Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

59
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán H. pylori từ dịch dạ dày bằng phương pháp Nested PCR. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN PHÚ HÙNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Trần Ngọc Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ, truyền dạy kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho chúng em trong những năm qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Phú Hùng, người thầy đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian em thực hiện và hoàn thành luận văn này. Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và các anh, chị trong nhóm nghiên cứu, những người luôn động viên, khích lệ em, tạo cho em động lực và niềm say mê trong nghiên cứu khoa học. Em vô cùng biết ơn tất cả những tình cảm tốt đẹp mà mọi người đã dành cho em. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Trần Ngọc Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i MỤC LỤC ....................................................................................................... III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. V DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. VI DANH MỤC CÁC HÌNH ..............................................................................VII MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu gồm ............................................................................. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori .................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu H. pylori .............................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của H. pylori ................................................. 4 1.1.3. Cơ chế gây bệnh của H. pylori ............................................................ 5 1.2. Gen mã hoá CagA (cytotoxine associated gene A).................................... 6 1.3. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn H. pylori........................................ 8 1.3.1. Các xét nghiệm xâm hại qua nội soi dạ dày tá tràng (invasive test) ........... 9 1.3.2. Các thử nghiệm không xâm lấn ........................................................ 19 1.4. Nested PCR trong chẩn đoán H. pylori.................................................... 23 1.4.1. Khái niệm về Nested PCR ................................................................ 23 1.4.2. Ứng dụng của Nested PCR trong chẩn đoán H. pylori ..................... 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 26 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 26 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ................................................................................. 26 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị ................................................................. 26 2.2. Địa điểm và thời gian ............................................................................... 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iv 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 27 2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày ........................ 27 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm ............... 27 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu chủng vi khuẩn ........ 28 2.3.4. Phương pháp đo DNA tổng số .......................................................... 29 2.3.5. Phương pháp Nested PCR................................................................. 29 2.3.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ..................................... 33 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 35 3.1. Kết quả tách DNA từ chủng vi khuẩn Helicobacter pylori và dịch dạ dày ... 35 3.2. Khuếch đại DNA đặc trưng genome của H. pylori bằng kỹ thuật Nested PCR ................................................................................................................. 36 3.3. Xác định độ nhạy của kỹ thuật Nested PCR trong phát hiện H. pylori ....... 38 3.3. Xác định gen CagA của vi khuẩn H. pylori bằng Nested PCR................ 39 3.4. Áp dụng kỹ thuật Nested PCR để đánh giá mức độ nhiễm H. pylori và chủng H. pylori mang gen CagA trong các mẫu bệnh phẩm .......................... 41 3.5. Xây dựng quy trình chẩn đoán ở mức độ phòng thí nghiệm ................... 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Campylobacter Like Organism test Clotest Cytotoxine associated gen A CagA Deoxyribonucleic acid DNA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Heptose - bisphosphate HBP Immuno Globulin A IgA Immuno Globulin G IgG Immuno Globulin M IgM Nuclear factor kappa B NFkB Pathogenicity island PAI Ribonucleic acid RNA Urea Breath Test UBT Vacuolating toxin gene A VacA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR .................. 31 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR vòng 1 ................................................. 31 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cho vòng 2 .................................................. 31 Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho mỗi vòng của phản ứng Nested- PCR ................. 32 Bảng 2.5. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR phát hiện gen CagA................................................................................................................ 32 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR cho 2 vòng .......................................... 33 Bảng 2.7. Chu kì nhiệt cho mỗi vòng của phản ứng Nested- PCR ................. 33 Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm và chủng H. pylori đối chứng .............................................................................................. 35 Bảng 3.2. Kết quả phân tích từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ........................... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn H. pylori............................................................................. 3 Hình 1.2. Mẫu thử Clotest ................................................................................. 9 Hình 1.3. Vi khuẩn H. pylori trên đĩa nuôi cấy phân lập ................................ 11 Hình 1.4. Viêm dạ dày lympho ....................................................................... 14 Hình 1.5. Viêm dạ dày hạt .............................................................................. 16 Hình 1.6. Nguyên lý test thở 13C và 14C .......................................................... 20 Hình 1.7. Nested PCR ..................................................................................... 24 Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ..................................................... 35 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng 1 khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. pylori. .................................................................................... 37 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng 2 khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H.pylori. ..................................................................................... 37 Hình 3.4. Độ nhạy của phản ứng Nested PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng genome H. pylori. ............................................................................................. 38 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng 1. ....................... 39 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng 2.......................40 Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. pylori................................................................................................ 40 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. pylori................................................................................................ 40 Hình 3.9. Quy trình chẩn đoán H. pylori bằng phương pháp Nested PCR áp dụng cho các phòng thí nghiệm ...................................................................... 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Helicobacter pylori (H. pylori) là một trong những vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng đường tiêu hóa. Sự phát hiện ra H. pylori bởi Marshall và Warren năm 1882 đã mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị bệnh lý dạ dày tá tràng. H. pylori đã được xem là nguyên nhân chính gây viêm, loét dạ dày ở mọi lứa tuổi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hơn 50% dân số bị nhiễm loại vi khuẩn này [46]. Tỷ lệ nhiễm H. pylori đang giảm ở vùng châu Á - Thái Bình Dương, nhưng ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này còn cao [2]. Tỷ lệ nhiễm H. pylori ở những trẻ em bị viêm dạ dày là 70% và ở bệnh nhân loét hành tá tràng là 90% [3]. Ở Việt Nam chưa có những theo dõi quy mô, toàn diện, chủ yếu là các số liệu thống kê dựa trên những nghiên cứu rải rác trong các cộng đồng nhỏ. Có rất nhiều phương pháp để giúp cho chẩn đoán nhiễm H. pylori dựa theo điều kiện cụ thể của từng cơ sở y tế. Các phương pháp chẩn đoán có tính xâm lấn thông qua nội soi gồm thử nghiệm urease, nuôi cấy vi khuẩn, xác định acid nhân của vi khuẩn, chẩn đoán mô bệnh học, phản ứng chuỗi PCR. Các phương pháp không xâm lấn bao gồm: Nghiệm pháp thở C13 hoặc C14, chẩn đoán huyết thanh, test nhanh bằng huyết thanh, test huyết thanh phát hiện kháng thể kháng CagA, tìm kháng thể kháng H. pylori trong nước tiểu, Immunoblot, dùng PCR chẩn đoán H. pylori trong phân, phát hiện kháng nguyên trong phân. Mỗi phương pháp đều cho những ưu nhược điểm riêng. Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhưng chưa được phổ biến rộng rãi ở Việt Nam trong chẩn đoán nhiễm H. pylori. Ngoài việc chẩn đoán nhiễm H. pylori trước điều trị, PCR còn dùng để theo dõi sau điều trị tiệt trừ H. pylori. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2 Thông thường, việc chẩn đoán bằng PCR cũng như các xét nghiệm Clotest đều trải qua việc sinh thiết một mẫu niêm mạc dạ dày, điều này ít nhiều gây tổn thương cho dạ dày và gây đau đớn cho người bệnh. Trong khi đó, PCR phát hiện từ mẫu phân và mẫu nước tiểu là những xét nghiệm không xâm lấn nhưng tỷ lệ âm tính giả cao do sự có khả năng thu nhận được H. pylori từ các mẫu bệnh phẩm này thấp hơn nhiều so với trong dạ dày. Trong nghiên cứu này chúng tôi hướng tới việc xây dựng một quy trình chẩn đoán H. pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày nhằm giảm tính xâm lấn so với các phương pháp phân tích từ mô dạ dày đồng thời có thể phát hiện các chủng có nguy cơ gây ung thư mang gen CagA mà một số phương pháp không xâm lấn khác không đạt được. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình chẩn đoán H. pylori từ dịch dạ dày bằng phương pháp Nested PCR. 3. Nội dung nghiên cứu gồm Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nội soi viêm loét dạ dày và tách chiết DNA tổng số. Nội dung 2: Phát hiện DNA đặc trưng genome H. pylori bằng phản ứng Nested PCR. Nội dung 3: Phát hiện gen CagA của vi khuẩn H. pylori bằng phản ứng Nested PCR. Nội dung 4: Đánh giá tỷ lệ dương tính với vi khuẩn H. pylori và gen CagA từ các mẫu bệnh phẩm bằng Nested PCR. Nội dung 5: Xây dựng quy trình chẩn đoán H. pylori bằng Nested PCR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu H. pylori Loài xoắn khuẩn này đã được tìm thấy trong niêm mạc dạ dày của người và động vật từ năm 1875 nhưng mối liên quan giữa vi khuẩn này và các bệnh lý ở dạ dày tá tràng chưa được xác định [32]. Hình 1.1. Vi khuẩn H. pylori (Nguồn:http://microbewiki.kenvon.edU/images/thumb/2/24/H. pylori.gif) Khi mới được phân lập vi khuẩn này được đặt tên là Campylobacter pyloridis căn cứ vào vị trí khu trú và một số đặc điểm giống Campylobacter jejuni [35]. Sự khác biệt giữa Campylobacter pyloridis và các chủng Campylobacter được xác định bởi Goodwin và cộng sự vào năm 1989 từ đó Campylobacter pyloridis được đổi tên thành Helicobacter. Tên Helicobacter phản ánh hai đặc điểm hình thái của vi khuẩn dạng hình gậy trên in vitro và hình xoắn trên in vivo [21]. Năm 1983, Warren và Marshall cùng các cộng sự tuyên bố có sự liên quan với vi khuẩn này với bệnh lý dạ dày. Tuy nhiên, quan niệm lúc đó khó chấp nhận sự có mặt cũng như vai trò của vi khuẩn tồn tại trong môi trường rất axid của dạ dày. Thí nghiệm của Marshall bằng cách uống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
4 một lượng lớn vi khuẩn sống H. pylori vào trong cơ thể, sau đó theo dõi các triệu chứng của viêm dạ dày cấp tính và thực hiện xác định sự có mặt của H. pylori bằng phương pháp mô bệnh học từ bệnh phẩm sinh thiết dạ dày. Song song với nghiên cứu này còn có nghiên cứu của Morris cũng tự gây nhiễm trùng H. pylori cho bản thân. Cuối cùng, với những nỗ lực trong các nghiên cứu nêu trên, vi khuẩn H. pylori đã được công nhận là tác nhân gây viêm loét dạ dày ở người [13]. Viện nghiên cứu sức khỏe Hoa Kỳ đã công bố vi khuẩn H. pylori có khả năng gây viêm loét dạ dày - tá tràng và khuyến cáo dùng kháng sinh để điều trị nhiễm trùng này và Warren và Marshal đã giành được giải thưởng Nobel Sinh lý học và Y học vào năm 2005 [16]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của H. pylori Về hình thể, H. pylori có hình dạng mỏng mảnh, cong xoắn hoặc hình chữ S, bắt mầu gram âm, dài từ 1,5 đến 5 pm và dày 0,3 -1 pm, với 4 đến 7 lông có vỏ bọc ra từ một đầu cực. Nhờ cấu trúc hình xoắn và các lông này, vi khuẩn di chuyển dễ dàng trong lớp nhầy của dạ dày. Các lông roi đều có vỏ là lớp liên tục với màng ngoài vi khuẩn, chính lớp vỏ này bảo vệ cho các sợi và chất sợi trong lông không bị môi trường acid khử cực và làm mất chất sợi, đảm bảo cho hoạt động di chuyển của vi khuẩn [49]. Hình thái điển hình của H. pylori chỉ gặp khi soi tươi hoặc nhuộm mô bệnh học các mẫu sinh thiết. Trong môi trường nuôi cấy, H. pylori dài hơn và có độ xoắn thấp hơn. Ngoài ra, trong môi trường nuôi cấy để lâu hoặc trong môi trường ngoài, H. pylori thường chuyển thành dạng hình cầu với nhiều kích thước khác nhau. Dựa vào đặc điểm hình thái học, vi khuẩn H. pylori có thể được phát hiện theo phương pháp tế bào học bằng cách nhuộm gram hoặc soi kính hiển vi đối quang phân kỳ (phase contrast microsopy) từ các mẫu bệnh phẩm sinh thiết dạ dày và theo phương pháp mô bệnh học [29]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
5 1.1.3. Cơ chế gây bệnh của H. pylori Sau khi xâm nhập vào dạ dày, nhờ có hình xoắn và các lông roi ở một đầu, vi khuẩn có thể xâm nhập vào lớp nhày bao phủ niêm mạc dạ dày. Nhờ có các yếu tố bám dính, vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mô niêm mạc dạ dày, nhờ có khả năng tiết ra nhiều enzym urease có tác dụng phân hủy ure trong dạ dày thành amonia gây kiềm hóa môi trường xung quanh vi khuẩn. Môi trường này có tác dụng giúp cho vi khuẩn tồn tại được trong lớp nhày của dạ dày đồng thời tránh được sự tấn công của axid HCl, pepsin luôn có trong lòng dạ dày [29]. Amonia cùng với nhiều yếu tố có khả năng gây bệnh của H. pylori như các độc tố tế bào, các enzym tiêu protein, phospholipase... đã phân hủy các thành phần của chất nhày bao phủ niêm mạc dạ dày giúp cho axid HCl và pepsin tấn công vào niêm mạc tổn thương viêm. Mặt khác, các yếu tố có khả năng gây bệnh của H. pylori như urease, chất bám dính, LPS, CagA, VacA, protease, lipase... gây tổn thương niêm mạc dạ dày, đồng thời giải phóng ra hàng loạt các chất trung gian hóa học có khả năng phát động quá trình viêm như: các Interleukin (IL1-6-8...), yếu tố gây hoại tử khối u (TNF-α), các leucotriene... Các yếu tố IL 1,6,8 có tác dụng tăng cường quá trình bám dính của bạch cầu vào thành mạch, tăng cường hoạt động xuyên mạch của bạch cầu và có tác dụng thu hút bạch cầu tới vùng viêm. Ngoài ra, IL1,8 còn có tác dụng thu hút các tế bào lympho T, tăng cường chuyển dạng các tế bào T thành tế bào T giúp đỡ có khả năng sinh ra các Interleukin, trong đó có IL 1,6,8. Các Interleukin, các yếu tố gây bệnh của H. pylori còn có tác dụng hoạt hóa hệ thống bổ thể. Hệ thống này cùng với Leukotriene có tác dụng góp phần thu hút bạch cầu đặc biệt là các lympho B có chức năng sản xuất globulin miễn dịch đặc hiệu IgG, IgA. Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể sinh ra các kháng thể chống H. pylori cũng gây ra phản ứng chéo với các thành phần kháng nguyên tương tự trên các tế bào biểu mô dạ dày [2]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
6 Viêm dạ dày do nhiễm H. pylori diễn biến qua 2 giai đoạn: Giai đoạn cấp tính: Quá trình nhiễm H. pylori có thể [24] chia làm hai giai đoạn. Giai đoạn cấp tính, vi khuẩn xâm nhập, nhân lên và gây hiện tượng viêm niêm mạc, giảm tiết acid và một số triệu chứng dạ dày tá tràng xuất hiện. Sau vài tuần, giai đoạn viêm mãn tính bắt đầu với hiện tượng giảm các đáp ứng viêm, pH dạ dày trở về bình thường và người nhiễm trở nên không có triệu chứng. Sự xâm nhập của vi khuẩn H. pylori ở niêm mạc dạ dày dẫn đến sự xâm nhập các bạch cầu trung tính và mono ở cả hang vị và thân vị, dẫn đến quá trình viêm mãn tính và loét. Giai đoạn mãn tính: trong giai đoạn viêm cấp, nếu điều trị H. pylori sẽ được tiệt trừ, tình trạng viêm có thể chấm dứt nhanh chóng. Nhưng phần lớn các trường hợp chuyển sang viêm mãn tính do H. pylori tồn tại lâu dài ở niêm mạc dạ dày. Giai đoạn này các triệu chứng lâm sàng có thể giảm đi hoặc mất nhưng về mô bệnh học quá trình viêm mãn tính biểu hiện rõ với những biến đổi mô, có hiện tượng bong tróc niêm mạc và xâm nhập nhiều tế bào viêm. Nhiễm H. pylori dẫn đến quá trình viêm niêm mạc dạ dày, quá trình này nếu không được điều trị sẽ diễn biến ngày càng nặng. Trên cơ sở niêm mạc viêm, hàng rào bảo vệ niêm mạc bị phá hủy, kết hợp với sự tấn công của acid HCl và pepsin dẫn đến trợt rồi loét. Các tổn thương do nhiễm H. pylori làm cho chức năng của tế bào D bị giảm, dẫn tới giảm tiết somatostatin là chất ức chế bài tiết gastrin và kiểm soát HCl. Giảm somatostatin sẽ làm tăng tiết gastrin dẫn tới tăng tiết HCl quá mức ở dạ dày làm cho pH ở hành tá tràng giảm mạnh gây nên tình trạng dị sản niêm mạc dạ dày ở hành tá tràng, đây là yếu tố tấn công quan trọng gây viêm, loét [46]. 1.2. Gen mã hoá CagA (Cytotoxine associated gene A) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
7 CagA là một protein có trọng lượng phân tử 120-140 KDa mã hoá bởi gen CagA phân bố trong vùng DNA có tên là “đảo sinh bệnh” (PAI, pathogenicity island) trong hệ gen của H. Pylori. CagA được coi là một oncoprotein, được chuyển vào các tế bào biểu mô dạ dày bằng hệ thống bài tiết IV của mầm bệnh, tạo ra nhiều tầng tín hiệu [44], [40]. Các đánh giá khác trong loạt bài này mô tả chi tiết các phản ứng báo hiệu nội bào biểu mô do CagA gây ra và vai trò của nó trong sinh bệnh học [7], [53]. Các nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng ngoài việc kích hoạt NOD-1, heptose-1,7-bisphosphate (HBP) của vi khuẩn, tiền chất chuyển hóa của sinh tổng hợp lipopolysacarit, cũng được đưa qua hệ thống tiết Cag loại IV vào tế bào biểu mô [19], [51]. Độc lập với NOD1, HBP kích hoạt yếu tố liên quan đến thụ thể của yếu tố hoại tử khối u tế bào (TRAF) với protein liên kết với đầu nối (TIFA), dẫn đến việc kích hoạt sớm các phản ứng chemokine của NFkB và CXC. Như vậy, sự hoạt hóa của biểu mô NOD-1 và TIFA bởi hai thành phần độc lập của H. pylori được cung cấp qua các Cag loại IV trigger hệ thống bài tiết bẩm sinh phản ứng viêm miễn dịch. Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày và sự thay đổi trong tần số của Cag PAI [45] là những yếu tố quan trọng khi đánh giá nguy cơ nhiễm trùng với các chủng H. pylori dương tính CagA và ung thư dạ dày. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng CagA EPIYA-D ở các chủng Đông Á liên kết với SHP2 phosphatase pro- oncogen mạnh gấp 100 lần so với CagA EPIYA- C ở các chủng H. pylori của phương Tây và cũng kích thích hoạt động mạnh mẽ Ras ERK của tế bào [25], [37]. CagA IgG đã được đánh giá bằng phương pháp ELISA sử dụng CagA tái tổ hợp trong một số bệnh ung thư dạ dày để xác định xem CagA IgG huyết thanh dương tính có liên quan đến tỷ lệ CagA huyết thanh âm tính, tỷ lệ H. pylori dương tính và các đối chứng không bị nhiễm trùng phù hợp với các lứa tuổi [47]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
8 CagA là một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của ung thư dạ dày ở những người nhiễm H. pylori . Trong mô hình của gerbil, chủng CagA-dương tính nhưng không phải là yếu tố gây đột biến CagA dẫn đến phát triển ung thư dạ dày, hầu hết các bệnh nhân có chủng CagA- dương tính đều có xu hướng phát triển thành ung thư dạ dày ở phương Tây [41]. Tuy nhiên, ở các nước Đông Á hầu hết các chủng H. pylori đều biểu hiện có đột biến CagA. Các quan sát dịch tễ học chỉ ra rằng các bệnh nhân có đột biến CagA có mối liên hệ chặt chẽ hơn với teo niêm mạc dạ dày và tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao hơn [6], [50], [54]. H. pylori (mang gen CagA) có khả năng kích thích tiết IL-8, IL-10, IL-12 do hoạt hoá yếu tố NFkB (Nuclear factor kappa B), tiết và vận chuyển protein CagA vào trong tế bào, và phosphoryl hoá CagA. CagA hoạt hoá các con đường tín hiệu ung thư trong tế bào, theo Anthory P. xấp xỉ 60% các chủng H. pylori phân lập được có gen CagA. Người ta thấy kháng thể CagA có ở 100% bệnh nhân loét dạ dày tá tràng và 76,5% ở bệnh nhân có biểu hiện bệnh lý dạ dày tá tràng nhưng không có loét. Ở các nước phát triển, bệnh lý về dạ dày tá tràng có liên quan với chủng H. pylori có CagA (+) hơn các chủng CagA (-). Sau khi vào tế bào CagA được phosphoryl hóa và kết hợp với SHP-2 tyrosine phosphatase tạo nên yếu tố đáp ứng phát triển tế bào (growth factor – like cellular) và sản xuất cytokine của tế bào ký chủ. 1.3. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn H. pylori Kể từ khi H. pylori được tìm ra vào năm 1982, đến nay đã có nhiều phương pháp chẩn đoán nhiễm H. pylori được nghiên cứu và áp dụng. Trong chẩn đoán, mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm khác nhau và việc chọn lựa phương pháp còn tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong thực hành, giá thành của thử nghiệm và cơ sở vật chất, trang thiết bị. Điều quan trọng nhất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
9 là các thử nghiệm phải có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để giúp cho chẩn đoán trước điều trị và theo dõi sau điều trị đạt hiệu quả tốt nhất. Các phương pháp chẩn đoán H. pylori có thể chia thành hai nhóm: - Các thử nghiệm ít xâm hại được thực hiện qua nội soi dạ dày tá tràng. - Các thử nghiệm không xâm hại. Nguyên tắc khi chỉ định thử nghiệm là bệnh nhân không được uống các loại thuốc kháng tiết, các loại kháng sinh... và phải ngưng điều trị ít nhất 4 tuần. 1.3.1. Các xét nghiệm xâm hại qua nội soi dạ dày tá tràng (Invasive test) 1.3.1.1. Thử nghiệm urease Test này xác định hoạt độ enzym urease của H. pylori bằng việc đặt mẫu mô dạ dày vào môi trường lỏng (test maison, CU test) hoặc bán đặc (Clotest, HUT test) hoặc trên một cái màng gọi là Pyloritek có chứa urea và một chất chỉ thị màu theo pH [12]. Nguyên tắc của thử nghiệm là nhằm phát hiện enzym urease của H. pylori, H. pylori gần như là loại vi khuẩn duy nhất trong dạ dày tiết enzym urease với khối lượng lớn (ngoại trừ một số rất ít bệnh nhân bị nhiễm Helicobacter helmanii). Enzym urase của H. pylori có trong mẫu mô dạ dày sẽ làm biến đổi urease thành amoniac (NH 3), NH3 làm môi trường thuốc thử có pH kiềm, vì vậy làm thay đổi màu của chất chỉ thị và theo phản ứng sau: (NH2)CO + H2O CO2 + 2NH3 Hình 1.2. Mẫu thử Clotest Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
10 Độ nhạy thay đổi theo từng loại test và thời gian đọc kết quả, gia tăng khi được ủ ở 37-420 C, các test tốt đọc trong vòng 4 giờ cho độ nhạy cảm 85-90% và độ đặc hiệu từ 95-98%. Trong điều kiện hiện nay người ta thừa nhận ngưỡng phát hiện vi khuẩn là 104-105 vi khuẩn/ml [46]. Trong các loại test trên ở Việt Nam thường sử dụng Clotest. Clotest là viết tắt của chữ Campylobacter Like Organism test, Clotest sử dụng mẫu thử là hỗn hợp gồm: agar gel có chứa urea, chất chỉ thị đỏ phenol, chất kìm hãm vi khuẩn. Mẫu sinh thiết niêm mạc dạ dày lấy trong nội soi được vùi vào đó. Thử nghiệm dương tính khi mẫu thử Clotest đổi màu từ vàng sang màu đỏ tía. Clotest có thể đọc kết quả sau 5 phút, 20 phút, 1 giờ, 3 giờ,và 24 giờ [3]. Nếu chỉ đọc kết quả trong một giờ, độ nhạy của thử nghiệm sẽ giảm xuống vì phụ thuộc vào lượng enzym urease hoạt động cũng như số lượng vi khuẩn. Ở một số trường hợp, kết quả dương tính chỉ sau vài phút và khi mật độ vi khuẩn thấp kết quả có thể dương tính sau nhiều giờ liền, thậm chí âm tính giả có thể xảy ra. Các trường hợp âm tính giả có thể do: mật độ vi khuẩn thấp (như trên), đang xuất huyết tiêu hóa, teo niêm mạc dạ dày, u MALT, mới vừa dùng kháng sinh hoặc PPIs [32]. Các trường hợp dương tính giả gặp trong nhiễm H. heilmanii, vi khuẩn này cũng sinh ra enzym urease và thường gặp trong dạ dày của chó, mèo, lợn. Khi độ toan dịch vị thấp, dương tính giả còn có thể gặp ở những trường hợp nhiễm vi khuẩn khác cũng sinh ra enzym urease như Enterobacter và Pseudomonas. sp [3]. Áp dụng và giá trị của thử nghiệm Clotest: - Chẩn đoán nhiễm H. pylori: đây là một thử nghiệm nhanh chóng, rẻ tiền, đơn giản và hữu hiệu để phát hiện H. pylori. Độ nhạy và độ đặc hiệu trên 90% và nếu sinh thiết ở cả hai mẫu ở hang vị và thân vị thì độ nhạy sẽ tăng thêm 4,3% so với chỉ lấy một mẫu ở hang vị. Tại Việt Nam, thử nghiệm urease dương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
11 tính trong loét tá tràng là 64,7% đến 87,3% và trong loét dạ dày là 60% đến 100%. 1.3.1.2. Nuôi cấy vi khuẩn Lấy mẫu mô niêm mạc dạ dày đem nhuộm Gram để tìm sự hiện diện của vi khuẩn [32]. Tuy nhiên, độ nhạy không cao. Để xác định chính xác nhiễm H. pylori về mặt phương diện vi khuẩn học cần phải nuôi cấy vi khuẩn. Hình 1.3. Vi khuẩn H. pylori trên đĩa nuôi cấy phân lập Trong chẩn đoán nhiễm H. pylori, nuôi cấy là thử nghiệm đặc hiệu nhất và có thể nói đó là tiêu chuẩn vàng có độ đặc hiệu 100% [3]. Nuôi cấy còn cho biết mật độ của H. pylori, cấu trúc gen của các chủng H. pylori khác nhau. Nuôi cấy còn cho biết dạng hình cầu của H. pylori là hình thái thoái hóa của vi khuẩn. Dù vậy, về mặt thực tiễn lâm sàng ít khi dùng phương pháp này vì có nhiều phương pháp khác đơn giản hơn, dễ áp dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, trong trường hợp điều trị thất bại, nuôi cấy làm kháng sinh đồ vẫn là thử nghiệm có ích để hướng dẫn điều trị thích hợp và là một trong các phương pháp để đánh giá tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn