tác dụng khoáng hóa: phân giải các hợp chất hữu cơ có bản chất protein trong xác động thực vật và sinh vật nói chung thành các hợp chất đơn giản và cuối cùng thành các phân tử vô cơ. Con người đã ứng dụng enzyme này trong các lĩnh vực của đời sống như công nghiệp thịt, da, tơ tằm … nhằm tận dụng khả năng phân giải protein của chúng cũng như tận dụng những sản phẩm từ quá trình phân giải đó. Những NS có khả năng sinh protease mạnh là nhóm mốc vàng (Asp.flavus, Asp.oryzae, Asp.funginatus…) và nhóm mốc đen (Asp.niger, Asp.awmori, Asp.usamii…) Pectinase: là enzyme xúc tác quá trình phân giải pectin thành các hợp chất đơn giản như galacturonic, galactose, methanol….được ứng dụng trong sản xuất nước quả, rượu vang, hoặc trong sản xuất cà phê hòa tan, chế biến đay gai…Những NS có khả năng sinh pectinase cao được chú ý là P.glaucum, Asp.awamori, P.citrinum… Chitinase: Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucoszamine liên kết với nhau bởi mối liên kết β - 1,4 – glucosid. Hàng năm trong tự nhiên có thể tạo 1010 – 1014 tấn chitin. P P P P Chitinase bị VSV (chủ yếu là NS) phân giải liên kết β - 1, 4 – glucosid tạo ra các N-acetyl- glucoszamine. Hệ chitinase mạnh còn giúp các NS (Trichoderma spp., Glyocladium spp., Chaetomium spp.) tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh (Fusarium oxysporium, Botritiscinerea, Pyricularia oryzae… có thành tế bào là chitin) và các loài nấm B. bassiana, M. anisopliae, P. fumosoroseus… chống các loài côn trùng có vỏ chitin. Các NS này được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng trong nông – lâm nghiệp.
VSV nói chung và NS nói riêng thường không có khả năng tạo được tỉ lệ cân đối giữa các enzyme, có loài tạo được nhiều enzyme này, loài khác lại tạo nhiều enzyme khác. Các loài nấm thường có HT amylase và chitinase rất mạnh [6][7] HT sinh các chất kháng sinh: Chất kháng sinh là một trong số những sản phẩm trao đổi chất bậc hai do NS sản xuất ra. Hiện có rất nhiều công trình nghiên cứu vai trò của chất kháng sinh đối với đời sống. Tuy nhiên, hiện có hai giả thiết về vai trò của chất kháng sinh được nhiều nhà khoa học ủng hộ hơn cả. Giả thuyết thứ nhất cho rằng việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo khả năng sống sót cao cho chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là với các loài có BT. Người ta đã xác định được một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sự nảy mầm của BT chính chủng sinh ra chất kháng sinh đó. Có thể chất kháng sinh có vai trò kìm hãm sự nảy mầm của BT cho đến khi điều kiện MT ngoài hoàn toàn thích hợp cho sự phát triển của chúng. Giả thiết thứ hai cho rằng việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó. Gần đây người ta phát hiện ra NS ở RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất kháng khuẩn và enzyme đặc biệt là chitinase có ý nghĩa lớn cho sự tồn tại của thực vật chịu mặn Độc tố nấm: Một sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm đáng được quan tâm đó là độc tố nấm (mycotoxin). Đây là một trong số những mối nguy hại lớn cho sức khỏe con người và động vật khi sử dụng thức ăn có chứa một HL độc tố nhất định hoặc ăn phải nấm có khả năng sinh độc tố. Hiện có trên 300 loại độc tố nấm đã được con người phát hiện. Trong số đó, nguy hiểm nhất là aflatoxin, đặc biệt là aflatoxin B1. Phần lớn các NS ở RNM đều có khả năng sản sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại như chất kháng sinh, độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng trong quá trình cạnh tranh của đời sống. Một số NS còn có HT diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một cách an toàn. Đây là một nguồn gen quý, rất có giá trị đối với sinh học và y học. Kết luận: Với những đặc điểm đáng chú ý như trên, NS đang trở thành đối tượng rất được quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác triệt để những đặc tính sinh học quý phục vụ cho đời sống con người. 1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi
Hiện nay có hai phương pháp được sử dụng phổ biến là phương pháp phân loại truyền thống và phương pháp phân loại hiện đại bằng sinh học phân tử. *Phương pháp truyền thống: Chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Dayal (1975) đã dựa vào 7 đặc tính để phân loại nấm sợi: đặc điểm hình thái, ký chủ đặc thù, đặc điểm sinh lý, đặc điểm tế bào học, đặc điểm di truyền học, đặc điểm kháng huyết thanh, đặc tính sinh hóa và phân loại số học. Có nhiều khóa phân loại được sử dụng như: Saccardo P.A (1880 – 1886), Baron G.L (1968), Hughes S.T (1953), Ellis M.B (1971), Ainsworth G.C (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1986), Barnett H.L và cộng sự (1972), Nguyễn Lân Dũng (2000), Samson (2004) * Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Đây là phương pháp kỹ thuật rất hiện đại và tương đối mới mẻ. Các thao tác cơ bản được sử dụng là kĩ thuật thu nhận DNA, chạy PCR và giải trình tự axit nucleic. Thu nhận DNA Yêu cầu của kỹ thuật này là phải thu được các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi tác nhân hóa học và cơ học. Ba bước cơ bản của kĩ thuật DNA : Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. Thu nhận axit nucleic. Làm kết tủa axit nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu nhận các axit nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản. Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) Nguyên tắc Khuếch đại một trình tự DNA lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1 (biến tính) Trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 940C – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút. P P P P
Bước 2 (lai) Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 400C – 700C và kéo dài trong vòng 30 giây – 1 phút. P P P P Bước 3 (tổng hợp) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C là nhiệt độ mà DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian P P của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Giải trình tự axit nucleic Các phương pháp xác định trình tự axit nucleic đều dựa trên 2 nguyên tắc: Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert) Dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước hơn kém nhau một nucleotid. Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger) Quá trình tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase bên cạnh nguồn nguyên liệu là các đơn phân nucleotic còn được bổ sung thêm các đơn phân dideoxinucleotid. Kết quả là quá trình kéo dài chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại khi có một dideoxinucleotid tham gia vào chuỗi. Từ đó dẫn đến việc tổng hợp ra được một nhóm gồm nhiều đoạn DNA có kích thước hơn kém nhau một nucleotide. Sau đó, các phân đoạn DNA được điện di trên gel polyacrylamid. Dựa trên kết quả điện di người ta có thể xác định được trình tự của đoạn DNA cần thiết. So sánh đối chiếu với trình tự gen trong ngân hàng gen để xác định loài. 1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM Với đặc điểm riêng của NS ở RNM, chúng đã mang lại nhiều vai trò mang tính quyết định đối với hệ sinh thái RNM. Trong điều kiện của RNM – nơi mà nguồn dinh dưỡng chủ yếu là các biopolymer của sinh khối thực vật RNM và động vật biển thì các NS chính là tác nhân tham gia tích cực vào quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp này, là mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa của RNM. Cụ thể hơn, nhờ hệ thống các enzyme ngoại bào mạnh như amylase, cellulase, protease,…chúng phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan, cung cấp chất
dinh dưỡng và năng lượng cho cả hệ sinh thái. Các chức năng trên có thể kể đến như việc NS ở RNM phân hủy mùn bã hữu cơ thành nguồn thức ăn khoáng để nuôi dưỡng cây ngập mặn và tảo phù du, phân hủy các phần rơi rụng của cây ngập mặn thành mùn bã hữu cơ tạo nguồn thức ăn cho các động vật tiêu thụ cấp 1. Bản thân NS ở RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ và ấu trùng của một số loài (Odum, 1980; Alogi, 1989). NS ở RNM cũng là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho các VSV hóa dị dưỡng khác, từ đó làm giàu quần thể VSV [6]. NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng. Bên cạnh vai trò làm sạch MT sống nói chung, NS ở RNM còn có vai trò làm sạch MT sinh vật với chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái. NS ở RNM chỉ có mặt ở những lá đang phân hủy khi còn tiếp xúc trực tiếp được với oxi tự do. Vì vậy, rất có thể vai trò của nấm trong quá trình phân hủy các sản phẩm rơi rụng của RNM chỉ tồn tại khi các sản phẩm này còn trôi nổi trên mặt nước hoặc gần với lớp bùn đất bề mặt RNM [6], [7]. NS có khả năng biến đổi cơ chất, điều chỉnh MT cho các cơ thể khác sử dụng [6] Tuy nhiên, các hoạt động sống của NS ở RNM lại làm giảm lượng oxi trong đất, bùn RNM do quá trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật hoặc thải vào MT một số chất độc như: ammoniac, sunfuahidro… [6], [7]. Kết luận: NS ở RNM có vai trò vô cùng quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM, có vai trò bảo vệ MT sinh thái nói chung và MT sinh thái RNM nói riêng, cũng như có vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các loài sinh vật từ đó đóng góp vào việc giữ cân bằng cho hệ sinh thái đặc biệt này. 1.2. Chitin và chitinase 1.2.1. Nguồn chitin: Chitin là một polysacharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau cellulose). Trong tự nhiên, chitin có trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao, các đơn phân của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp cho sự tái tạo và làm liền các vết thương ở da. Trong thực vật, chitin có ở vách tế bào nấm họ zygomycetes, trong sinh khối nấm mốc và trong một số loại tảo.
Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, HL chitin - chitosan chiếm khá cao từ 14 - 35% so với trọng lượng khô.Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose. Cấu trúc hoá học của chitin: Chitin (C 8 H 13 O 5 N)n là một polymer mạch dài của N-acetylglucosamine, dẫn xuất của glucose, R R R R R R trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetyl amin (-NHCOCH 3 ) (cấu trúcR R I). Như vậy chitin là poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4) glycoside. Trong đó các đơn phân của chitin cũng được đánh số như của glucose. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine). Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn trong liên kết cộng hóa trị (covalent bond) với các protein, CaCO 3 và các hợp chất hữu cơ khác. R R Hình 1.1: Cấu trúc phân tử chitin Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình: α, β, γ – chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi đơn phân (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi đơn phân này bằng mũi tên sao cho phần
đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH 2 OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH 3 , thì các cấu trúc α, β, γ- chitin R R R R được mô tả như sau: Hình 1.2: Các cấu hình của chitin α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp trong cùng một mạch, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp kề nhau giữa các mạch nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có liên kết hydro. Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucoside (H.F. Mark et al., 1965) T 8 1 Ứng dụng của chitin: Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác. Chitosan là một dạng chitin đã bị khử acetyl, nhưng không giống chitin, nó lại tan được trong dung dịch acid. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ MT như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, làm thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, màng bao hoa quả, bảo vệ MT…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamine được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp.