intTypePromotion=1
ADSENSE

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

15
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm định danh được 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam; xác định được một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam

  1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - NĂM 2017
  2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH HUỆ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Bích Thủy THÁI NGUYÊN, NĂM 2017
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trong Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học. Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nghiêm Ngọc Minh, KS. Phạm Thùy Linh và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng yêu thương và biết ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp - những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017 Tác giả Trần Thị Thanh Huệ LỜI CAM ĐOAN
  4. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Võ Thị Bích Thủy. Các tư liệu trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng, các kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huệ
  5. i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 4 1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira ........................................................ 4 1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 6 1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis .................................................................. 6 1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 10 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................. 12 1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis ................................................................ 12 1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 14 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 15 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15 2.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 16 2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 16 2.2.2. Thiết bị................................................................................................... 17 2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 17 2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 18 2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 18
  6. ii 2.4.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số ........................ 19 2.4.3. Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB .......................................................................................... 20 2.4.4. Kỹ thuật PCR......................................................................................... 20 2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA ....................................... 21 2.4.6. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 22 2.4.7. Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira .. 23 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24 3.1. Phân loại học phân tử 6 chủng Leptospira ............................................... 24 3.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số......................................................... 24 3.1.2. Trình tự các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB .......................................................................................... 26 3.1.3. Nhân gen với các cặp mồi của gen 16S rDNA...................................... 27 3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16S rDNA.............................................. 28 3.1.5. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 29 3.1.6. Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn ............................................................................................................... 30 3.2. Xác định sự có mặt của các gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 ............................................................................................................. 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 41 1. Kết luận ....................................................................................................... 41 2. Đề nghị ........................................................................................................ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1 PHỤ LỤC
  7. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EMJH Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris EtBr Ethidium Bromide F- Forward Primer : Mồi xuôi R- Reverse Primer: Mồi ngược Kb Kilobase L. Leptospira MLST Multilocus Sequence Typing OMP Protein ngoài màng (outer membrane protein) PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA
  8. iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Danh mục các thiết bị đã sử dụng 17 2.2 Thành phần phản ứng nhân gen 21 Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm 3.1 25 và 280nm của 6 chủng Leptospira 3.2 Trình tự cặp mồi dùng để nhân các đoạn gen 27 Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ cơ sở dữ 3.3 30 liệu GenBank
  9. v DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1 Leptospira interrogans 4 2 Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen 21 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 6 chủng Leptospira 24 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 28 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 3.3 29 tinh sạch 3.4 Hình ảnh cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn 32 3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA 35 3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32 35 3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB 36 3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1 36 3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21 37 3.5.f Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41 37
  10. 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal Health- OIE) xếp vị trí thứ 2 trong nhóm bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Nguyên nhân gây ra bởi một loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans. Leptospira interrogans là loài gây bệnh thường kí sinh ở người và động vật, bao gồm hơn 200 typ, được chia thành 23 nhóm (trong đó Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất). Xoắn khuẩn này có khả năng gây bệnh trên động vật và có thể lây sang người. Bệnh do xoắn khuẩn gây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể gây sẩy thai ở thú nuôi. Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật mắc bệnh. Bệnh phát triển ở khắp mọi nơi trên thế giới, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con người. Do tính đa dạng về triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn đoán và tỷ lệ tử vong cao. Việc điều trị bệnh này rất khó khăn nên đòi hỏi những biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết. Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học đang tập trung vào các loại vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng và động vật. Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc được thiết kế dựa trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc lực của các tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn của các loại vắc xin. Đây là một bước đột
  11. 2 phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói chung và vắc xin Leptospirosis nói riêng. Thực tế, nhiều protein ngoài màng của xoắn khuẩn Leptospira đã được tìm thấy và sử dụng trong công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp. Quá trình tách chiết, tái tổ hợp và tinh sạch các protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổ hợp có giá trị tương tự như kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát hiện xoắn khuẩn Leptospira. Kết quả thực nghiệm cho thấy vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn có miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin thông thường. Do đó, những nghiên cứu về các gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, công thức tối ưu, tá dược, liều lượng và liệu trình để phát triển các loại vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn đạt hiệu quả cao, an toàn cho người và động vật sử dụng là rất cần thiết. Việc cải thiện chất lượng vắc xin tái tổ hợp DNA và vắc xin protein thực sự quan trọng đối với các ứng dụng thực tế. Hơn nữa, việc nghiên cứu các protein màng sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền học, có ý nghĩa thiết thực đối với các nhà khoa học và sản xuất liên quan đến vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam” nhằm tạo cơ sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Định danh được 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam. - Xác định được một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam.
  12. 3 3. Nội dung nghiên cứu - Giải trình tự gen 16S rDNA và xây dựng sơ đồ phân loại hình cây của 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam. - Xác định sự có mặt của một số gen mã hóa kháng nguyên trên 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam.
  13. 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira Đặc điểm sinh vật học: Xoắn khuẩn Leptospira có hình thể rất mảnh, đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm. Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấy vi khuẩn di động mạnh. Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana -Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu và 2 tiêm mao quanh bào chất để Leptospira có thể chui sâu vào mô vật chủ. Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ (15 - 30 vòng), sát nhau như một sợi chỉ lóng lánh bạc, di động nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như lò xo. Xoắn khuẩn có khả năng xuyên qua da và niêm mạc, nhất là da bị xây xước. Bắt màu Gram âm, ưa khí, mọc chậm ở các môi trường nuôi cấy, pH thích hợp 7,2-7,5; không thể phát triển trong điều kiện axít; nhiệt độ 28-300C (nhưng cũng có thể nuôi cấy ở nhiệt độ tối đa là 390C và nhiệt độ tối thiểu là 13 - 150C) (http://toquoc.vn/thu-y/benh-xoan-khuan-o-gia-suc-206301.html) Hình 1. Xoắn khuẩn Leptospira interrogans (http://benh.vn/truyen-Nhiem/Benh-do-xoan-khuan- Leptospira/35/4081/12-11-2013.htm)
  14. 5 Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu hoặc các môi trường thông thường, nếu không bổ sung 5 - 10% huyết thanh thỏ, xoắn khuẩn không mọc được. Ngoài ra, giống như các loài vi khuẩn khác, xoắn khuẩn cũng cần sắt để phát triển. Hiện nay có nhiều loại môi trường bổ sung albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin - BSA) dùng để nuôi cấy, phân lập xoắn khuẩn, ví dụ môi trường thạch bán cố thể (0,1 - 0,2 thạch) có BSA + Tween 80 (môi trường EMJH - Ellinghausen McCullough - Johnson - Harris) hoặc môi trường có BSA + hỗn hợp Tween 80 và Tween 40. Để hạn chế tạp nhiễm cho thêm vào môi trường các chất như 5 - fluorouracil, fosfomycin hoặc hỗn hợp gồm rifamycin, polymycin, neomycin, 5 - fluorouracil, bacitracin và actidione; tuy nhiên các loại môi trường này có thể gây khó khăn trong việc phân lập xoắn khuẩn nếu số lượng xoắn khuẩn ít hoặc một số chủng xoắn khuẩn không mọc được trong môi trường có nhiều kháng sinh. Có thể quan sát rõ các chủng xoắn khuẩn gây bệnh mọc sau khi nuôi cấy 5 - 7 ngày; trong khi đó các loài sống hoại sinh có thể mọc trong vòng 2 - 3 ngày. Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào thời gian mọc khác nhau của các serovar Leptospira, ví dụ L. interrogans serovar Pomona và L. interrogans serovar Grippotyphosa cho kết quả sau 7 - 10 ngày nuôi cấy nhưng các chủng khác như L. interrogans serovar Hardjo và L. interrogans serovar Bratislava có thể lâu hơn, lâu nhất sau 26 tuần. Xoắn khuẩn Leptospira có sức đề kháng yếu nhưng còn cao hơn so với các loại xoắn khuẩn khác, bị diệt ở nhiệt độ 500C/10 phút. Ánh sáng và các thuốc khử trùng thông thường như phenol, nước javen dễ diệt được Leptospira. Tuy vậy, xoắn khuẩn Leptospira chịu được lạnh và sống được lâu ở nước tới 3 tuần; sống dai dẳng trong bùn lầy, nước đọng với pH bazơ (pH=7,7), tốt nhất là nước cống, rãnh, ruộng đồng, khe suối. ( http://vinafeed.com.vn/vn/benh-xoan-khuan-o-gia-suc.html)
  15. 6 Về phân loại thì xoắn khuẩn Leptospira thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira. Người ta phân ra thành các loài gây bệnh, loài không gây bệnh và loài trung gian. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 23 nhóm, bao gồm 230 typ huyết thanh; mỗi typ huyết thanh có các kháng nguyên đặc hiệu. Một typ huyết thanh có thể gây nhiều bệnh cảnh khác nhau. Ngược lại, một bệnh cảnh lâm sàng có thể do bất kỳ typ nào trong nhóm gây bệnh tạo nên. Các typ huyết thanh có nhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo, gây khó khăn cho chẩn đoán. Có ít nhất 5 typ huyết thanh có tầm quan trọng tại Mỹ và Canada, tất cả đều gây bệnh ở chó (với các thuật ngữ Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Grippotyphosa và Bratislava). Ở Việt Nam thường gặp 12 typ huyết thanh sau: L. interrogans serovar Australis, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Autumnalis, L. interrogans serovar Grippotyphosa, L. interrogans serovar Bataviae, L. interrogans serovar Hebdomalis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar Ponoma, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Saxkoebing 6, L. interrogans serovar Poi, L. interrogans serovar Sejroe.Trong đó, 6 typ gây bệnh đang sử dụng làm vắc xin vô hoạt ở Việt Nam là: L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa. (http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240) 1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, được phát hiện đầu tiên vào năm 1850 trên chó tại Stuttgart (Đức). Khi đó, bệnh được gọi là bệnh
  16. 7 vàng da truyền nhiễm. Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tả dấu hiệu lâm sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất hiện đột ngột kèm theo lách to, vàng da và viêm thận. Đến đầu thế kỷ 20, những thuật ngữ được sử dụng để mô tả bệnh Leptospirosis bao gồm sốt xuất huyết Java, sốt bảy ngày, sốt mùa thu, bệnh Akiyama và sốt đầm lầy [9]. Năm 1915, Inada và cộng sự đã xác định Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae là tác nhân gây bệnh Weil ở Nhật Bản [32] và cũng được Hiibener và Reiter xác nhận tại Đức [31]. Inada và cộng sự (1918) đã phát hiện serovar L. interrogans serovar Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản [33]. Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm thấy hàng loạt các serovars khác nhau của Leptospira như L. interrogans serovar Pyrogenes (1923), L. interrogans serovar Bataviae (1926), L. interrogans serovar Grippotyphosa (1928) [12]. Đến nay, người ta đã phát hiện ra hơn 230 serovars khác nhau của Leptospira interrogans ở khắp nơi trên thế giới [60]. Bệnh Leptospirosis lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật mắc bệnh. Các triệu chứng thường gặp của bệnh Leptospirosis là cơ bắp chân đau, sốt cao đột ngột, rét run, sốt liên tục hoặc kèm theo mạch nhanh, huyết áp dao động, mệt nhiều, đau đầu, nhức mắt, buồn nôn và nôn, trường hợp nặng có biểu hiện li bì, vật vã, mê sảng. Sau khi qua da và niêm mạc, xoắn khuẩn Leptospira vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết, giai đoạn khởi phát này kéo dài khoảng 5-7 ngày. Sau đó, xoắn khuẩn khu trú và gây bệnh ở gan, thận, màng não, tim, phổi, thượng thận. Bệnh nhân có triệu chứng vàng da do độc tố xoắn khuẩn hủy diệt hồng cầu và gây viêm tổ chức trung diệp ở gan. Gan to ra, xung huyết, xuất huyết vi thể, các bè gan đảo lộn, có thể có ổ hoại tử và xuất huyết rải rác (có thể nhầm lẫn áp xe gan). Xoắn khuẩn cũng gây tổn thương ống thận, dẫn đến thiểu niệu và vô niệu, tăng urê và creatinin máu - nguyên nhân chính làm bệnh nhân tử vong. Thận bệnh nhân to ra, đôi khi có xuất huyết, các tế bào
  17. 8 phình lên và hoại tử, gây bít tắc, khe thận bị phù và xâm nhiễm tế bào đơn nhân (dễ bị chẩn đoán nhầm với viêm gan virus, sốt xuất huyết dengue hoặc nhiễm khuẩn huyết). Leptospira trong giai đoạn hoại huyết có thể đến cơ quan sinh dục gây rối loạn sinh sản.Về mức độ nguy hiểm của nhiễm xoắn khuẩn Leptospira, tuy ít ảnh hưởng trực tiếp đến tính mạng của người bệnh, song gây ra các tổn thương ở nhiều cơ quan, trong đó đáng chú ý đến triệu chứng hoại tử cơ, hoại tử ống thận cấp có thể gây suy thận cấp, tổn thương các mô, gan, viêm và xuất huyết khu trú ở tim, phổi; gây tổn thương (không nguy hiểm lắm) ở não và màng não. Đặc biệt trên cơ địa phụ nữ mang thai thì khi nhiễm xoắn khuẩn Leptospira có thể gây ra sẩy thai [4]. Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có ở mọi nơi trên thế giới, nhiều nhất ở Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước vùng nhiệt đới [8], [9], [62]. Một số gia súc nhiễm Leptospira nhưng không thể hiện triệu chứng lâm sàng và đây là nguồn truyền lây mầm bệnh. Một số loài gặm nhấm như chuột là loài vật trung gian mang trùng nguy hiểm nhất [40]. Mặc dù, các loài chuột là vật chủ chính quan trọng nhưng cũng có nhiều loại động vật có vú khác bao gồm chó, hươu, nai, thỏ, nhím, bò, cừu, gấu trúc, thú có túi, chồn và một số động vật có vú ở biển có thể mang và truyền bệnh như là vật chủ phụ. Ở châu Phi, mèo Banded Mongooses đã được xác định là ổ chứa mang mầm bệnh, ngoài ra còn có một số vật chủ hoang dã khác ở châu Phi cũng có khả năng mang mầm bệnh. Chó có thể liếm nước tiểu của động vật bị nhiễm bệnh thải ra cỏ hoặc đất hoặc uống nước bị nhiễm bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng loài “chó nhà” nhiễm Leptospirosis do thói quen liếm nước tiểu của chuột bị nhiễm bệnh đi vào nhà. Tuy không lây lan mạnh và làm chết nhiều chó như dịch Carre, Parvo, nhưng nếu mắc nhiễm sẽ bị viêm gan, báng bụng, vàng da,
  18. 9 rối loạn toàn thân và tử vong. Nguy cơ lây bệnh Leptospirosis cho người rất cao qua tiếp xúc với nước tiểu từ những con vật bị bệnh [61]. Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis hàng năm là khác nhau từ 0,02/100.000 dân ở các quốc gia vùng khí hậu ôn đới và 100/100.000 dân ở vùng khí hậu nhiệt đới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm trên thế giới có từ 7 đến 10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da. Do tính đa dạng của các triệu chứng, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một số vùng có thể lên đến 20%-25% [44]. Ở các nước đang phát triển, những người mắc bệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo ở các thành phố. Ở các nước phát triển, những người thường phải làm việc ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm thấp thường có nguy cơ nhiễm bệnh [7]. Người mắc bệnh ngẫu nhiên chứ không phải là nguồn bệnh. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng, có sự lây truyền từ người sang người do thải xoắn khuẩn qua đường nước tiểu của người bệnh hoặc lây qua đường tiêu hóa: qua thức ăn, nước uống không đun sôi, nấu chín, bị ô nhiễm. Cá biệt, bệnh có thể lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nước nhiễm khuẩn ở dạng khí dung. Xoắn khuẩn Leptospira rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm, như động vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia đình, đồng thời xoắn khuẩn Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường tự nhiên. Hơn nữa, bệnh này càng khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp phát triển (do có đàn gia súc đông) và tình trạng vệ sinh môi trường kém (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển) [65]. Bệnh xoắn khuẩn có thể lây sang người qua tiếp xúc với thú bệnh khi da, niêm mạc bị trầy xướt hay da nguyên lành nhưng bị ngâm nước lâu làm giãn nở các lỗ chân lông, xoắn khuẩn có thể chui qua da và gây bệnh. Sự truyền lây còn xảy ra do sự vấy nhiễm của động vật nhiễm bệnh với các nguồn nước, thực phẩm hay ngay cả chỗ nằm ô nhiễm, chó tiếp xúc với môi trường bị vấy nhiễm này cũng lây bệnh. Nước tù đọng hay chảy chậm là môi trường sống thích hợp cho xoắn khuẩn Leptospira tồn tại lâu.
  19. 10 Có thể chẩn đoán bệnh bằng cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn hoặc tìm DNA của vi khuẩn trong máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mang mầm bệnh [35]. Chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp phổ biến được sử dụng để chẩn đoán bệnh do xoắn khuẩn gây ra. Các phương pháp chẩn đoán khác như sử dụng kính hiển vi tụ quang nền đen, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, PCR, phương pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi thể cũng được sử dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR dùng để phát hiện chuỗi DNA của Leptospira chỉ thực hiện ở các trung tâm lớn. Có nhiều cặp mồi (primer) khác nhau đã được thiết lập, trong đó một số đặc hiệu ở mức giống Leptospira nhưng một số loại đặc hiệu ở mức serovar. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis Các nỗ lực phòng bệnh bao gồm trang bị bảo vệ để không tiếp xúc với động vật có nguy cơ nhiễm bệnh, vệ sinh sạch sẽ sau khi tiếp xúc và tiêu diệt các loài gặm nhấm ở những khu dân cư [52]. Việc sử dụng kháng sinh để ngừa bệnh không đem lại hiệu quả rõ ràng [7]. Một số vắc xin dùng cho động vật để phòng vài loại xoắn khuẩn vàng da có thể làm giảm nguy cơ lây lan sang người. Từ lâu, các nhà khoa học đã mong muốn tìm được một loại vắc xin hiệu quả để ngăn ngừa bệnh do xoắn khuẩn Leptospira thông qua tiêm chủng cho người và động vật có nguy cơ lây nhiễm cao. Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu với chi phí hàng triệu đô la, các nhà khoa học đã tìm được một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis. Tuy nhiên cho đến nay, các loại vắc xin để phòng bệnh này vẫn còn hạn chế và chưa đạt hiệu quả cao trong ứng dụng lâm sàng [64]. Một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis như: vắc xin sống [41], [15], vắc xin lipopolysaccharide (LPS) [22], [54], vắc xin lipoprotein [16] [37], [58], vắc xin protein màng ngoài (OMPs), [25], [46] và vắc xin các yếu tố độc lực tiềm năng [55], [68]. Hiện nay, ở một số nước như Nhật Bản, Cuba và Trung Quốc đã có vắc xin phòng chống bệnh Leptospirosis cho người tuy nhiên chưa
  20. 11 được cấp phép sử dụng rộng rãi do cần phải tiếp tục nghiên cứu về độ an toàn của vắc xin này. Vắc xin áp dụng ở động vật chỉ có một vài chủng. Vắc xin protein tái tổ hợp là loại vắc xin có tiềm năng lớn trong phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira. Vắc xin protein tái tổ hợp được xây dựng với phương pháp công nghệ sinh học hiện đại [49], [58], [59] nhưng trong đó vắc xin OMPs tái tổ hợp, vắc xin lipoprotein và vắc xin các yếu tố độc lực tái tổ hợp được quan tâm hơn cả. Những đặc trưng bảo vệ của vắc xin tái tổ hợp đã được kiểm nghiệm, bao gồm: OmpL1, LipL41 [18], [29], hemolysis-associated protein 1 (Hap1) [14], và protein miễn dịch (Lig) [48]. Năm 1993, lần đầu tiên OmpL1 được báo cáo [27]. Sáu năm sau đó, nghiên cứu trên chuột mô hình đã chứng minh tác dụng gây miễn dịch của 2 loại vắc xin OmpL1 và LipL41 [29]. Vào năm 2002, LigA được mô tả như một globulin miễn dịch giống protein [48], sau đó các phản ứng miễn dịch của protein LigA, LigB cũng được xác nhận [37], [49], [59]. Hơn nữa, gen Lig đã được chứng minh là hữu ích trong việc phát hiện bệnh xoắn khuẩn [47]. Một số protein ngoài màng khác như LAg42, Loa22 [36], Lk73.5 [10] cũng được công nhận là nguyên liệu trong việc tạo vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira, tuy nhiên chúng vẫn chưa được tiến hành thử nghiệm trong các mô hình động vật để phát triển thành vắc xin. Lipoprotein là protein quan trọng trong Leptospira, những protein có nhiều ở màng ngoài và chúng được gắn thông qua các axit béo. Mặc dù khó khăn trong việc sản xuất lipoprotein do hệ thống biểu hiện dị hợp, nhưng một số loại lipoprotein như LipL41 [26], LipL32 [28], LipL45 [43] và LipL21 [17] đã được khẳng định là nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc tạo ra vắc xin lipoprotein tái tổ hợp. Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) cũng được dự đoán là một trong những gen tiềm năng, do khả năng sản xuất ra các yếu tố hoại tử khối u, interleukin-10 và CD69 [21]. Loại GPLs này xuất hiện trong cả chủng gây bệnh L. interrogans hoặc chủng không gây bệnh L. biflexa. Trong một vài công
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2