Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên mức độ biểu hiện của các gen điều khiển chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ HẢI HỒNG NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA DỊCH CHIẾT LÁ KHÔI (ARDISIA GIGANTIFOLIA STAPF.) LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN KIỂM SOÁT CHU KỲ TẾ BÀO CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ DẠ DÀY Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Thanh Hương THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Thị Thanh Hương. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Hải Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn tại Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. Em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên và cán bộ trong khoa và nhà trường. Đầu tiên em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô giáo - TS. Lê Thị Thanh Hương đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Xin chân thành cảm ơn bộ phận sau đại học của nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình em học tại trường. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted) trong mã số đề tài 108.05-2017.331. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho em thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Hải Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 1.1. Ung thư dạ dày và tế bào gốc ung thư dạ dày ............................................ 3 1.1.1. Ung thư dạ dày ........................................................................................ 3 1.1.2. Tế bào gốc và tế bào gốc ung thư dạ dày ................................................ 9 1.2. Chu kỳ tế bào và ung thư ......................................................................... 12 1.2.1. Khái quát chung về chu kỳ tế bào ......................................................... 12 1.2.2. Rối loạn chu kỳ tế bào và ung thư ........................................................ 14 1.2.3. Các gen kiểm soát chu kỳ tế bào ........................................................... 16 1.3. Giới thiệu chung về cây Lá khôi .............................................................. 19 1.3.1. Phân loại và đặc điểm ........................................................................... 19 1.3.2. Thành phần hóa học của cây Lá khôi.................................................... 20 1.3.3. Các nghiên cứu về tác dụng của cây Lá khôi trong điều trị ung thư .... 22 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 25 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 25 2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................................ 25 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 25 2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 25 2.4.1. Phương pháp thu thập và xác định tên khoa học của cây Lá khôi ........ 25 2.4.2. Phương pháp thu dịch chiết cây Lá khôi ............................................... 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
v 2.4.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D .......................................................... 26 2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D .......................................................... 26 2.4.5. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow cytometry ................ 27 2.4.6. Phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang ................................... 27 2.4.7. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ................... 28 2.4.8. Phương pháp phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR .................. 28 2.4.9. Phương pháp phân tích thống kê ........................................................... 29 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 30 3.1. Kết quả thu thập và xác định tên khoa học và thu dịch chiết ethanol cây Lá khôi............................................................................................................. 30 3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện nuôi cấy 2D ........................... 30 3.3. Nuôi cấy tumorsphere của các tế bào ung thư dạ dày trong điều kiện nuôi cấy 3D ............................................................................................................. 31 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên số lượng và kích thước các tumorsphere ..................................................................................................... 33 3.5. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào .............................. 32 3.6. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ........................................... 34 3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen của tế bào gốc ung thư .. 35 3.8. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen kiểm soát chu kỳ tế bào ... 38 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của protein P21 ...... 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43 1. KẾT LUẬN ................................................................................................. 43 2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ALDH : Aldehyde dehydrogenase CDK : Cyclin-dependent kinases CCNE1 : Cyclin E1 CT : Cryptotanshinone cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxyribonucleic acid FACS : Fluorescence-activated cell sorting GC : Ung thư biểu mô dạ dày mRNA : RNA thông tin NST : Nhiễm sắc thể PCNA : Proliferating cell nuclear antigen PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid SAGA : Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase SSE : Samsoeum TBGUT : Tế bào gốc ung thư TBGUTDD : Tế bào gốc ung thư dạ dày USP22 : Ubiquitin specific peptidase 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các pha trong chu kỳ tế bào ......................................................... 13 Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen ............................................................. 28 Bảng 3.1. Nồng độ RNA từ mẫu đối chứng và mẫu xử lý.............................. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Số ca ung thư mắc mới năm 2018 ở nam của Việt Nam ................. 4 Hình 1.2. Cơ chế phân chia của tế bào ung thư ............................................. 16 Hình 3.1. Mẫu cây Lá khôi ............................................................................. 30 Hình 3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào MKN45 trong điều kiện nuôi cấy 2D ....... 30 Hình 3.3. Nuôi cấy tumorpshere hình thành từ các tế bào gốc ....................... 31 Hình 3.4. Dịch chiết Lá khôi tác động lên khả năng hình thành tumorsphere ... 32 Hình 3.5. Dịch chiết Lá khôi tác động lên chu kỳ tế bào ............................... 33 Hình 3.6. Phổ hấp thụ của RNA tổng số tách chiết từ các tumorsphere......... 35 Hình 3.7. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện các gen ................... 36 Hình 3.8. Dịch chiết Lá khôi tác động lên các gen ........................................ 39 Hình 3.9. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện của protein .............. 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là một nước có sự đa dạng về các loài thực vật, trong đó có các loài thực vật làm thuốc. Họ Đơn nem (Myrsinaceae) gồm 50 chi và khoảng 1.400 loài được phân bố rộng rãi trên khắp thế giới. Trong đó, chi cơm nguội (Ardisia) có khoảng 400 – 500 loài trên thế giới và ở Việt Nam có khoảng 101 loài [2]. Các loài trong chi này có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh, bảo vệ sức khỏe cho con người, điển hình là cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf). Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất, được thống kê là dạng ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 trong nhóm các bệnh ung thư. Các tế bào gốc ung thư dạ dày là nguyên nhân gây ra các khối u dạ dày. Tế bào gốc ung thư dạ dày còn gọi là "tế bào nguồn" của ung thư dạ dày, có nguồn gốc chủ yếu từ các tế bào gốc hoặc các tế bào gốc định hướng dạ dày. Trong những năm gần đây, rất nhiều các nghiên cứu cho thấy ung thư dạ dày có thể bắt nguồn từ các tế bào gốc bình thường hoặc các tế bào trung mô có nguồn gốc từ tủy xương và các khối u dạ dày có chứa các tế bào gốc ung thư [71]. Các khối u có thể bắt nguồn từ một tiểu quần thể tế bào gốc ung thư có khả năng duy trì sự phát triển khối u lâu dài, tái phát khối u, kháng apoptosis và hóa trị. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, có nhiều hợp chất chiết xuất từ dịch chiết của các bộ phận cây Lá khôi ảnh hưởng đến sự tăng sinh biểu mô tuyến vú, gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư như: ung thư bàng quang, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư cổ tử cung,... [14], [57]. Đặc biệt đối với ung thư dạ dày, dịch chiết Lá khôi có khả năng biệt hoá tế bào gốc ung thư dạ dày và ít độc cho các tế bào và khả năng ức chế cao sự phân chia nhưng ít gây ra apoptosis [7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ảnh hưởng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2 của Lá khôi lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của các tế bào gốc ung thư dạ dày còn hạn chế. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tác động của dịch chiết Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên mức độ biểu hiện của các gen điều khiển chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu thập mẫu Lá khôi và tách chiết dịch chiết Lá khôi. Nội dung 2: Nuôi cấy các spheroid hình thành từ tế bào gốc ung thư dạ dày. Nội dung 3: Phân tích ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào bằng phương pháp Realtime PCR. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ung thư dạ dày và tế bào gốc ung thư dạ dày 1.1.1. Ung thư dạ dày 1.1.1.1. Khái quát chung về dịch tễ học ung thư dạ dày Ung thư dạ dày là một trong những bệnh ung thư phổ biến và gây tử vong hàng đầu, đặc biệt là ở đàn ông lớn tuổi. Theo nguồn dữ liệu GLOBOCAN 2018, ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến thứ 5 và ung thư gây tử vong cao thứ 3, với ước tính 783.000 ca tử vong trong năm 2018 [1]. Vào năm 2018 theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư đang là gánh nặng về y tế trên toàn cầu với 18,1 triệu ca mới mắc và 9,6 triệu ca tử vong trong năm 2018. Tổng số bệnh nhân ung thư sống thêm 5 năm là 43,8 triệu người [78]. Hiện nay, ung thư dạ dày là loại ung thư đứng hàng thứ năm với 1 triệu ca mắc mới chiếm 5,7%, chỉ sau ung thư phổi, ung thư vú ở nữ, ung thư đại trực tràng và ung thư tiền liệt tuyến. Ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong với 1,8 triệu ca chiếm 18,4%, ung thư đại trực tràng với 881.000 ca chiếm 9,2%, ung thư dạ dày với 783.000 ca chiếm 8,2% [84]. Tỷ suất mới mắc chuẩn hoá theo tuổi của ung thư dạ dày trên phạm vi toàn thế giới là 18/100.000 dân/năm. Tỷ suất mới mắc ung thư dạ dày cao nhất ở các quốc gia Đông Á, tiếp theo là Trung và Đông Âu và thấp nhất là ở các quốc gia Tây Phi. Tỷ suất mới mắc ở các quốc gia Đông Á vẫn là cao nhất [28]. Tỷ lệ bệnh và tỷ lệ tử vong của ung thư dạ dày trên thế giới đã giảm đáng kể trong 3 thập niên gần đây. Tỷ lệ giảm này được giải thích do điều kiện sống được cải thiện, thay đổi thức ăn bằng việc sử dụng thức ăn tươi, đặc biệt rau, quả tươi cùng với việc giảm tác nhân gây bệnh chủ yếu đó là trực khuẩn Helicobacter pylori (HP) [70]. Việt Nam nằm trong khu vực tỷ lệ mắc ung thư dạ dày mới khá cao. Dựa vào kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Diệu và cộng sự trong Chương trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
4 ghi nhận Ung thư Quốc gia, Việt Nam có tỷ suất ung thư dạ dày chuẩn hoá theo tuổi ở nam giới có xu hướng tăng nhẹ (23,7/100.000 dân năm 2000 lên 24,5/100.000 dân năm 2010) [4]. Tương tự, tỷ suất ung thư dạ dày chuẩn hoá theo tuổi ở nữ giới có xu hướng tăng nhẹ (10,8/100.000 dân năm 2000 lên 12,2/100.000 dân năm 2010). Ung thư dạ dày có xu hướng giảm dần theo thời gian. Cho đến năm 2030, tỷ suất mắc mới ung thư dạ dày thô giảm xuống 7,9% chung cho cả nam và nữ, 10,3% cho nam giới và 7,3% cho nữ giới. Tỷ suất mới mắc ung thư dạ dày chuẩn hoá theo tuổi chung và cả cho nam cũng như nữ giảm (27/100.000 chung năm 2009 xuống 13,2/100.000 năm 2030; cho nam: 41,4/100.000 năm 2009 xuống 19,6/100.000 năm 2030 và cho nữ: 16,3/100.000 năm 2009 xuống 11,4/100.000 năm 2030) [8]. Hình 1.1. Số ca ung thư mắc mới năm 2018 ở nam của Việt Nam (Nguồn: Viet Nam Source: Globocan 2018) [79] Năm 2018, GLOBOCAN cũng ghi nhận, tại Việt Nam tổng số ca ung thư mới mắc là 164.671 (tỉ lệ từng loại ung thư mới mắc ở nam được thể hiện ở hình 1.1), tổng số ca tử vong do ung thư là 114.871, tổng số ca ung thư sống thêm sau 5 năm là 300.033 [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
5 1.1.1.2. Các yếu tố liên quan đến dịch tễ ung thư dạ dày Có rất nhiều yếu tố liên quan đến ung thư dạ dày trong đó nhiễm H. pylori là yếu tố chính. Ngoài ra, yếu tố môi trường, điều kiện tiền ung thư và yếu tố di truyền… * Nhiễm H. pylori và ung thư dạ dày Vào năm 1983, Marshall và Warren phân lập được vi khuẩn H. pylori từ các mảnh sinh thiết biểu mô dạ dày, các nghiên cứu tiếp sau đó đã chứng minh được nó có khả năng gây tổn thương niêm mạc dạ dày, gây viêm dạ dày theo từng mức độ và dần dần dẫn đến dị sản, loạn sản rồi đến ung thư dạ dày. H. pylori là loại vi khuẩn phổ biến, phát triển ở ống tiêu hóa. Vi khuẩn này luôn có xu hướng tấn công niêm mạc dạ dày. Nhiễm H. pylori là nhiễm khuẩn mãn tính, ảnh hưởng đến 50% dân số trên toàn thế giới nhưng
6 42 nghiên cứu cho thấy ở những người hút thuốc, nguy cơ ung thư dạ dày tăng lên xấp xỉ 1,53 lần cao hơn ở nam giới so với ở nữ [29]. - Sử dụng rượu: Có mối liên quan không nhất quán giữa mức độ sử dụng rượu với ung thư dạ dày. Kết quả một phân tích gộp cho thấy sử dụng rượu làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày hơn 1,39 lần so với không sử dụng rượu. Bên cạnh đó, trong một nghiên cứu tại cộng đồng lớn tại châu Âu, ở nhóm đối tượng sử dụng rượu nặng có nguy cơ ung thư dạ dày gấp 1,6 lần ở nam và 1,4 lần ở nữ [30]. - Chế độ ăn giàu muối: Muối được biết đến là yếu tố làm tăng quá trình viêm và làm tăng tác dụng của tác nhân gây ung thư dạ dày như N-methyl-N- nitro-N-nitrosoguanidine. Muối làm mất đi hàng rào bảo vệ của niêm mạc dạ dày. Tập quán ăn đồ ăn mặn ngâm muối của người Nhật làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày, những người Nhật di cư đến Hoa Kỳ đã thay đổi tập quán ăn uống giống như người phương Tây đã giảm đáng kể tỷ lệ ung thư dạ dày [40]. * Các hợp chất Nitroso: Hợp chất N-nitroso được sinh ra sau khi dùng các nitrate, một thành phần tự nhiên của thức ăn như rau, cà chua và được sử dụng như là chất gia vị trong một vài loại bơ và thịt đã chế biến. Nitrate trong chế độ ăn uống được hấp thu tại dạ dày và được bài tiết trong nước bọt ở dạng cô đặc. Tại đó chúng bị các vi khuẩn ở miệng khử thành các nitrite. Các nitrite có thể phản ứng với các hợp chất có thể nitrosat hóa như các amine, amide và amino acid để tạo thành hợp chất N-nitroso. Người ta cũng quan sát thấy có sự gia tăng nitrite dạ dày ở những bệnh nhân dị sản ruột, loạn sản và ung thư dạ dày. Sử dụng các loại phân bón nitrate và các thức ăn dầm có chứa các sản phẩm nitrosate cũng có liên quan với ung thư dạ dày [84]. - Thịt nạc đỏ: Ăn nhiều thịt đỏ và thịt chế biến sẵn làm tăng nguy cơ ung thư tâm vị dạ dày đặc biệt ở những trường hợp bệnh nhân bị nhiễm H. pylori. Do sắt của nhân Hem có trong thịt đỏ kích thích chất tiền thân của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
7 nitroso. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cứ 50 g thịt nạc đỏ tăng thêm mỗi ngày là tăng nguy cơ ung thư tâm vị dạ dày lên 2,45 lần [40]. - Rau, quả giàu vitamin C: Rau sống và quả giàu vitamin C là giảm nguy cơ ung thư dạ dày. Vitamin C là giảm nguy cơ ung thư dạ dày do ức chế sự hình thành các hợp chất nitroso. Một số vi chất dinh dưỡng nữa cũng làm giảm nguy cơ ung thư dạ dày là đồng, vitamin E và caroten [40]. - Béo phì: Béo phì có liên quan đến ung thư đã được nghiên cứu trên quần thể lớn số bệnh nhân ung thư. Trong một phân tích gộp gồm 16 nghiên cứu đã chỉ ra rằng, béo phì có liên quan đến ung thư dạ dày đặc biệt là ở nam giới trừ người châu Á [42]. - Tình trạng kinh tế xã hội: Bên cạnh sự khác nhau về giới, tỷ lệ ung thư dạ dày cũng có liên quan với sự phân tầng xã hội. Tình trạng kinh tế xã hội có tương quan ngược với tỷ lệ ung thư dạ dày. Những người có thu nhập thấp thường có tỷ suất mắc ung thư dạ dày cao hơn những người có tình trạng kinh tế-xã hội khá hơn [74]. - Địa lý: Một nét đặc biệt về dịch tễ ung thư dạ dày là tỷ lệ mắc ung thư dạ dày có sự thay đổi theo từng khu vực địa lý và điều kiện kinh tế xã hội khác nhau. Khoảng 60% trường hợp ung thư dạ dày trên thế giới xảy ra ở các nước đang phát triển [22]. Tỷ lệ hiện mắc cao nhất là các nước Đông Á, đặc biệt là Trung Quốc, Mongolia, Nhật Bản và Hàn Quốc (35,4 nam; 13,8 nữ), Đông Âu (20,3 nam; 8,9 nữ) trong khi tỷ lệ hiện mắc thấp nhất là ở Bắc Mỹ (5,5 nam; 2,8 nữ), Châu Phi (4,5 nam; 3,2 nữ). Trong vài thập niên qua, tỷ lệ mắc mới trên toàn thế giới đều giảm và ước tính đến năm 2030, tỷ lệ giảm hàng năm là 2,3% [17]. Ở một vài quốc gia, người ta cũng nhận thấy có sự khác biệt về tỷ lệ mắc bệnh và tử vong giữa khu vực phía Bắc và khu vực phía Nam, với những người ở phía Bắc có nguy cơ mắc và tử vong do ung thư dạ dày cao hơn những người ở phía Nam [80]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
8 - Tuổi, giới tính với ung thư dạ dày: Tuổi và giới được ghi nhận là những yếu tố nguy cơ quan trọng của ung thư dạ dày. Nam giới có tỷ suất mắc gấp đôi nữ giới theo thống kê của Bệnh viện K. Tuổi từ 50 trở lên có nguy cơ ung thư dạ dày cao hơn so với độ tuổi trẻ hơn. Ở Hoa Kỳ, theo ghi nhận từ năm 2005-2009 thì tỷ lệ ung thư dạ dày là 1% ở độ tuổi từ 20-34, tỷ lệ này là 29% ở độ tuổi từ 75-84, tuổi trung bình được chẩn đoán ung thư dạ dày ở giai đoạn này là 70 [38]. 1.1.1.3. Các liệu pháp điều trị ung thư dạ dày hiện nay - Phẫu thuật: Trong điều trị ung thư phần dạ dày, phẫu thuật được xem là phương pháp điều trị hiệu quả nhất. Các phương pháp điều trị khác như hóa trị, xạ trị và miễn dịch... chỉ là phối hợp và có tính chất bổ trợ, hoặc áp dụng trong trường hợp đặc biệt không có khả năng mổ. Tùy vào từng giai đoạn của bệnh mà các phẫu thuật viên có thể đưa ra phương pháp điều trị phẫu thuật khác nhau: Nếu bệnh ở giai đoạn sớm; khi khối u còn nằm trong lớp niêm mạc hoặc dưới lớp niêm mạc, dùng phẫu thuật nội soi cắt bỏ niêm mạc là một lựa chọn điều trị lý tưởng [13]. - Hóa trị: Ung thư dạ dày di căn vẫn là một bệnh không thể chữa khỏi. Hóa trị đã được chứng minh là kéo dài sự sống mà không ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống. Tỷ lệ đáp ứng dao động từ 10-30% đối với trị liệu đơn tác nhân và 30-60% đối với trị liệu đa tác nhân. Hầu hết các nghiên cứu về hóa trị bổ trợ không chứng minh được lợi thế sống sót và do đó, nó không được coi là điều trị tiêu chuẩn ở hầu hết các trung tâm [36]. Hoá chất và xạ trị thường chỉ định điều trị phối hợp khi điều trị phẫu thuật có tính chất không triệt để, ung thư đã có di căn hạch và xâm lấn các tạng lân cận hoặc trong những trường hợp ung thư dạ dày tiến triển không còn khả năng phẫu thuật. Nhược điểm của hóa chất điều trị ung thư là chúng không có khả năng lựa chọn hay không thể phân biệt được đâu là tế bào ung thư, đâu là tế bào lành vì vậy sẽ bị ảnh hưởng tác dụng phụ rất nhanh [1]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
9 - Xạ trị: Ung thư dạ dày tương đối đề kháng đối với xạ trị. Hiệu quả của xạ trị đơn thuần hoặc phối hợp với hóa trị (hóa xạ trị liệu) chỉ giới hạn ở một số bệnh nhân, nhưng vẫn chưa thực sự rõ ràng và cần phải được nghiên cứu thêm [11]. Hầu hết các thử nghiệm cho thấy một lợi ích của liệu pháp điều trị kết hợp so với hóa trị hoặc xạ trị đơn thuần. Việc sử dụng liệu pháp xạ trị trước phẫu thuật, nội phẫu và cường độ điều trị trong ung thư dạ dày có triển vọng nhưng cần nghiên cứu thêm [43]. - Điều trị đích: Điều trị đích là một trong những tiến bộ mới nhất hiện nay trong điều trị ung thư dạ dày. Các thuốc điều trị đích tác dụng chọn lọc lên tế bào ung thư ở mức phân tử, sinh hóa, di truyền mà không ảnh hưởng lên chức năng của tế bào bình thường. Người ta đã và đang tiến hành nhiều nghiên cứu pha II, III sử dụng các loại thuốc điều trị đích hướng đến các thụ thể thuộc họ thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì người, họ yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu, và một số đích khác trên bệnh nhân ung thư dạ dày [11]. 1.1.2. Tế bào gốc và tế bào gốc ung thư dạ dày Tế bào gốc là các tế bào sinh học có khả năng biệt hoá thành các tế bào khác. Chúng được tìm thấy trong các sinh vật đa bào. Trong cơ thể sống, có thể lấy tế bào gốc từ hai nguồn chính: mô cơ thể đã trưởng thành và trong phôi giai đoạn sớm [56]. Ở động vật có vú, có hai loại tế bào gốc: tế bào gốc phôi, được phân lập từ trong của phôi nang giai đoạn sớm và tế bào gốc trưởng thành, được tìm thấy trong các mô khác nhau. Trong các sinh vật trưởng thành, tế bào gốc và các tế bào tiền thân đóng vai trò như một hệ thống sửa chữa cho cơ thể, chúng thay thế và bổ sung các tế bào lão hoá hoặc bị hư hại ở người trưởng thành. Tế bào gốc trưởng thành thường được sử dụng trong các liệu pháp y khoa khác nhau. Tế bào gốc có thể được phát triển nhân tạo và chuyển đổi (biệt hoá) thành các tế bào chuyên biệt với các đặc tính phù hợp với các tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
10 của các mô khác nhau như cơ và dây thần kinh. Các dòng tế bào phôi và các tế bào gốc phôi tự thân sinh ra thông qua việc chuyển gen hạt nhân là những phương pháp điều trị rất tiềm năng trong tương lai [73]. Đặc điểm quan trọng và hữu ích nhất của tế bào gốc là tự đổi mới. Thông qua đặc tính này, có thể tìm thấy sự tương đồng giữa tế bào gốc và tế bào ung thư: khối u thường có thể bắt nguồn từ sự biến đổi của tế bào gốc bình thường, các con đường truyền tín hiệu tương tự có thể điều chỉnh sự tự tái tạo trong tế bào gốc và tế bào ung thư và tế bào ung thư có thể bao gồm "tế bào gốc ung thư" - những tế bào hiếm có tiềm năng vô hạn để tự đổi mới thúc đẩy quá trình tạo khối u [67]. Một trong những cơ chế phát sinh ung thư được đặc biệt quan tâm hiện nay liên quan đến “tế bào gốc ung thư” (TBGUT- cancer stem cells). Tế bào gốc ung thư dạ dày (TBGUTDD- gastric cancer stem cells) được cho là đóng vai trò quan trọng trong việc di căn và kháng thuốc của khối u. Các liệu pháp chống ung thư hiện nay thường không tiêu diệt chọn lọc các tế bào ung thư. Kết quả là các TBGUT có khả năng kháng thuốc sẽ tiếp tục tồn tại và phân chia dẫn đến sự tái phát ung thư sau điều trị [5]. Lý thuyết về TBGUT đã làm thay đổi phương pháp trong điều trị ung thư, đó là việc phát triển các liệu pháp nhắm trực tiếp vào TBGUT. TBGUTDD là cơ sở cho sự hình thành ung thư dạ dày. Tế bào này bắt nguồn từ tế bào gốc dạ dày (TBGDD) trong các mô dạ dày hoặc các tế bào gốc trung mô tủy xương [41]. TBGUTDD là yếu tố chính gây kháng hóa trị và xạ trị của ung thư dạ dày. Những bằng chứng đầu tiên về tế bào gốc ung thư dạ dày được cung cấp bởi Bjerknes và Cheng năm 2002. Các tác giả đã sử dụng các tác nhân gây đột biến hoá học để đánh dấu các tế bào biểu mô một cách ngẫu nhiên để làm mất chức năng gen chuyển trong mô hình chuột chuyển gen Rosa26-lacZ biểu hiện Beta-galactoside [20]. CD44 là phân tử bám dính trên bề mặt TBGUTDD sớm nhất. Tiếp sau đó, tế bào ung thư cũng đã được phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
11 hiện trong các khối u phân lập trực tiếp từ bệnh nhân ung thư dạ dày bởi Lo và cộng sự năm 2014, Nguyen và cộng sự năm 2016 [62]. Đặc biệt gần đây nhất, Nguyen và cộng sự đã chỉ ra rằng ALDH (Aldehyde dehydrogenase) là một marker dùng để xác định TBGUTDD ở người, đồng thời phát hiện ra rằng chính những tế bào biểu hiện marker này đáp ứng mạnh với sự loại thải thuốc [63]. Ngay sau đó, cũng chính nhóm nghiên cứu này đã chứng minh rằng việc nhắm đích các tế bào này bằng acid retinoic đã ức chế mạnh mẽ sự tăng trưởng của TBGUTDD, gây biệt hóa TBGUT. Các TBGUT không chỉ có khả năng phân chia, biệt hoá thành tất cả các tế bào khác nhau trong khối u, làm tăng kích thước khối u mà có khả năng tạo ra tế bào con với đủ các đặc tính của nó dựa vào đặc tính tự làm mới của loại tế bào này. Tính tự làm mới của tế bào gốc thường cũng như TBGUT được điều khiển bởi mạng lưới các tín hiệu phân tử như Wnt/β-catenin, Hedgehog, Bmi-1, EGF, FGF, Src, Akt, Notch. Các tế bào gốc được phân biệt với các tế bào khác trong cùng khối u thông qua sự biểu hiện một số marker trên bề mặt của tế bào. Việc hiểu rõ đặc tính của các TBGUT đóng góp một phần không nhỏ vào các liệu pháp điều trị ung thư mà ở đó các TBGUT trở thành đích nhắm tới của liệu pháp [6]. Đối với ung thư dạ dày, các tế bào gốc ung thư được xác định lần đầu tiên dựa vào marker bề mặt và phương pháp quần thể phụ. Năm 2002, tác giả Bjerknes và cộng sự đã phân tích sự biểu hiện của 6 marker tế bào gốc tiềm năng trên các dòng tế bào ung thư dạ dày và đã chỉ ra rằng, quần thể tế bào CD44+ được phân tách bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào FACS (Fluorescence- activated cell sorting), các tế bào này mang các đặc tính cơ bản của tế bào gốc ung thư như khả năng tạo các tumorsphere in vitro và hình thành khối u in vivo [20]. Thêm vào đó, dựa trên phân tích quần thể phụ trong 5 dòng tế bào ung thư dạ dày bằng phương pháp nhuộm Hoechst 33342, Fukada và cộng sự đã chỉ ra các tế bào của một quần thể phụ chiếm tỷ lệ từ 0,02% đến 1,96% có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
12 sự biểu hiện mạnh các gen vận chuyển ABC liên quan đến khả năng kháng thuốc mà điển hình là gen MDR1 và BCPR1 kháng lại cisplatin 5-fluorouracil và Doxorubicin. Đặc biệt, các tế bào thuộc quần thể phụ đã thể hiện hai đặc điểm cơ bản của tế bào gốc ung thư đó là khả năng hình thành các tumorsphere trong điều kiện in vitro và sự hình thành các khối u trong điều kiện cấy ghép in vivo vượt trội so với các tế bào tách ra từ quần thể chính. Đặc biệt, công bố của Nguyen và cộng sự (2017) đã lần đầu tiên xác định sự tồn tại của các tế bào gốc ung thư dạ dày trong các dòng tế bào ung thư và trong các khối u dạ dày phân lập từ các bệnh nhân dựa trên các sàng lọc in vitro và in vivo [63]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã chỉ ra, tế bào gốc không chỉ biểu hiện các marker đặc trưng như CD44, ALDH mà chúng còn thể hiện đặc tính kháng thuốc rất rõ rệt so với quần thể tế bào không phải là tế bào gốc ung thư. 1.2. Chu kỳ tế bào và ung thư 1.2.1. Khái quát chung về chu kỳ tế bào Chu kỳ tế bào, hay chu kỳ phân bào, là một vòng tuần hoàn các sự kiện xảy ra trong một tế bào từ lần phân bào này cho đến lần kế tiếp, trong đó bộ gen và các thành phần của tế bào được nhân đôi và sau đó tế bào phân chia làm hai tế bào con. Ở các sinh vật đơn bào (nấm men, vi khuẩn,...) một cá thể sau khi trải qua chu kỳ phân bào tạo ra hai cá thể mới; còn ở các sinh vật đa bào thì chu kỳ tế bào là một quá trình tối quan trọng để một hợp tử phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh và để cơ thể bổ sung số lượng tế bào thay cho số đã chết [33]. Trong các tế bào nhân sơ, chu kỳ tế bào trải qua một quá trình mang tên là trực phân. Trong các tế bào nhân chuẩn chu kỳ tế bào bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất kỳ trung gian lúc tế bào phát triển, tích lũy vật chất và nhân đôi DNA; giai đoạn thứ hai là nguyên phân (Mitosis - M), lúc này tế bào thực thi quá trình phân chia thành hai tế bào con. Nhìn chung, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn