Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dưng được quy trình tái sinh in vitro cây Hương thảo bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THÙY DUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên, tháng 12 - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THÙY DUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, tháng 12 - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Tác giả Phạm Thùy Dung
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của chị Trần Thị Hồng - Kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại Trung tâm Thực nghiệm thực hành và chuyển giao khoa học công nghệ - Đại học Tân Trào, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Trung tâm, các kỹ thuật viên tại phòng Nuôi cấy mô đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện các thí nghiệm của luận văn thạc sĩ. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khoa học. Tác giả Phạm Thùy Dung
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii MỤC LỤC................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................... viii MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................ 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4 1.1. Cây Hương thảo .................................................................................. 4 1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo ........................ 4 1.1.2. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo ...... 4 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo ................................. 7 1.1.4. Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam .............................. 7 1.2. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro ........................................................................................................... 8 1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật........... 8 1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................... 9 1.2.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào ........................................... 10 1.3. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu và cây Hương thảo..... 11 1.3.1. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước ............................................................................... 12
iv 1.3.2. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật ................................................................................ 14 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ..................................... 15 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15 2.1.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................... 15 2.1.3. Điạ điể m và thời gian nghiên cứu ......................................................... 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16 2.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu ................................................................. 16 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro ................... 16 2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ............................................................ 19 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ...................................................................... 20 2.2.5. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu ................................................. 21 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 22 3.1. Kết quả khử trùng hạt tạo mẫu sạch ................................................... 22 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng đến hiệu quả phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi Hương thảo trong ống nghiệm ............................................................................................ 24 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên cây Hương thảo .... 24 3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo...................................... 27 3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo ..... 29 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương thảo in vitro ................................................................... 32
v 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ............................................ 34 3.5. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo .................................. 36 3.5.1. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................................................................................. 38 3.5.2. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ nách lá mầm ........... 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 40 1. Kết luận ................................................................................................ 40 2. Đề nghị................................................................................................. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 41 PHỤ LỤC
vi DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT BA: 6-Benzyladenine BAP: 6-Benzylaminopurine Cs: Cộng sự CT: Công thức DNA: Deoxyribonucleic acid ĐC: Đối chứng IAA: Indole-3-acetic acid IBA: Indole-3-butyric acid Kinetin: 6-furfurylaminopurine MS: Murashige và Skoog, 1962 NAA: Naphthalene acetic acid 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid PLBs: Protocorm like bodies (thể tiền củ) SH: Schenk và Hildebrandt, 1972
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo sau 20 ngày..............22 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây Hương thảo ..........................................................................25 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo .......................................................................................28 Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo .................................................30 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương thảo sau 4 tuần ..........................................................................................................32 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm sau 60 ngày ..............................................................34
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Hương thảo ngoài tự nhiên .................................................................... 5 Hình 2.1. Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga.......... 15 Hình 3.1. Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo trong 5 giờ .................... 23 Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng nảy mầm hạt Hương thảo.............................................................................................................. 24 Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần..................................................................... 26 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 1,5 mg/l đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo ............................................................................... 29 Hình 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần. ...................... 31 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương thảo. ................................................................................................................ 33 Hình 3.7. Cây Hương thảo in vitro trồng trong các giá thể khác nhau sau 60 ngày36 Hình 3.8: Sơ đồ Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân và từ nách lá mầm .................................................................................................................. 37 Hình 3.9. Hình ảnh quy trình nhân giống in vitro cây Hương Thảo ......................... 39 từ đoạn thân mang mắt chồi bên .................................................................................. 39
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây Hương thảo có tên khoa học là Rosmarinus officinalis L., là một loài thực vật có hoa thuô ̣c họ Hoa môi. Hương thảo là cây bản địa vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi. Tại Việt Nam cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam [26]. Hương thảo được sử dụng để làm gia vị, đuổi muỗi, trị liệu bằng xoa bóp, sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm. Các hợp chất trong cây Hương thảo được bổ sung vào kem dưỡng da, xà phòng thơm…[25]. Hương thảo tỏa mùi hương nồng ngào ngạt, lá tươi hay lá khô đều thơm. Lá và ngọn cây Hương thảo được sử dụng là chủ yếu. Lá tươi hay lá khô đều được dùng làm gia vị trong ẩm thực và chiết xuất tinh dầu, ứng dụng trong y tế, mỹ phẩm. Hương thảo có vị chát, nóng, mùi thơm nồng, giúp loại bỏ căng thẳng, tăng cường trí nhớ, giúp tinh thần sảng khoái [26]. Tinh dầu Hương thảo hỗ trợ việc tuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt hơn, giúp cải thiện trí nhớ, giúp tinh thầ n thư giañ , giảm stress... Mặc dù tinh dầu Hương thảo có nhiều công dụng tốt, nhưng hiện nay nước ta chưa cung cấp đủ nguyên liệu nên phải nhập hoàn toàn từ nước ngoài [25]. Các thành phần quan trọng nhất của Hương thảo là axit caffeic và các dẫn xuất như axit rosmarinic và axit carnosic. Những hợp chất này có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn, làm trẻ hóa làn da bằng cách cải thiện lưu thông máu, chống viêm và kích ứng da và rất hữu ích trong điều trị mụn trứng cá, viêm da, eczema và các bệnh ngoài da khác…[23],[25]. Hiện nay, cây Hương thảo đã được nhập trồng ở Việt Nam, cây sinh trưởng phát triển tốt, thích hợp được với điều kiện khí hậu nhiệt đới, cây thường được nhân giống bằng cách gieo hạt hoặc giâm cành [25]. Tuy nhiên
2 trồng bằng hạt tỉ lệ nảy mầm thấp, hạt giống phải nhập khẩ u nên giá thành cao. Nhân giống bằng giâm cành cho hệ số nhân thấp, tỉ lệ thành công cũng không cao. Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Hương thảo và thực trạng nhu cầu về giống cây Hương thảo ở nước ta, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm tạo ra được một số lượng lớn giống cây sạch bệnh, đáp ứng nhu cầu phát triển sản xuấ t ở nước ta là hết sức cần thiết, do vậy chúng tôi xây dựng đề tài luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ là: “Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng đươ ̣c quy trình tái sinh in vitro cây Hương thảo bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu điề u kiêṇ khử trùng hạt để ta ̣o mẫu sạch trong ống nghiệm; 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và sự kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ nách lá mầm; 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro; 3.4. Nghiên cứu giá thể thích hơ ̣p đưa cây ra môi trường tự nhiên. 3.5. Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, đánh giá được tác động của các giá thể đến sinh trưởng của cây con trong giai đoạn vườn ươm, là
3 cơ sở bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây dược liệu khác. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo ra được các cây con có chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh không phụ thuộc vào mùa vụ, là cơ sở cung cấp nguồn cây giống theo nhu cầu thực tiễn. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo có thể sử dụng cho các phòng thí nghiệm công nghệ tế bào để nhân giống phục vụ phát triển Hương thảo đáp ứng nhu cầu thực tiễn.
4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây Hương thảo 1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo Cây Hương thảo còn có tên gọi khác là cây Mê điệt, tên tiếng Anh là Rosemary. Cây Hương thảo thuộc chi Rosmarinus, họ Hoa môi (Lamiaceae), bộ Hoa môi (Lamiales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Hạt kín (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [26]. Hương thảo da ̣ng cây bụi nhỏ, thẳng cứng, cao từ 80 đến 150 cm, lá và hoa có mùi thơm. Thân cây thẳng đứng có nhiều nhánh dài. Hương thảo có lá đơn, mọc đối, lá dày, có mép gập xuống, không cuống, mặt trên lá có màu xanh đậm và bóng, mặt dưới lá có màu trắng và có lông tơ. Những bông hoa mọc ra từ nách lá. Hoa hình môi, có màu xanh dương dài dưới 1 cm, đài hoa hình chuông, có lông mịn, tràng hoa 2 môi, môi dưới chẻ sâu như môi của một số hoa lan. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5. Quả Hương thảo giống như hầu hết quả thuộc họ Lamiaceae, quả là một chùm gồm 4 quả khô hợp lại, màu nâu. Toàn cây có mùi rất thơm. Bộ phận sử dụng được là ngọn cây có hoa và lá [26]. 1.1.2. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo Cây Hương thảo có chứa một số hoạt chất sinh học bao gồm chất chống oxy hóa như axit carnosic và axit rosmarinic. Các hợp chất hoạt tính sinh học khác bao gồm long não (lên đến 20% trong lá Hương thảo khô), axit caffeic, axit ursolic, axit betulinic, rosmaridiphenol, và rosmanol [25],[26],[23]. Axit rosmarinic là este của axit caffeic và axit 3,4- dihydroxyphenyllactic và được xác định rộng rãi trong các loài thực vật khác nhau. Axit rosmarinic là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng
5 kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer. Trong công nghiệp thực phẩm, axit rosmarinic là thành phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là chất bảo quản tự nhiên, chất chống oxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản hải sản tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều món ăn [12], [23]. Hoạt động chống oxy hóa của axit rosmarinic mạnh hơn so với vitamin E. Hình 1.1. Cây Hương thảo ngoài tự nhiên Axit carnosic là một chất chống oxy hóa tự nhiên, được sử dụng rộng rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ phẩm... Là một phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo ra màu xanh lá cây. Lipton S. A. và Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham cho rằng axit carnosic - một thành phần có trong cây Hương thảo - axit
6 carnosic có thể có những ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến võng mạc, bao gồm thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, các bệnh về mắt. Axit carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thoái hóa và tổn thương ánh sáng gây ra trong nuôi cấy tế bào và trong các mô hình động vật gặm nhấm. Trong vài năm, nhóm của Lipton đã phát hiện axit carnosic chống tổn thương các gốc tự do trong não. Lipton và các đồng nghiệp đã thử nghiệm axit carnosic trong một mô hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - là phần mắt chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn mọi vật. Nghiên cứu cho thấy rằng loài gặm nhấm được điều trị trước bằng axit carnosic đã lưu giữ lớp võng mạc của mắt dày hơn, chứng tỏ các thụ thể cảm nhận ánh sáng đã được bảo vệ [28]. Axit ursolic là triterpenoid pentacyclic, có trong các loại trái cây và rau quả khác nhau. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng axit ursolic có tác động chống ung thư, tác dụng chống viêm, và cảm ứng apoptosis trong một số tế bào ung thư ở người. Đặc biệt, axit ursolic ức chế sự phát triển ung thư vú bằng cách gây di động G1/G2 bắt giữ và điều chỉnh sự biểu hiện của protein quan trọng trong con đường truyền tín hiệu [20]. Hương thảo có thể sử dụng theo các bài thuốc dân gian ở nước ta [29]. Bài thuốc số 1: Dùng 200g lá Hương thảo khô ngâm với 1 lít rượu trắng trên 40 độ, bảo quản trong chai thủy tinh đã được khử trùng, cất nơi khô ráo. tránh ánh nắng. Ngày uống 2 lần, mỗi lần 2ml rượu thuốc pha với nước sôi để nguội, giúp tăng cường sức khỏe, chữa căng thẳng thần kinh, tiêu hóa kém. Bài thuốc số 2: Dùng 2-3 lá Hương thảo khô hãm trong một tách nước sôi làm một liều. Ngày uống 4-5 liều. Hoặc dùng 20g lá khô (30g lá tươi) hãm với 500ml nước sôi, chia 4-5 lần để uống trong ngày. Xoa nhẹ nước hãm thuốc này lên da đầu để tăng cường sự mọc tóc, hoặc dùng để rửa các vết
7 thương nhiễm trùng và lâu khô, rửa mắt 3-4 ngày lần trong ngày khi bị viêm giác mạc nhẹ. Bài thuốc số 3: Tinh dầu Hương thảo pha vào nước tắm 3-4 giọt giúp tinh thần sảng khoái, thư giãn cơ thể, giảm stress. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo Cây Hương thảo phát triển tốt nhất ở Địa Trung Hải hay ở những nơi có khí hậu tương tự. Hương thảo chịu hạn tốt, thích hợp với đất mùn bở ẩm, không thích hợp với đất sét. Cây Hương thảo cũng cần thoát nước tốt, nên trồng ở môi trường không có sương giá có ánh nắng mặt trời chiếu 6-8 giờ để cây phát triển tốt. Nếu trồng bằng hạt nên trồng vào mùa xuân. Các hạt giống sẽ bắt đầu nảy mầm khoảng 14-21 ngày sau khi trồng. Đối với nhân giống bằng giâm hom, chọn những nhánh khỏe mạnh trên cây mẹ, cắt mỗi hom dài 5-10cm, tỉa lá sát gốc. Có một số loài sâu bệnh có thể ảnh hưởng đến cây Hương thảo. Nó là rất dễ bị bệnh phấn trắng. Cây dễ mắc bệnh khi được trồng ở trong môi trường có không khí ẩm. Nhện, ruồi trắng và một số loài côn trùng có thể sử dụng Hương thảo làm thức ăn [27]. 1.1.4. Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam Hương thảo mới được du nhập về Việt Nam thời gian ngắn nhưng đã nhận được sự quan tâm của nhiều người. Đặc biệt là những người yêu thiên nhiên, thích khám phá. Do cây Hương thảo có mùi thơm nên những người ngửi qua mùi hương của nó khó có thể quên được, chỉ cần chạm nhẹ tay vào cây là có thể cảm nhận được mùi hương này. Cây được ưu chuộng và tìm mua rất nhiều, người ta mua về làm cảnh, trang trí trong nhà, giúp xua đuổi muỗi. Gần đây, Hương thảo còn trở thành một gia vị mới mẻ đối với người nội trợ. Nó không hề bị mất đi hương thơm trong khi nấu nướng. Trong nấu ăn, lá Hương thảo thường được sử dụng tươi, nhưng cũng có thể được sấy khô, nó có vị đắng nhẹ rất quyến rũ, mùi của Hương thảo có thế át mùi tanh của thịt
8 cá, tạo thêm vị đặc biệt khi làm các món nướng như pizza, gà nướng, tôm nướng. Hương thảo chứa nhiều canxi, sắt ,vitamin A và C [23]. 1.2. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro 1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [9]. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng (Totipotence) của tế bào. Trong tế bào chứa hệ gen, gồm tất cả các gen mã hóa cho các protein liên quan đến các đặc tính, tính trạng và chức năng sinh học của thực vật. Hiện nay, người ta đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [5]. Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9] tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào hợp tử. Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử sẽ phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh sau đó sẽ biến đổi thành các tế bào chuyên hóa. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Mặc dù các tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng riêng nhưng chúng vẫn không mất đi khả năng biến đổi của mình. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào này lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào. phân hóa tế bào tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa phản phân hóa tế bào
9 1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9], nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn 70º, clorox,…để khử trùng. Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cây [5]. Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 giờ/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [5]. Theo Dương Tấn Nhựt (2011) ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy. Quá trình tạo rễ chỉ cần cường độ ánh sáng thấp, cường độ ánh sáng cao quá ngăn cản quá trình tạo rễ. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự ra rễ, ánh sáng đỏ cam thích hợp cho sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời [2]. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người
10 ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang [7]. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ của buồng nuôi cây cần đảm bảo nhiệt độ ổn định trong khoảng 25ºC [7]. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS (Murashige & Skoog, 1962), là môi trường thích hợp cho cả thực vật một lá mầm, hai lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần. Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [3]: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn cacbon, các vitamin và aminoaxit, chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường, các chất điều hòa sinh trưởng. 1.2.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào Theo Ngô Xuân Bình và Cs [7], nuôi cấy mô tế bào thực vật được thực hiện theo 5 giai đoạn sau: (1) Giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo được nguyên liệu thực vật sạch để đưa vào nuôi cấy. (2) Tái sinh mẫu nuôi cấy được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. (3) Giai đoạn nhân nhanh chồi thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm