Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli có khả năng sản xuất vanillin từ axit ferulic

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:103

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu sử dụng kĩ thuật di truyền để tạo ra chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp chứa các gene của con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic. Chủng E. coli này sẽ có khả năng sản xuất ra vanillin tự nhiên từ axit ferulic. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli có khả năng sản xuất vanillin từ axit ferulic

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Cường Thái Nguyên - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Dương Văn Cường tại bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gen, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này được ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 14 tháng 5 năm 2016 Tác giả luận văn Ma Thị Trang
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương Văn Cường đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học sự sống, các thầy cô tại bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gen đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi học tập và hoàn thành khóa học này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khan cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này. Thái nguyên, ngày 14 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Ma Thị Trang
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 3 4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Giới thiệu về vanillin................................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc ........................................................................................ 4 1.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa.................................................................. 5 1.1.3. Đặc tính sinh học .............................................................................. 6 1.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống .............................. 8 1.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin ...................................................... 10 1.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật .......................... 10 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật .... 10 1.3. Các phương pháp sản xuất vanillin ........................................................... 15 1.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật .................................. 15 1.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học ....................................... 16 1.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học ................... 18 1.4. Tiềm năng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong sản xuất vanillin ............................................................................................ 21 1.4.1. Các gene mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic .................................................................................................................. 21
iv 1.4.2.Vi khuẩn E. coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin. .................................................................................................................. 23 1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong nước và ngoài nước........................... 26 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 26 1.5.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................ 29 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 30 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 30 2.1.1 . Các chủng vi sinh vật .................................................................... 30 2.1.2. Các vector tách dòng và biểu hiện nền tảng ................................... 30 2.1.3. Mồi khuếch đại các gene gltA, fcs và ech. ............................... 35 2.1.4. Hóa chất.......................................................................................... 36 2.1.5. Thiết bị ........................................................................................... 37 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................. 37 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 38 2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 38 2.4.1. Quy trình tách dòng gene và thiết kế vector biểu hiện .................. 38 2.4.2. Nhân gene đích bằng PCR ............................................................. 41 2.4.3. Điện di trên gel agarose.................................................................. 42 2.4.4. Tách chiết ADN plasmid ................................................................ 43 2.4.5. Lập bản đồ giới hạn ........................................................................ 44 2.4.6. Thu nhận ADN từ gel agarose ....................................................... 45 2.4.7. Nối ADN bằng ADN ligase ........................................................... 46 2.4.8. Chuẩn bị tế bào khả biến ................................................................ 46 2.4.9. Biến nạp ADN vào E. coli khả biến ............................................... 47 2.4.10. Xác định trình tự nucleotide ......................................................... 47 2.4.11. Phân tích trình tự gene đã tách dòng ............................................ 48 2.4.12. Nuôi E. coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic ....................... 48 2.4.13. Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic ................ 49 2.4.14.Phân tích vanillin và axit ferulic bằng HPLC ............................... 50 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 51 3.1. Tách dòng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic............................ 51
v 3.1.1. Tách dòng và giải trình tự gene gltA từ E. coli DH5α ................... 51 3.1.2. Tách dòng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 ............................................................................................ 55 3.1.3. Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsis sp. HR104 . 60 3.2. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền tảng vector pET22b+ ...................................................................... 65 3.2.1. Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp pET22-G ................................................................................................... 65 3.2.2. Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp pET22-GE ................................................................................................ 68 3.2.3. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang pET22-GE tạo vector tái tổ hợp pET22-GEF .............................................................................................. 71 3.3.1. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang vector pRSET tạo vector pRSET-F .. 72 3.3.2. Chuyển cụm hai gene gltA và ech từ pET22-GE sang pRSET-F tạo vector tái tổ hợp pRSET-GEF .................................................................. 73 3.4. Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E. coli tái tổ hợp làm tế bào chủ................................................................................................... 75 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng của E. coli .. 75 3.4.2. Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống pET22........................................................................................................ 76 3.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng hợp vanillin .................................................................................... 77 3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................. 77 3.5.2. So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT ....................................... 78 3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG................................. 79 3.6. So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector pET22 và pRSET ........................................................................... 80 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 82 4.1. Kết luận ..................................................................................................... 82 4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 83
vi DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 4-CL : 4-hydroxycinnamate-CoA ligase ATP : Adenosine triphosphate Bp : Base pair CCl4 : Carbon tetrachloride CoA : Coenzyme Acetoacetyl ĐHQGHN : Đại học quốc gia Hà Nội ADN : Deoxyribonucleic acid ADN-PK : ADN protein kinase ADN-PK : ADN protein kinase dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli : Escherichia coli EDTA : Etilenduamin tetraacetic acid HCLC : 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase IPTG : Isopropy Thyogalactoside Kb : Kilo base LB : Lauria Broth NCBI : NationCenter for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction SDS : Sodium doecyl sulfat TAE : Tris acetate EDTA TCA : Tricarboxylic acid VAO : Vanillyl alcohol oxidase X-gal : 5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin ......................................................... 5 Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm ................ 8 Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm ................................................................................................. 9 Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên ............. 20 Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T ............................................ 32 Bảng 3.2: Các thành phần của vector pRSET – A ........................................... 33 Bảng 3.3: Các thành phần của vector pET22b (+) ........................................... 34 Bảng 3.4: Trình tự mồi khuếch đại gene .......................................................... 35 Bảng 3.5: Danh mục các thiết bị ...................................................................... 37 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR.............................................................. 41 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme ................................................... 45 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 46 Bảng 3.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic và vanillin ........... 50
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới .................................................... 4 Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột ......................... 5 Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA dependent).............. 11 Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) ................. 12 Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion................................... 13 Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation................................... 14 Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive .................................................. 15 Hình 1.8: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol (Kirk & Othmer, 1983) ............................................................................ 17 Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic trong Pseudomonas fluorescens BF13 (Calisti et al., 2008)........................................... 23 Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic (Yoon et al., 2005) ............................................................................................... 24 Hình 1.11: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA (Lee et al., 2009) ......................................................................................... 25 Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T .............................................. 30 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vector pRSET-A ...................................................... 32 Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) .............................................. 33 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dòng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli DH5 ,............................................................................................ 39 Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gene ................. 40 Hình 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ech ................ 41 Hình 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene fcs ................. 42 Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh sạch (B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng ............. 51 Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt bằng enzyme NcoI.......................................................................... 53 Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA ................................................. 54 Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech ................................................... 55 Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech........................... 56 Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI .............. 57
ix Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech .................................................. 59 Hình 3.8: Kết quả tách ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104 (DSM 9991)..................................................................................... 60 Hình 3.9: Sản phẩm PCR gene fcs (A), plasmid các dòng có khả năng mang gene fcs (B), cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI (C)...................................................................... 61 Hình 3.10: Kết quả xác định và phân tích trình tự gene fcs............................. 64 Hình 3.11: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G.............................. 66 Hình 3.12: Cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII và SacI ............................................................................................ 66 Hình 3.13: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gene gltA trong pET22-G ......................................................................................... 67 Hình 3.14: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI ....................... 68 Hình 3.15: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE ........................... 68 Hình 3.16: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng SacI và EcoRI.............................................................................................. 69 Hình 3.17: Minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gene ech trong pET22-GE ...................................................................................... 70 Hình 3.18: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và BamHI ............................................................................................ 71 Hình 3.19: Thiết kế vector tái tổ hợp pET22 mang 3 gene gltA, ech và fcs .............................................................................................. 71 Hình 3.20: ADN plasmid của các khuẩn lạc trắng có khả năng mang pRSET-F (A) và cắt plasmid bằng enzyme SacI và BamHI (B) ...................................................................................... 72 Hình 3.21: Cấu trúc theo lý thuyết của vector pRSET-GEF (A), cắt plasmid bằng các tổ hợp enzyme khác nhau (B) và Marker 1kb được dùng làm thang chuẩn để xác định kích thước các băng của sản phẩm cắt (C)............................................. 74 Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF ................. 75 Hình 3.23: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic thành vanillin ở chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET22-GEF. .............................................................. 76
x Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của chủng E. coli tái tổ hợp. ................................................................................................. 77 Hình 3.25: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của E. coli tái tổ hợp trên các môi trường LB, M9 và 2YT................................................................................................. 78 Hình 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp vanillin............................................................................................ 79 Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic sử dụng các chủng E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF và pRSET-GEF ............................................ 80
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng [66]. Mức độ tiêu thụ hàng năm trên thế giới vào khoảng hơn 12000 tấn [44]. Vanillin còn thể hiện các đặc tính chống khuẩn và chống oxy hóa [71], đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư [71]. Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugeneol, lignin…Trong đó, vanillin được tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại là tổng hợp hóa học. Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla planifolia có giá lên tới 4000 đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo chỉ vào khoảng 15 đôla trên một kilogram [84]. Tuy nhiên, vanillin nhân tạo không được đánh giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định của Mỹ và Châu Âu do thiếu hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh hưởng xấu tới môi trường [51]. Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường sinh tổng hợp thông qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn cơ chất như axit ferulic, eugeneol, isogeneol, lignin,… Trong các nguồn cơ chất trên, axit ferulic được nghiên nhiều về các con đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên. Axit ferulic có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ các phế phụ phẩm nông nghiệp. Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy axit ferulic để tạo ra vanillin như Amycolatopsis sp. strain HR167 [6], Delftia acidovorans [63], Pseudomonas putida [62], Streptomyces setonii [73],
2 Pseudomonas fluorescens [53],…Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm nồng độ vanillin tạo ra. Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử. Với những khó khăn trên, hướng nghiên cứu tiếp theo là tổng hợp vanillin trong các vi khuẩn không mang gene sinh tổng hợp cũng như không có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật ADN tái tổ hợp. Trong số đó, E. coli được xem là một vật chủ tiềm năng bởi các lý do sau: - Vanillin tạo ra bằng con đường này được chấp nhận là vanillin tự nhiên. - Axit ferulic chiếm tỉ lệ cao trong mô thực vật, do đó là nguồn cơ chất phổ biến, rẻ tiền tận dụng từ phụ phẩm nông nghiệp. - Ở các loại vật chủ khác, vanillin sau khi tạo thành nhanh chóng bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác, hoặc là bị chính vật chủ tái sử dụng như một nguồn cacbon. E. coli là vật chủ không mang các con đường chuyển hóa này, do đó sản xuất vanillin nhờ E. coli không bị yếu điểm này. - E. coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền cũng như quy trình lên men đã được nghiên cứu kĩ. Từ các luận điểm trên, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này với mục tiêu sử dụng kĩ thuật di truyền để tạo ra chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp chứa các gene của con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic. Chủng E. coli này sẽ có khả năng sản xuất ra vanillin tự nhiên từ axit ferulic. 2. Mục tiêu của đề tài Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp mang các gen mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp axit ferulic thành vanillin. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tách dòng gene gltA, ech và fcs Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các gen gltA, ech, fcs
3 Nội dung 3: Đưa vector biểu hiện vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các gen đích Nội dung 4: Phân tích sản phẩm vanillin được tạo thành 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo được chủng E.coli có khả năng sản xuất ra vanillin từ axit ferulic là nền tảng để thực hiện nhiều nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tạo ra sản phẩm thực tiễn. Giúp bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các đối tượng tiếp theo. Là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo về công nghệ ADN tái tổ hợp. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài là tiền đề để sản xuất vanillin từ vi sinh vật giúp cung cấp cho thị trường lượng vanillin tự nhiên với giá cả phù hợp với túi tiền người tiêu dùng.
4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về vanillin 1.1.1. Nguồn gốc Vanillin là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia. Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học khác nhau được tách chiết từ vỏ quả, vanillin chiếm thành phần chủ yếu. Lịch sử về nguồn gốc vanillin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930. Người Aztecs (Mexico) được coi là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ. Sau đó, người Tây Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu, song mọi cố gắng để có thể trồng được cây Vanilla planifolia đều thất bại do không có sự thụ phấn tự nhiên. Cho đến khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn cưỡng sinh sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra sự thụ phấn nhân tạo cho hoa cuả vanilla [71]. Ngày nay, vanilla được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia, Trung Quốc, Madagascar, Mexico,… Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới
5 1.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu. Về mặt hóa học, vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde), có công thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol [18]. Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột (Converti et al., 2010) Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau: Bảng 1.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin (Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012) Đặc tính Dữ liệu Trọng lượng phân tử 152.15 Nhiệt độ nóng chảy 80-810C Nhiệt độ sôi 2850C Độ hòa tan 1g/100ml Tỉ trọng hơi (không khí=1) 5.2 Áp suất hơi 2.2 x 10-3 mmHg ở 250C Hằng số phân li pKa1= 7.40, pKa2= 11.4(250C)
6 1.1.3. Đặc tính sinh học Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi liềm,… [71]. 1.1.3.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng nấm bao gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm [23]. Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm mốc trong nước hoa quả ép, thạch hoa quả [45] và trong bảo quản xoài chế biến tươi và chống lại một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans, Cryptococcus neoformans [16], [56]. Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại Escherichia coli, Lactobacillusp lantarum, Listeria innocua. Schiff bases (thuốc nhuộm fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất kháng khuẩn chống lại một số chủng Gram dương và gram âm như Pseudomonas pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Enterobacter aero-genes, Staphylococcus subfava, Bacillus megaterium [76]. Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở đó vanillin hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo quản tự nhiên. 1.1.3.2. Hoạt tính kháng oxy hóa Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như hoạt tính phân hủy các gốc tự do. Vanillin có khả năng chống lại các tổn thương ở não dưới sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl 4) tác nhân gây oxy hóa ở chuột [47], bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình oxy hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột [35]. Sự có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực phẩm cũng giúp chống lại oxy hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo.
7 1.1.3.3. Hoạt tính chống ung thư và đột biến Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến. Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogene peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin C [27]. Vanillin ức chế con đường Non-homologous ADN end- joining (NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên mạch kép ADN bởi ức chế hoạt tính của ADN-PK (ADN protein kinase) , làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột [7]. 1.1.3.4. Hoạt tính hạ lipid trong máu Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu mỡ trong máu. Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2), rối loạn tim mạch, béo phì. Trước đó đã có nghiên cứu vanillin làm giảm lượng triglycerin trong huyết tương, triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong gan trên đối tượng chuột [72]. 1.1.3.5. Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng chống tạo hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào hồng cầu [5] . Tuy nhiên vanillin được hấp thụ theo đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu hóa. Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp. Lợi ích sinh học của loại thuốc này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần so với vanillin tự nhiên [89] . 1.1.3.6. Các hoạt tính khác Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết hợp với 5% vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi [74] .
8 1.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm [71]. Trong công nghiệp thực phẩm, vanillin là một phụ gia rất thông dụng, đặc biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream). Ngoài sử dụng trong sản xuất kem, vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm cho bánh, kẹo, cho các loại đồ uống. Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà phòng ,…. Bảng 1.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm Mức độ sử dụng (ppm) Sản phẩm Bình thường Tối đa Đồ nướng 74.5 106.0 Ngũ cốc 353.0 353.0 Chất béo, tinh dầu 96.0 100.0 Nước sốt ngọt 358.0 363.0 Bánh pudding 47.7 117.0 Đồ ăn nhẹ 200.0 200.0 Đồ uống loại I 39.4 97.4 Các sản phẩm sữa 221.0 314.0 Đồ uống loại II 26.7 55.2 Bơ sữa đông lạnh 1.5 2.7 Các sản phẩm sữa 247.0 408.0 Kẹo mềm 30.1 47.1 Nguồn: CAS N°: 121-33-5