LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP "ẢNH HƯỞNG CỦA DIPTEREX LÊN CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:41

Thêm vào BST

Báo xấu

128
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của thí nghiệm nhằm tìm hiểu sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hoá của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi dưới sự tác động của thuốc trừ sâu Dipterex trong điều kiện thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần với mật độ 70 con/bể 500 L với các nồng độ: không có Dipterex, 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5pm. Các chỉ tiêu sinh hóa của cá được theo dõi là ChE, CAT, GST và LPO ở cơ, mang, gan và não tại các thời điểm 0 giờ, 6 giờ,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP "ẢNH HƯỞNG CỦA DIPTEREX LÊN CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN  NGUYỄN THỊ CÀ SUM ẢNH HƯỞNG CỦA DIPTEREX LÊN CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN  NGUYỄN THỊ CÀ SUM ẢNH HƯỞNG CỦA DIPTEREX LÊN CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG Ts. HUỲNH THỊ TÚ 2009
LỜI CẢM TẠ  Em xin chân thành cảm ơn thầy PGs.Ts Nguyễn Thanh Phương, trưởng khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ và cô Ts Huỳnh Thị Tú đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài này. Xin chân cảm ơn cô Ts Đỗ Thị Thanh Hương, trưởng bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ, chị Hà và chị Thùy cùng với các thầy cô và các anh chị trong bộ môn DD & CBTS đã tận tình dìu dắt, động viên và chỉ dạy cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian qua để thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn các quý Thầy, Cô đã dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. Xin chân thành cảm ơn các bạn trong tập thể lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 và tất cả các bạn bè xung quanh đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này. Nguyễn Thị Cà Sum
TÓM TẮT Mục đích của thí nghiệm nhằm tìm hiểu sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hoá của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi dưới sự tác động của thuốc trừ sâu Dipterex trong điều kiện thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần với mật độ 70 con/bể 500 L với các nồng độ: không có Dipterex, 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5pm. Các chỉ tiêu sinh hóa của cá được theo dõi là ChE, CAT, GST và LPO ở cơ, mang, gan và não tại các thời điểm 0 giờ, 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày. Kết quả cho thấy sau khi cho cá tiếp xúc với Dipterex đã làm biến động họat tính cả 4 lọai men ChE, CAT, GST và LPO ở cơ, mang, gan và não của cá tra giai đọan con giống. Dipterex tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE có ý nghĩa thống kê ở mang và gan ở tất cả các nghiệm thức ở các thời điểm thu mẫu 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 và không thấy có hiện tượng hồi phục sau 56 ngày. Dipterex cũng làm giảm có ý nghĩa thống kê họat tính GST ở mang và gan, CAT ở não và mang và làm tăng LPO ở gan, mang, não của cá. Khi cá tiếp xúc với Dipterex men ChE ở cá bị ức chế một cách đáng kể, điều này có thể dẫn đến các hiện tượng ức chế các hoạt động sinh học khác trong cơ thể cá.
MỤC LỤC Chương I. Đặt vấn đề ................................................................................... 1 Chương II. Lược khảo tài liệu ..................................................................... 3 2.1. Đặc điểm sinh học của cá Tra......................................................... 3 2.1.1. Phân loại.................................................................................. 3 2.1.2. Một vài đặc điểm sinh học cá Tra............................................. 3 2.1.3. Hình thái.................................................................................. 3 2.2. Một số chỉ tiêu sinh hóa và các tác nhân gây nên sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh hóa ..................................................................... 4 2.3. Sơ lược về Dipterex ....................................................................... 6 2.3.1. Đại cương về Dipterex ............................................................. 6 2.3.2. Một vài tính chất của Dipterex ................................................. 6 2.3.3. Ứng dụng của Dipterex ............................................................ 7 Chương III. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...................................... 8 3.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................ 8 3.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................ 8 3.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................. 8 3.2.2. Phương pháp pha hóa chất ....................................................... 9 3.2.3. Thời gian thu mẫu.................................................................. 10 3.2.4. Phương pháp thu mẫu ............................................................ 10 3.2.5. Phương pháp phân tích mẫu ................................................... 10 Chương IV. Kết quả và thảo luận.............................................................. 16 4.1. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Acetylcholinesterase (AChE) trong não, mang, ga, cơ của cá Tra giống ....................... 16 4.2. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Lipid peroxidation (LPO) trong não, mang, ga, cơ của cá Tra giống .................................... 19
4.3. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Glutathione-S- Stransferase (GST) trong mang, gan của cá Tra giống................. 21 4.4. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Catalase (CAT) trong não, mang của cá Tra giống......................................................... 22 Chương V. Kết luận và đề xuất ................................................................. 25 5.1. Kết luận ....................................................................................... 25 5.2. Đề xuất......................................................................................... 25 Tài liệu tham khảo ............................................................................. 26 Phụ lục................................................................................................ 29
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Dipterex(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) .... 6 Hình 2.2. Công thức cấu tạo của DDVP (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) ...... 7 Hình 3.3. Dipterx dùng trong thí nghiệm ........................................................ 8 Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong mang ở cá Tra qua các lần thu mẫu ................................................................................................... 16 Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong não gan ở cá Tra qua các lần thu mẫu.............................................................................................. 17 Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong não ở cá Tra qua các lần thu mẫu ................................................................................................... 18 Hình 4.4. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong cơ ở cá Tra qua các lần thu mẫu ................................................................................................... 19 Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong não ở cá Tra qua các lần thu mẫu .................................................................................................. 19 Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong mang, gan ở cá Tra qua các lần thu mẫu....................................................................................... 20 Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong gan ở cá Tra qua các lần thu mẫu .................................................................................................. 20 Hình 4.6. Biến đổi hoạt tính của GST trong mang của cá Tra qua các lần thu mẫu .................................................................................................. 21 Hình 4.6. Biến đổi hoạt tính của GST trong gan của cá Tra qua các lần thu mẫu .................................................................................................. 22 Hình 4.7. Biến đổi hoạt tính của CAT trong mang của cá Tra qua các lần thu mẫu ................................................................................................. 23 Hình 4.7. Biến đổi hoạt tính của CAT trong não của cá Tra qua các lần thu mẫu ................................................................................................. 24
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Thời gian phân hủy 50% của Dipterex theo pH và nhiệt độ (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) ............................................................. 7 Bảng 3.2. Tiến trình lập đường chuẩn MDA ................................................ 11 Bảng 3.3 Quy trình phân tích Enym GST...................................................... 12 Bảng 3.4 Quy trình phân tích Enzym Catalase ............................................... 13 Bảng 3.5. Quy trình phân tích enzym AChE ..................................................... Bảng 3.6. Quy trình phân tích Protein ........................................................... 17
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xuất phát từ sự hội tụ những điều kiện tự nhiên thuận lợi, đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) từ lâu không chỉ là vựa lúa lớn nhất của cả nước mà còn là khu vực có sản lượng Thủy Sản lớn. Trong những năm gần đây, do nhu cầu về thực phẩm trên thế giới tăng nhanh cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật nên các hoạt động Thủy Sản cũng phát triển rất nhanh. Hiện nay Thủy Sản đã trở thành một trong những nghành kinh tế mũi nhọn, góp phần quan trọng trong tổng thu nhập của cả nước. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi có giá trị xuất khẩu quan trọng nên phong trào nuôi cá Tra ngày càng phát triển nhanh chóng. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008) thì năm 2007 sản lượng cá Tra, Basa nuôi đã đạt được khoảng 1,2 triệu và kim ngạch xuất khẩu gần 1 tỉ USD. Vì sự phát triển nhanh về diện tích và gia tăng mật độ nuôi cá Tra (từ 20–30 con/m 2 lên đến 50-70 con/m2 đối với nuôi ao) đã góp phần làm gia tăng sản lượng, tăng thu nhập, góp phần cải thiện cuộc sống cho người dân. Tuy nhiên, nghề nuôi cá Tra hiện nay gặp không ít những khó khăn: tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cấm để trị bệnh cho cá Tra nuôi vẫn còn và rất khó kiểm soát, tình trạng môi trường bị ô nhiễm dẫn đến dịch bệnh xảy ra tràn lan, giá cả thị trường không ổn định…đã gây ảnh hưởng đến nghề nuôi cá Tra của nước ta hiện nay. Đa số người dân sử dụng thuốc và hóa chất chủ yếu là theo kinh nghiệm, ít theo sự hướng dẫn của các cán bộ khuyến ngư. Theo Nguyễn Chính (2005) thì có đến 59,5% người nuôi sử dụng thuốc theo kinh nghiệm và đặc biệt là không có người nuôi nào sử dụng hóa chất theo hướng dẫn của cán bộ thủy sản. Điều này cho thấy tâm lí chủ quan và sự thiếu hiểu biết của người dân về những ảnh hưởng của thuốc và hóa chất, đặc biệt là hóa chất độc hại đã bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản đến sức khỏe của cá nuôi, môi trường và người tiêu dùng. Dipterex hiện nay được dùng khá phổ biến trong các ao nuôi Cá (đặc biệt là ao nuôi cá Tra) để diệt nấm, giáp xác, giun sán rất hữu hiệu mà hiện nay chưa có một loại thuốc nào có thể thay thế được. Vì thế mà người dân vẫn còn sử dụng loại thuốc này để trị bệnh cho cá trong khi đã có quyết định của Bộ Trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn vê việc ban hành danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam năm 2005. Trong đó Dipterex là một trong những loại hóa chất thuộc danh mục thuốc Bảo Vệ Thực Vật cấm sử dụng. Trước khi có những khuyến cáo cũng như các quy định về việc sử dụng thuốc và hóa chất thì các nhà quản lý cần có những thông tin cơ bản về tính nghiêm trọng của việc sử dụng loại hóa chất này lên các ảnh hưởng đến sinh lý, sinh hóa của cá Tra nuôi. Tuy nhiên các nghiên cứu về ảnh hưởng của hóa chất này trên đối tượng Cá Tra còn ít. Do vậy mà đề tài “Ảnh hưởng của Dipterex lên một số chỉ tiêu sinh hóa trong cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống” trở nên rất thiết thực góp phần vào sự bền vững của nghề nuôi cá Tra 1
của nước ta hiện nay theo hướng bảo vệ môi trường, sản xuất ra các sản phẩm có chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm. Mục tiêu đề tài Xác định sự ảnh hưởng của Dipterex lên sức khỏe của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống thông qua sự thay đổi của một số chỉ tiêu sinh hóa trong cơ thể cá nhằm đánh giá mức độ độc hại của loại hóa chất này và ứng dụng trong quản lý sử dụng đúng loai hóa chất này. Nội dung đề tài: Xác định ảnh hưởng của Dipterex đến hoạt tính của một số chỉ tiêu sinh hóa: - Cholinesterase (ChE) - Lipid peroxidation (LPO) - Catalase (CAT) - Glutathion S-transferase (GST) 2
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học cá Tra 2.1.1 Phân loại Cá Tra là một loài trong số 11 loài thuộc họ cá Tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả Rainboth xếp cá Tra nằm trong giống cá Tra dầu (Pangasianodon). Phân loại cá Tra Bộ cá nheo: Siluriformes Họ cá Tra: Pangasiidae Giống cá Tra dầu: Pangasianodon Loài cá Tra: Pangasianodon hypophthalmus 2.1.2 Một vài đặc điểm sinh học cá Tra Cá Tra thuộc nhóm cá trắng (cá sông) sống trên dòng chính và các nhánh sông rạch lớn. Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều mùn bả hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao (Dương Nhựt Long, 2003). Cá tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá,…. Trong điều kiện nuôi cá có thể ăn thức ăn viên, các thức ăn có nguồn gốc động vật sẽ giúp cá lớn nhanh (Dương Nhựt Long, 2003). Cá Tra lớn nhanh trong ao nuôi, sau khoảng 6 tháng nuôi cá đạt trọng lượng 1–1,2 kg/con. 2.2. Một số chỉ tiêu sinh hóa và các tác nhân gây nên sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh hóa Cholinesterase (ChE) là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv., 1961). ChE rất cần thiết cho các chức năng bình thường của thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên. ChE phân bố nhiều ở mô thần kinh và cũng có ở các mô khác. ChE khi bị ức chế dẫn đến sự tích tụ của acetylcholine tại các synap (các khoảng trống giữa hai tế bào thần kinh), làm mất chức năng dẫn truyền của các xung thần kinh (Hart, 1993). Trong nghiên cứu độc học, ChE được sử dụng nhiều và có vai trò như chất đánh dấu sinh học. Lipid peroxidation (LPO) là chất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong cơ thể thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh. Trong quá trình hô hấp hiếu khí tế bào đã sản sinh ra các gốc oxy hoá (Reactive oxygen species – 3
ROS): superoxide anion (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl (-OH). ROS được tạo ra trong quá trình hô hấp hiếu khí này cần được phân huỷ và trung hoà để tránh gây tổn thương cho sinh vật và thành phần nhạy cảm nhất của tế bào đối với ROS là chuỗi acid béo chưa bão hoà trên màng tế bào. Hệ quả của quá trình này là LPO được tạo thành (điều kiện bình thường LPO vẫn được sinh ra). Đây là chất độc đối với tế bào. Tuy nhiên để chống lại ROS cơ thể sinh vật thích ứng bằng cách sử dụng các nhân tố chống oxy hoá bao gồm các chất không phải là enzyme (vitamine E, vitamin C, glutathione…) và enzyme Catalase (CAT) , Glutathione reductase, SOD) ( Zhang và ctv., 2004) Catalase (CAT) là một trong những enzyme chống oxy hoá phân bố tại các perixosome có vai trò quan trọng trong việc loại bỏ H2O2, chất được sinh ra trong quá trình - oxy hoá chuỗi acid béo dài CAT được nghiên cứu để đánh giá sự tác động của chất độc cũng như khả năng của cơ thể chống lại ROS do chất độc gây ra Glutathione – S transferase (GST) là enzyme có chức năng xúc tác phản ứng giữa các hợp chất có ái lực điện tử (thuốc trừ sâu, kim loại nặng) với GSH; các hợp chất lạ từ đó chuyển hoá thành N-acetyl cystine S dạng kết hợp sau đó sẽ được thải qua nước tiểu và phân (Yawad, 1989). Ngoài ra Storey (1996) cũng cho rằng GST có vai trò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng giữa GSH với các thành phần tổn thương của tế bào bị tấn công bởi ROS. Theo Zhang và ctv., (2004) enzyme này có liên quan đến việc giải độc đối với những chất ngoại sinh, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các mô từ sự tác động của ROS. Theo Guimaraes et al., 2006 ở nồng độ 0,25 ppm, sau 72 giờ gây nhiễm, Trichlorfon đã gây nên hiện tượng phù và sung huyết ở cá rô phi (Oreochromis niloticus) đồng thời làm tăng hoạt tính của ChE ở cơ của cá. Theo Nguyễn Ngọc Hiền (2007), nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ và Enrofloxacine lên một số chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thí nghiệm. Kết quả cho thấy, sau 171 giờ cho an kháng sinh Enroflloxacine đã làm biến động hoạt tính cả 4 loại men: ChE, CAT, GST, LPO khi khảo sát ở các cơ quan: mang, gan, não, cơ trong diều kiện thí nghiệm. Kháng sinh Enrofloxacine tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE. 24h sau khi ngừng cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của ChE có xu hướng chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau 171giờ. Trong khi đó kháng sinh Enrofloxacine làm tăng hoạt tính của các men: CAT, GST, LPO ở các cơ quan cơ, gan, mang của cá. Mật độ ương nuôi càng cao trong thời gian dài thì hoạt tính của các men GST, CAT, LPO ở các cơ quan gan, mang, cơ của cá càng tăng cao, ngược lại thì hoạt tính của ChE càng giảm. Hoạt tính của ChE, CAT, và LPO được tìm thấy cao nhất ở não và GST cao nhất ở gan. Theo Trần Văn Phú (2008) sau 171 giờ cho ăn kháng sinh Enrofloxacine đã làm biến động họat tính của cả 4 lọai men: ChE, CAT, GST và LPO khi khảo sát ở não, mang, gan và cơ của cá tra giai đọan con giống. 4
Kháng sinh Enrofloxacine có tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở tất cả các nghiệm thức. Sau khi ngừng cho ăn kháng sinh Enrofloxacine 24 giờ, thì họat tính ChE có xu hướng giảm chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau 171 giờ. Trong khi đó kháng sinh Enrofloxacine làm tăng họat tính GST, CAT và LPO ở các cơ quan cơ, mang và gan của cá. Hồ Thị Thanh Tuyến (2008), ảnh hưởng của mật độ và kháng sinh Enrofloxacin đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao. Kết quả thí nghiệm cho thấy mật độ nuôi đã làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra, thời gian nuôi với mật độ cao càng dài thì hoạt tính của ChE ở tất cả các cơ quan càng giảm và hoạt tính của CAT (trừ ở não) , GST, LPO càng tăng cao. Và kháng sinh Enrofloxacin cũng tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở cả hai mật độ nuôi. Một ngày sau khi cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của ChE có xu hướng giảm và phục hồi trở lại sau 7 ngày. Kháng sinh Enrofloxacin cũng làm tăng hoạt tính CAT và hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 3 ngày ở gan, não và sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày ở mang trong ao nuôi có mật độ thấp. Ở ao nuôi mật độ cao, hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày. Kháng sinh Enrofloxacin làm tăng hoạt tính GST, LPO và hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày ở các ao có mật nuôi khác nhau. Theo Nguyễn Đăng Khoa (2006), nghiên cứu ảnh hưởng của Endosulfan lên một số chỉ tiêu sinh hóa trong Tôm sú (Penaeus monodon). Ông cho rằng: Ở Tôm sú giống nhỏ, Endosulfan tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở nghiệm thức 0,1µg/L (43%) và 1µg/L (51%) và ChE phục hồi tốt sau 7 ngày tiếp xúc với Endosulfan. Và endosulfan không làm biến đổi hàm lượng LPO trên tôm giống nhưng gây ra những biến đổi GST và CAT theo hướng khác so với bình thường. Còn ở Tôm sú lớn, ông cũng cho rằng Endosulfan cũng làm giảm hoạt tính của ChE trên mang nhưng không làm gia tăng LPO ở cả hai cơ quan mang và gan tụy ở các nồng độ thí nghiệm. Endosulfan cũng gây ra những biến đổi GST và CAT ở mang và gan tụy theo hướng khác so với bình thường. Nguyễn Văn Công và ctv (2006), khi nghiên cứu ảnh hưởng của Diazon lên hoạt tính của enzym cholinesterase và tăng trọng của cá Lóc (Chana striata). thấy rằng Diazon làm giảm đáng kể hoạt tính ChE ở nồng độ 0,016mg/l, tốc độ tăng trưởng bị ức chế ở nồng độ cao nhất (0,35mg/l). Điều này cho thấy hoạt tính ChE có thể làm chất chỉ thị để phát hiện ra sinh vật bị ảnh hưởng của chất độc Diazon. Theo Nguyễn văn Công và ctv (2006), nghiên cứ ảnh hưởng của nhiệt độ và oxy hòa tan lên độc tính của Basudin 50EC ở cá Lóc (Chana striata). Kết quả cho thấy trong điều kiện bình thường thì hoạt tính của ChE tập trung nhiều nhất là ở não, kế đến là thịt, thấp nhất là ở gan. Hoạt tính này không chịu ảnh hưởng bởi khảng DO và nhiệt độ trong thí nghiệm. Và Ông cho rằng nhiệt độlà yếu tố ảnh hưởng đến độc tính của Basudin 50EC, khi nhiệt độ tăng thì 5
làm tăng mức độ ức chế AchE trong não và trong thịt nhưng trong gan không thể hiện rõ. Theo Nguyễn Thị Em (2008), nghiên cứu sự ảnh hưởng của các độ mặn khác nhau lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và sinh trưởng của Tôm Càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở độ mặn 15 và 25% thì hoạt tính của enzym ChE ở cơ và mang của Tôm Càng Xanh đều giảm sau 6 giờ và phục hồi sau 24 giờ, ở gan tụy hoạt tính của ChE giảm so với đối chứng và không có khả năng phục hồi sau 7 ngày. Hoạt tính của CAT ở mang và gan tụy ở cả 2 độ mặn 15 và 25% đều tăng cao so với đối chứng (trong đó CAT ở mang tăng cao hơn gan tụy). Ở nghiệm thức 15% hoạt tính của LPO ở mang có khuynh hướng giảm và tăng ở gan tụy tuy nhiên ở độ mặn 25% thì hoạt tính của LPO ở cả mang và gan tụy đều có xu hướng tăng so với đối chứng. Còn đối với hoạt tính của GST sau 6 – 24 giờ ở mang giảm và tăng cao sau 3-7 ngày. 2.3. Sơ lược về Dippterex 2.3.1. Đại cương về Dipterex - Công thức hóa học của Dipterex là C4H8O4Cl3P. - Công thức cấu tạo: Dimethyl (2,2,2-trichloro-hydroxyethyl)phosphonate - Khối lượng phân tử: 257,45 - Tên khoa học: dimethyl–(2,2,2-tricholoro-1-hydroxyethyl) phosphonate. - Tên thường dùng: Trichlorfon - Tên thương phẩm: Dylox (Mỹ), triclophon, Tuzon, Neguvon, hay chlophos (Liên Xô) Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Dipterex(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 2.3.2. Một vài tính chất của Dipterex Là chất rắn, kết tinh màu trắng, mùi dễ chịu, nóng chảy ở 83–84 oC. Hòa tan được trong alcol, benzen và đa số hydrocacbon chlor hóa khác. Dipterex bền ở nhiệt độ phòng, mang tính axit, ở pH=5,5 thì Dipterex chuyển hóa chậm thành dimetyl diclovinyl photphat (DDVP). 6
Bảng 2.1:Thời gian phân hủy 50% của Dipterex theo pH và nhiệt độ (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) Khoảng pH 1–5 Nhiệt độ 70oC Nhiệt độ Thời gian phân hủy pH Thời gian phân hủy (oC) (ngày) (giờ) 10 2.400 1 32 20 526 2 34 30 140 3 33 40 41 4 26,6 50 10,7 5 15,3 60 3,2 6 3,0 70 1,13 8 0,6 Hình 2.2. Công thức cấu tạo của DDVP (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 2.3.3 Ứng dụng Dipterex Trong ngành vệ sinh y tế thì Dipterex dùng diệt ruồi và côn trùng nên hạn chế nhiều bệnh tật nguy hiểm. Trong thú y thì Dipterex dùng vệ sinh chuồng trại, diệt kí sinh trùng bên ngoài và bên trong. Trong thủy sản thì Dipterex dùng trị một số bệnh phổ biến do giun sán, rận cá, giáp xác, nấm kí sinh…(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 7
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu: Cá Tra giống thí nghiệm được mua từ các các trại giống ở Cần Thơ, có khối lượng trung bình từ (17,9 ± 4,1g), màu sắc của cá tươi sáng, đồng cỡ, không bị dị tật và không có dấu hiệu bệnh lý. Hóa chất thí nghiệm: Dipterex sử dụng có tên thương mại là ĐỊCH BÁCH TRÙNG 90SP chứa 90% hoạt chất Trichlorfon (Hình 3.3), dạng chất rắn và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. Thuốc được khuyến cáo sử dụng trị sâu bệnh cho các loại cây trồng như bọ trĩ, bọ xít, sâu khoang trên lúa, vải thiều, đậu tương với nồng độ từ 1,0 đến 1,2 kg/ha. Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn công nghiệp Cargill có hàm lượng đạm 30 %, mỗi ngày cho cá ăn 2 lần, khẩu phần ăn từ 5-7 % khối lượng thân. Bể xi măng 1000 lít (3 bể), bể composit hình chữ nhật 500 lít, máy so màu quang phổ, watter bath, máy li tâm, kính hiển vi, pipet, tủ trữ đông mẫu (- 80oC) Nguồn nước dùng thí nghiệm là nguồn nước máy. Các hoá chất, dụng cụ và phương tiện sử dụng trong phòng thí nghiệm Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thuỷ Sản – Khoa Thuỷ Sản - Trường Đại học Cần Thơ. Hình 3.3. Dipterx dùng trong thí nghiệm 3.2. Phương pháp nghiên cứu: 3.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức khác nhau và mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Cá được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ thống bể 8
composite có thể tích là 500 lít với mật độ là 70 con/bể. Hệ thống bể được sục khí liên tục. Cá được bố trí với các nghiệm thức sau : Nghiệm thức 1 : Bể không có Dipterex ( đối chứng). Nghiệm thức 2 : Bể có Dipterex 0,01ppm Nghiệm thức 3 : Bể có Dipterex 0,1ppm Nghiệm thức 4 : Bể có Dipterex 0,5ppm 3.2.2. Phương pháp pha hóa chất : Từ hóa chất ĐỊCH BÁCH TRÙNG 90SP thương mại chứa 90% hoạt chất Trichlorfon pha thành dung dịch mẹ có nồng độ 10.000ppm. Từ dung dịch gốc pha thành các nồng độ 0,01pp, 0,1ppm, 0,5ppm theo công thức : C1V1= C2V2 Trong đó : C1 : là nồng độ của dung dịch gốc V1 : Thể tích dung dịch gốc dùng để pha. C2 : Nồng độ dung dịch cần pha (0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm) V2 : Thể tích cần pha. 3.2.3. Thời gian thu mẫu : Mẫu được thu vào 5 thời điểm Lần thu mẫu 1: Trước khi cho hóa chất vào bể 0 giờ Lần thu mẫu 2: Khi cho hóa chất vào bể sau 6 giờ Lần thu mẫu 3: Khi cho hóa chất vào bể sau 96 giờ Lần thu mẫu 4: Khi cho hóa chất vào bể sau 14 ngày Lần thu mẫu 5: Khi cho hóa chất vào bể sau 56 ngày 3.2.4. Phương pháp thu mẫu Cá được thu ngẫu nhiên 5 con/bể, riêng lần thu thứ nhất chỉ thu 1con/bể. Cá sau khi thu được cân trọng lượng và đo chiều dài. Mẫu dùng để phân tích các chỉ tiêu sinh hóa bao gồm : não, mang, gan, cơ được thu vào ống ependoff , quá trình thu mẫu được thực hiện trong điều kiện lạnh và mẫu được cố định bằng cách nhúng vào Nitơ lỏng. Sau khi thu xong thì toàn bộ mẫu được trữ lạnh ở -800C cho đến khi mẫu được phân tích. 9
3.2.5. Phương pháp phân tích mẫu: 3.2.5.1. Phương pháp nghiền mẫu: Tất cả các mẫu não, mang, gan, cơ đều được nghiền trong dung dịch buffer KH2 PO4/K2HPO4 50mM. Quy trình nghiền mẫu: Mẫu não, gan, mang, cơ, giải đông và được trữ trong nước đá Cân mẫu từ 0,1-0,3g cho vào ống nghiền bằng nhựa Cho 3ml KH2 PO4/K2HPO4 50mM (pH = 7,5) Cân mẫu (mẫu và buffer) Sau khi nghiền đem mẫu chia làm 2 phần:  1 phần được cho vào trong ống ependoff để phân tích LPO sau đo đem trữ ở -800C cho đến khi phân tích  1 phần đem ly tâm 10000 vòng/10 phút (40C) lấy phần nước trong nổi ở trên cho vào ống ependoff để phân tích các chỉ tiêu ChE, CAT, GST đem trữ ở -800C cho đến khi phân tích. 3.2.5.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hóa: a) Lipid peroxidation (LPO): Nguyên lý: Phân tích LOOHs như là một phương pháp xác định phản ứng LPO. Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS) được áp dụng phổ biến nhất. TBARS phản ứng với MDA, sản phẩm được xác định thông qua máy so màu quang phổ ở bước sóng 535 nm (Fatima và ctv, 2000). Chuẩn bị đường chuẩn với nồng độ MDA tăng dần. Trị số đọc được trên máy so màu quang phổ cho phép tính LPO (µmol MDA/g mẫu).  Chuẩn bị hóa chất: Trichloroacetic acid 5% (TCA 5%): 5g TCA/100ml H2O, giữ lạnh và sử dụng trong ngày. Thiobabituric acid 0,67% (TBA 0,67%): 67mg TBA/1ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), trộn đều, sau đó thêm 9ml H2O, bảo quản tốt, tránh ánh sáng (che tối bằng giấy bạc). 10
 Quy trình bao gồm: Sử dụng 500µL mẫu nghiền với 0,5ml trichloroacetic (TCA) 5% và 0,5ml thiobarbituric acid (TBA) 0,67% . Ủ hỗn hợp 15 phút . Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, lấy phần nổi. Cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 15 phút. Lấy ống thuỷ tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ ở 535 nm. Bảng 3.2. Tiến trình lập đường chuẩn MDA Nồng độ MDA Thể tích pha loãng Dung dịch chuẩn 500 1 100 1ml dung dịch chuẩn + 4ml nước 2 50 2ml dung dịch 1 + 2ml nước 3 10 1ml dung dịch 2 + 4ml nước 4 5 2ml dung dịch 3 + 2ml nước 5 2,5 2ml dung dịch 4 + 2ml nước 6 1,25 2ml dung dịch 5 + 2ml nước 7 0,625 2ml dung dịch 6 + 2ml nước 8 0 Nước Nồng độ MDA (µM) 0 0,625 1,25 2,5 5 10 50 100 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Thêm vào 1ml TBA 0,67% Ủ trong nước sôi khoảng 10 phút Đọc ở bước sóng 535 nm Đường chuẩn với giá trị MDA cho phép xác định được LPO thể hiện qua µmol MDA tương đương/g mẫu b) Glutathione S-transferase (GST) Nguyên lý : phản ứng mang tính kiềm của sự kết hợp của GSH với 1 – chloro- 2,-dinitrobenzene (CDNB) thông qua hoạt động của GST.  Chuẩn bị hóa chất: - 1-chloro-2,4-diitrobenzen (CDNB)50mM: 50,5mg/5ml ethanol, giữ trong tủ mát. - GSH 50mM: 76,83mg/5ml dung dịch Hepes, pH= 7,5. 11
- Dung dịch đệm phosphat pH=7,5 Bảng 3.3. Quy trình phân tích Enzym GST Hóa chất Test (µl) Blank (µl) Đệm Hepes pH 7,5 700 700 CDNB (trong ethanol) 1,5mM 30 30 GSH 30 30 H2O 220 240 Mẫu 20 / Đo ở bước sóng 340 nm trong 3 phút Công thức tính : Hoạt tính của GST = ( A340/phút – Ablank) x độ pha loãng x coff.ExMol CDNBcoeff = 9,6mM-1 cm-1 là hệ số CDBN chuyển thành CDBN-GST + HCl dưới tác dụng của GST. Đơn vị của GST là nmol/mg protein/phút c) Catalase (CAT) Nguyên lý: Phương pháp thông thường xác định CAT dựa trên sự thay đổi của dung dịch đo ở bước sóng 240nm. Phương pháp yêu cầu trong đo quang phổ phải sử dụng curvet thạch anh để tránh sự nhiễu. Titanium oxisulfate (TiOSO4) phản ứng với H2O2 mà không bị khử bởi catalase sau 6 phút.  Chuẩn bị hóa chất: - Dung dịch BC: gồm 1g Albumine bovine (BSA, Sigma); 100ml Imidazol buffer 0,02 M pH 7,0. - Sau đó, cho 50µl H2O2 30% vào 250ml BC để tạo thành dung dịch SC - Chuẩn bị dung dịch TiOSO4 : 1,7g TiOSO4 pha loãng trong 500ml H2SO4 2N. Đun sôi trong 10 phút và để nguội dung dịch đến ngày hôm sau. Pha loãng 1,5 lần với H2SO4 2N - Tiếp đến, thêm 0,75 ml TiOSO4 vào 1,25 ml SC và đọc ở bước sóng 420nm. Độ hấp thụ phải nằm trong khoảng 0,75 và 0,95 và là độ hấp thụ cao nhất (H2O2 không bị khử bởi catalase) nếu không thay đổi thể tích H2O2. 12